Detta protokoll presenterar ett detaljerat förfarande för att förbereda biologiska kryomplar för synkrotronbaserade röntgenabsorptionsspektroskopiexperiment. Vi beskriver alla steg som krävs för att optimera provberedning och kryokonservering med exempel på protokollet med cancer- och växtplanktonceller. Denna metod ger en universell standard för prov kryoberedning.
Studien av grundämnen med röntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) är av särskilt intresse när man studerar metallers roll i biologiska system. Provberedning är ett viktigt och ofta komplext förfarande, särskilt för biologiska prover. Även om röntgenspecieringstekniker används i stor utsträckning har inget detaljerat protokoll ännu spridits för användare av tekniken. Vidare är kemisk tillståndsmodifiering oroande, och kryobaserade tekniker rekommenderas för att analysera de biologiska proverna i deras nästan infödda hydratiserade tillstånd för att ge maximal bevarande av cellernas eller vävnadernas kemiska integritet. Här föreslår vi ett cellulärt beredningsprotokoll baserat på kryobevarade prover. Det demonstreras i en fluorescens med hög energiupplösning upptäckt röntgenabsorptionsspektroskopistudie av selen i cancerceller och en studie av järn i fytoplankton. Detta protokoll kan användas med andra biologiska prover och andra röntgentekniker som kan skadas av bestrålning.
Studien av cellulära biotransformationer av väsentliga eller giftiga element kräver specieringstekniker med hög känslighet och bör minimera provberedningssteg som ofta är benägna att modifiera kemiska arter.
Fysiologiska element som selen och järn är kända för att vara särskilt svåra att specificera på grund av deras komplexa kemi, olika förmågor hos selen- eller järnarterna och deras låga koncentration i ppm (mg / kg) eller till och med under ppm-intervallet. Således kan studien av speciering av dessa element av XAS vara extremt utmanande. Synkrotron XAS och särskilt hög energiupplöst fluorescensdetekterat XAS (HERFD-XAS), som möjliggör ett mycket lågt signal-till-bakgrundsförhållande1, finns tillgängliga vid synkrotronkällor för att specificera mycket utspädda element i komplexa biologiska matriser 2,3. Konventionella fluorescens-XAS-mätningar kan utföras med hjälp av en energiupplöst solid state-detektor (SSD) med en energibandbredd ~ 150–250 eV, på CRG-FAME-strålröret vid European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, medan HERFD-XAS-mätningar behöver en kristallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibandbredd ~ 1–3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålröret vid ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineras med avseende på sin energi med elektroniska respektive optiska processer.
Provet kryoberedning är viktigt för att bevara strukturer och upprätthålla sammansättningskemisk integritet, vilket möjliggör analys nära det biologiska ursprungstillståndet5. Dessutom tillåter analyser som utförs vid kryogena temperaturer så låga som 10 K med flytande heliumkryogen kylning (LN2) strålningsskador att sakta ner och bevara elementär speciering för XAS. Även om vissa recensioner av XAS-tekniker som tillämpas på biologiska prover rapporterar nödvändigheten av att förbereda och analysera prover under kryogena förhållanden (t.ex. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen av dem tydligt det relaterade detaljerade protokollet. I denna publikation beskrivs en metod för kryoberedning av cancerceller och planktonmikroorganismer för HERFD-XAS-speciering av Se8 och Fe9 vid kryogen temperatur.
God praxis för provberedning och miljö under toppmoderna XAS-spektroskopimätningar kräver 1) en installation; 2) ett analysförfarande som begränsar effekterna av strålskador så mycket som möjligt; och 3) ett prov (eller modellföreningsreferens) så homogent som möjligt med avseende på röntgenfotonstrålens strålstorlek. Det första objektet beaktas genom att utföra förvärvet vid låg temperatur med användning av en flytande heliumkryostat. Den andra posten behandlas genom att utföra varje förvärv på ett nytt område av provet genom att flytta det med avseende på strålen. Slutligen, med tanke på det tredje villkoret, konditioneras prover (pellets) och referenser (pulver) i pressade bulkpellets för att begränsa porositeter och inhomogeniteter så mycket som möjligt och för att undvika grovhet med avseende på strålstorleken på röntgensondprovytan. Vi förklarar hur protokollet behandlar alla dessa punkter.
Vi använde human prostata cellinje PC-3 (hög metastatisk potential) och äggstockscelllinje OVCAR-3 (som står för upp till 70% av alla äggstockscancerfall) för att undersöka de antiproliferativa egenskaperna mot cancerceller hos selennanopartiklar (Se-NP) och Phaeodactylum tricornutum diatom som modellart för att undersöka järnbindning i fytoplankton.
Detta protokoll användes för att studera den kemiska formen av selen och järn i biologiska prover genom röntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserar på kryoberedning och lagring av biologiska prover och referensföreningar, liksom på HERFD-XAS-mätningarna.
Kryoberedning och lagring
Kryoberedningen av det biologiska bulkprovpelletset möjliggör bevarande av den kemiska integriteten hos de arter som finns i proverna. Detta är avgörande, eftersom artbildningsförän…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för ekonomiska bidrag till strålrörsutvecklingen av CEMHTI (Orleans, Frankrike, ANR-13-BS08-0012-01) och Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrike, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-projektet stöds ekonomiskt av det franska “grand emprunt” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet och INSU CNRS-institutet. Vi är tacksamma för alla bidrag under experimenten, särskilt alla personer som arbetar med BM30B och BM16. Författarna erkänner european synchrotron radiation facility för tillhandahållande av synkrotronstrålningsstråletid. Vi erkänner också PHYTOMET ANR-projektet för ekonomiskt stöd (ANR-16-CE01-0008) och SEDMAC-projektet för ekonomiskt stöd (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
Cell scraper | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
Optical microscope | |||
PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
T-75 flasks | |||
Tissue culture hood | |||
Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
Water bath 37°C |