Biologiske prøver Forberedelse for spesiering ved kryogen temperatur ved bruk av høyoppløselig røntgenabsorpsjonsspektroskopi

Summary

Denne protokollen presenterer en detaljert prosedyre for å forberede biologiske kryompler for synkrotronbaserte røntgenabsorpsjonsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle trinnene som kreves for å optimalisere prøvepreparering og kryopreservering med eksempler på protokollen med kreft og planteplanktonceller. Denne metoden gir en universell standard for prøvekryo-forberedelse.

Abstract

Studiet av elementer med røntgenabsorpsjonsspektroskopi (XAS) er av spesiell interesse når man studerer metallenes rolle i biologiske systemer. Prøvepreparering er en viktig og ofte kompleks prosedyre, spesielt for biologiske prøver. Selv om røntgenspesifisieringsteknikker er mye brukt, er det ennå ikke formidlet noen detaljert protokoll for brukere av teknikken. Videre er kjemisk tilstandsmodifisering bekymringsfull, og kryobaserte teknikker anbefales å analysere de biologiske prøvene i deres nesten innfødte hydrerte tilstand for å gi maksimal bevaring av kjemisk integritet av cellene eller vevene. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokoll basert på kryo-bevarte prøver. Det er demonstrert i en høy energioppløsning fluorescens oppdaget røntgenabsorpsjon spektroskopi studie av selen i kreftceller og en studie av jern i planteplankton. Denne protokollen kan brukes med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker som kan bli skadet ved bestråling.

Introduction

Studien av cellulære biotransformasjoner av essensielle eller giftige elementer krever spesieringsteknikker med høy følsomhet og bør minimere prøveprepareringstrinn som ofte er utsatt for modifikasjon av kjemiske arter.

Fysiologiske elementer som selen og jern er kjent for å være spesielt vanskelig å spekulere på grunn av deres komplekse kjemi, ulike stabiliteter av selen eller jernarter, og deres lave konsentrasjon i ppm (mg / kg) eller til og med sub-ppm-serien. Dermed kan studiet av spesiering av disse elementene av XAS være ekstremt utfordrende. Synchrotron XAS og spesielt høy energioppløsning fluorescens oppdaget XAS (HERFD-XAS), som tillater et svært lavt signal-til-bakgrunn-forhold¹, er tilgjengelige ved synkrotronkilder for å spekulere høyt fortynnede elementer i komplekse biologiske matriser ^2,3. Konvensjonelle fluorescens-XAS-målinger kan utføres ved hjelp av en energiavklart SSD-detektor (solid state detektor) med energibåndbredde ~ 150-250 eV, på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, mens HERFD-XAS-målinger trenger et krystallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibåndbredde ~ 1-3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF² . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske prosesser.

Prøven cryo-forberedelse er avgjørende for å bevare strukturer og opprettholde komposisjonell kjemisk integritet, og dermed tillate analyse nær den biologiske innfødte tilstand⁵. Videre tillater analyser utført ved kryogeniske temperaturer så lave som 10 K ved hjelp av flytende heliumkryogen kjøling (LN₂), strålingsskader å bremse og bevare elementær spesiering for XAS. Selv om noen vurderinger av XAS-teknikker som brukes på biologiske prøver rapporterer nødvendigheten av å forberede og analysere prøver under kryogeniske forhold (f.eks. Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), beskriver ingen av dem tydelig den relaterte detaljerte protokollen. I denne publikasjonen er en metode for kryo-forberedelse av kreftceller og planktonmikroorganismer beskrevet for HERFD-XAS-spesiering av^{Se 8} og Fe⁹ ved kryogen temperatur.

God praksis for prøvepreparering og miljø under toppmoderne XAS-spektroskopimålinger krever 1) et oppsett; 2) en analyseprosedyre som begrenser effekten av strålingsskader så mye som mulig; og 3) en prøve (eller modellforbindelsesreferanse) så homogen som mulig med hensyn til røntgenfotonstrålestørrelsen. Det første elementet tas i betraktning ved å utføre oppkjøpet ved lav temperatur, ved hjelp av en flytende helium cryostat. Den andre gjenstanden håndteres ved å utføre hvert oppkjøp på et nytt område av prøven ved å flytte den med hensyn til bjelken. Til slutt, med tanke på den tredje tilstanden, er prøver (pellets) og referanser (pulver) betinget i presset bulkpellets for å begrense porøsiteter og inhomogeniteter så mye som mulig, og for å unngå grovhet med hensyn til strålestørrelsen på røntgensonden. Vi forklarer hvordan protokollen omhandler alle disse punktene.

Vi brukte human prostata celle linje PC-3 (høyt metastatisk potensial) og ovariecelle linje OVCAR-3 (som står for opptil 70% av alle ovariekreft tilfeller) for å undersøke antiproliferative egenskaper mot kreftceller av selen nanopartikler (Se-NPs), og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modellart for å undersøke jern sequestration i phytoplankton.

Protocol

1. Fremstilling av den menneskelige PC-3 og OVCAR-3 kreftcellepellets for selen spesiering MERK: Følgende protokoll er tilpasset fra Weekley et al.10. Alle trinn må utføres under en cellekultur hette under biosikkerhet nivå 2 forhold og restriksjoner, ved hjelp av aseptiske teknikker. Tell cellene ved hjelp av et Malassez celletellingskammer. Frø 150 000–200 000 celler per kolbe for PC-3-cellelinjen og 300 000 celler for cellelinjen OVCAR-3. F…

Representative Results

Hovedmålene med disse preparatene var å undersøke samspillet mellom selen nanopartikler (Se-NPs) og kreftceller, og jernbinding og beslagleggelse i planteplankton. HERFD-XANES-spektra av selen i opprinnelig tilstand (BSA Se-NPs) og i celler inkubert i næringsmiddelmedium (BSA Se-NPs etter 24 h inkubasjon) er vist i figur 10. Resultatene viste at selen i de første Se-NPs var til stede som både Se(0) og selenittlignende former, mens selen i cellene …

Discussion

Denne protokollen ble brukt til å studere den kjemiske formen for selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorpsjonsspektroskopi. Den fokuserer på kryo-forberedelse og lagring av biologiske prøver og referanser forbindelser, samt på HERFD-XAS målinger.

Kryo-forberedelse og lagring
Kryo-preparatet av de store biologiske prøvepellets tillater bevaring av den kjemiske integriteten til artene som er tilstede i prøvene. Dette er avgjørende, fordi det er observert…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C