Summary

Yüksek Çözünürlüklü X-Işını Absorpsiyon Spektroskopisi Kullanılarak Kriyojenik Sıcaklıkta Türleşme için Biyolojik Numunelerin Hazırlanması

Published: May 27, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, senkrotron tabanlı X-ışını absorpsiyon spektroskopisi deneyleri için biyolojik kriyoörnekler hazırlamak için ayrıntılı bir prosedür sunar. Numune hazırlama ve kriyoprezervasyonu optimize etmek için gereken tüm adımları, kanser ve fitoplankton hücreleri ile protokol örnekleri ile açıklıyoruz. Bu yöntem, evrensel bir numune kriyo-hazırlama standardı sağlar.

Abstract

X-ışını absorpsiyon spektroskopisi (XAS) ile elementlerin incelenmesi, metallerin biyolojik sistemlerdeki rolünü incelerken özellikle ilgi çekicidir. Numune hazırlama, özellikle biyolojik numuneler için önemli ve genellikle karmaşık bir prosedürdür. X-ışını türleştirme teknikleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, tekniğin kullanıcıları için henüz ayrıntılı bir protokol yayılmamıştır. Ayrıca, kimyasal durum modifikasyonu endişe vericidir ve hücrelerin veya dokuların kimyasal bütünlüğünün maksimum korunmasını sağlamak için biyolojik numuneleri neredeyse doğal hidratlanmış hallerinde analiz etmek için kriyo bazlı teknikler önerilir. Burada, kriyo-korunmuş örneklere dayanan bir hücresel hazırlama protokolü öneriyoruz. Kanser hücrelerinde selenyumun yüksek enerji çözünürlüklü floresan saptanan X-ışını absorpsiyon spektroskopisi çalışmasında ve fitoplanktonda demirin incelenmesinde gösterilmiştir. Bu protokol, diğer biyolojik örnekler ve ışınlama ile zarar görebilecek diğer X-ışını teknikleri ile birlikte kullanılabilir.

Introduction

Esansiyel veya toksik elementlerin hücresel biyotransformasyonlarının incelenmesi, yüksek hassasiyetli türleşme teknikleri gerektirir ve genellikle kimyasal türlerin modifikasyonuna eğilimli numune hazırlama adımlarını en aza indirmelidir.

Selenyum ve demir gibi fizyolojik elementlerin, karmaşık kimyaları, selenyum veya demir türlerinin çeşitli stabiliteleri ve ppm (mg / kg) veya hatta sub-ppm aralığındaki düşük konsantrasyonları nedeniyle türleşmesinin özellikle zor olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, bu elementlerin XAS tarafından türleşmesinin incelenmesi son derece zor olabilir. Senkrotron XAS ve özellikle çok düşük bir sinyal-arka plan oranı1’e izin veren yüksek enerji çözünürlüklü floresan algılanan XAS (HERFD-XAS), karmaşık biyolojik matrislerde yüksek oranda seyreltilmiş elementleri türleştirmek için senkrotron kaynaklarında mevcuttur 2,3. Geleneksel floresan-XAS ölçümleri, Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi’ndeki (ESRF)4’teki CRG-FAME ışın hattında, enerji bant genişliği ~150–250 eV’ye sahip enerji çözümlü bir katı hal dedektörü (SSD) kullanılarak gerçekleştirilebilirken, HERFD-XAS ölçümleri ESRF2’deki CRG-FAME-UHD ışın hattında ~1–3 eV enerji bant genişliğine sahip bir kristal analizör spektrometresine (CAS) ihtiyaç duyar. . Floresan fotonlar, sırasıyla elektronik veya optik işlemlerle enerjilerine göre ayırt edilir.

Numune kriyo-preparatı, yapıları korumak ve bileşimsel kimyasal bütünlüğü korumak için gereklidir, böylece biyolojik doğal duruma yakın analizlere izin verir5. Ayrıca, sıvı helyum kriyojenik soğutma (LN2) kullanılarak 10 K’ya kadar düşük kriyojenik sıcaklıklarda yapılan analizler, radyasyon hasarının XAS için temel türleşmeyi yavaşlatmasına ve korumasına izin verir. Biyolojik örneklere uygulanan XAS teknikleri üzerine yapılan bazı incelemeler, kriyojenik koşullarda numune hazırlama ve analiz etme gerekliliğini bildirse de (örneğin, Sarret ve ark.6, Porcaro ve ark.7), hiçbiri ilgili ayrıntılı protokolü açıkça tanımlamamaktadır. Bu yayında, kriyojenik sıcaklıkta Se8 ve Fe9’un HERFD-XAS türleşmesi için kanser hücrelerinin ve plankton mikroorganizmalarının kriyo-hazırlanması için bir yöntem tanımlanmıştır.

Son teknoloji XAS spektroskopisi ölçümleri sırasında numune hazırlama ve çevre için iyi uygulama 1) bir kurulum gerektirir; 2) radyasyon hasarının etkilerini mümkün olduğunca sınırlayan bir analiz prosedürü; ve 3) X-ışını fotonlarının ışın boyutuna göre mümkün olduğunca homojen bir numune (veya model bileşik referansı). İlk madde, bir sıvı helyum kriyostat kullanarak, düşük bir sıcaklıkta elde etme işlemi gerçekleştirilerek dikkate alınır. İkinci madde, numunenin taze bir alanı üzerinde her bir kazanımın, kirişe göre hareket ettirilerek gerçekleştirilmesiyle ele alınır. Son olarak, üçüncü koşul göz önüne alındığında, gözeneklilikleri ve homojensizlikleri mümkün olduğunca sınırlamak ve X-ışını problu numune yüzeyindeki kiriş boyutuna göre pürüzlülüğü önlemek için numuneler (peletler) ve referanslar (tozlar) preslenmiş dökme peletlerde şartlandırılır. Protokolün tüm bu noktalarla nasıl başa çıktığını açıklıyoruz.

İnsan prostat hücre hattı PC-3 (yüksek metastatik potansiyel) ve yumurtalık hücre hattı OVCAR-3’ü (tüm yumurtalık kanseri vakalarının% 70’ini oluşturur) selenyum nanopartiküllerinin (Se-NP’ler) kanser hücrelerine yönelik antiproliferatif özellikleri araştırmak için kullandık ve fitoplanktonda demir tutumunu araştırmak için model bir tür olarak Phaeodactylum tricornutum diatom.

Protocol

1. Selenyum türleşmesi için insan PC-3 ve OVCAR-3 kanser hücresi peletlerinin hazırlanması NOT: Aşağıdaki protokol Weekley et al.10’dan uyarlanmıştır. Tüm adımlar, aseptik teknikler kullanılarak, biyogüvenlik seviye 2 koşulları ve kısıtlamaları altında bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleştirilmelidir. Malassez hücre sayma odasını kullanarak hücreleri sayın. PC-3 hücre hattı için şişe başına 150.000-200.000 h?…

Representative Results

Bu preparatların temel amacı, selenyum nanopartikülleri (Se-NP’ler) ve kanser hücreleri arasındaki etkileşimi ve fitoplanktonlarda demir bağlama ve sekestrasyonunu araştırmaktı. Selenyumun başlangıç halindeki (BSA Se-NP’ler) ve besleyici ortamda inkübe edilen hücrelerdeki (24 saatlik inkübasyondan sonra BSA Se-NP’ler) HERFD-XANES spektrumları Şekil 10’da gösterilmiştir. Sonuçlar, ilk Se-NP’lerdeki selenyumun hem Se (0) hem de selenit benzeri f…

Discussion

Bu protokol, X-ışını absorpsiyon spektroskopisi ile biyolojik örneklerde selenyum ve demirin kimyasal formunu incelemek için kullanılmıştır. Biyolojik numunelerin ve referans bileşiklerin kriyo-hazırlanması ve depolanmasının yanı sıra HERFD-XAS ölçümlerine odaklanmaktadır.

Kriyo-hazırlama ve depolama
Toplu biyolojik numune peletlerinin kriyo-hazırlanması, numunelerde bulunan türlerin kimyasal bütünlüğünün korunmasını sağlar. Bu çok önemli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CEMHTI (Orleans, Fransa, ANR-13-BS08-0012-01) ve Labex OSUG@2020 (Grenoble, Fransa, ANR-10-LABX-0056) tarafından ışın hattı gelişimine yapılan finansal katkılar için minnettarız. FAME-UHD projesi, Fransız “grand emprunt” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG konsorsiyumu ve INSU CNRS Enstitüsü tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Deneyler sırasındaki tüm katkılardan, özellikle BM30B ve BM16 üzerinde çalışan tüm kişilere minnettarız. Yazarlar, senkrotron radyasyon ışın süresinin sağlanması için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi’ni kabul etmektedir. Ayrıca finansal destek için PHYTOMET ANR projesini (ANR-16-CE01-0008) ve finansal destek için SEDMAC projesini (INCA-Plan kanser-ASC16019CS) kabul ediyoruz.

Materials

Ammonium nitrate Sigma-Aldrich A3795 NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber Coy Laboratory, USA equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock Sigma-Aldrich A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder Sigma-Aldrich 255475
Cell counting chamber Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO 14190-094 Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes 0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes 15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 Sigma-Aldrich F3388 aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum GIBCO A31604-02 Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks Sigma-Aldrich Z707503 TPP 150 cm2 area
Growth chamber Sanyo Sanyo MLR-352 at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer Sigma-Aldrich H4034 1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3 ATCC, Rockville, MD HTB-161 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas Sigma-Aldrich I0516 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum Roscoff culture collection RCC69 http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid Sigma-Aldrich M3183 MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3 ECCAC, Salisbury, UK 90112714 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts Sigma-Aldrich S9883 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers Oxford Instrument AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) GIBCO A10491-01 Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA Se50-BS-1 BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA 11. Se50-CS-1 Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate Sigma-Aldrich 71746 Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate Sigma-Aldrich S5022 NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock Sigma-Aldrich M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%) GIBCO 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25300-054
Vitamin stock Sigma-Aldrich T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

References

  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
  9. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  10. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  11. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  12. SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
  13. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  14. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  15. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
  16. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  17. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  18. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  19. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  20. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
  21. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bissardon, C., Isaure, M., Lesuisse, E., Rovezzi, M., Lahera, E., Proux, O., Bohic, S. Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution X-Ray Absorption Spectroscopy. J. Vis. Exp. (183), e60849, doi:10.3791/60849 (2022).

View Video