Summary
La oxidación fotoquímica rápida in vivo de proteínas (IV-FPOP) es una técnica de huella de proteína sinterión radical hidroxilo que permite mapear la estructura proteica en su entorno nativo. Este protocolo describe el montaje y la configuración del sistema de flujo microfluídico IV-FPOP.
Abstract
La oxidación rápida de proteínas (FPOP) es un método de huella de proteína sradical hidroxilo (HRPF) utilizado para estudiar la estructura de proteínas, las interacciones proteína-ligand e interacciones proteína-proteína. FPOP utiliza un láser excimer KrF a 248 nm para la fotólisis de peróxido de hidrógeno para generar radicales hidroxilo que a su vez oxidativamente modifican las cadenas laterales de aminoácidos solventes accesibles. Recientemente, ampliamos el uso de FPOP de etiquetado oxidativo in vivo en Caenorhabditis elegans (C. elegans), titulado IV-FPOP. Los nematodos transparentes se han utilizado como sistemas modelo para muchas enfermedades humanas. Los estudios estructurales realizados en C. elegans por IV-FPOP son factibles debido a la capacidad del animal para la toma de peróxido de hidrógeno, su transparencia a la irradiación láser a 248 nm y la naturaleza irreversible de la modificación. El montaje de un sistema de flujo microfluídico para etiquetado IV-FPOP, parámetros IV-FPOP, extracción de proteínas y parámetros optimizados LC-MS/MS se describen aquí.
Introduction
La huella proteica acoplada a la espectrometría de masas (EM) se ha utilizado en los últimos años para estudiar las interacciones proteicas y los cambios de conformación. Los métodos de huella de proteína sorplícea radical (HRPF) sondean la accesibilidad de los disolventes de proteínas mediante la modificación de las cadenas laterales de aminoácidos de proteínas. El método HRPF, la rápida oxidación fotoquímica de proteínas (FPOP)1, se ha utilizado para sondear la estructura proteica in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3, y más recientemente in vivo (IV-FPOP)4. FPOP utiliza un láser excimer de longitud de onda de 248 nm con el fin de generar rápidamente radicales hidroxilo por fotólisis de peróxido de hidrógeno para formar radicales hidroxilo1. A su vez, estos radicales pueden etiquetar 19 de 20 aminoácidos en una escala de tiempo de microsegundos, más rápido de lo que las proteínas pueden desplegarse. Aunque, la reactividad de cada aminoácido con radicales hidroxilo se extiende 1000 veces, es posible normalizar la oxidación de la cadena lateral calculando un factor de protección (PF)5.
Dado que el FPOP puede modificar oxidativamente las proteínas independientemente de su tamaño o secuencia primaria, resulta ser ventajoso para los estudios de proteínas en las células e in vivo. IV-FPOP sondas la estructura proteica en C. elegans de forma similar a los estudios in vitro y en células4. C. elegans son parte de la familia de los nematodos y son ampliamente utilizados como modelo para estudiar enfermedades humanas. La capacidad del gusano para la adquisición de peróxido de hidrógeno por difusión pasiva y activa permite el estudio de la estructura proteica en diferentes sistemas corporales. Además, los C. elegans son adecuados para IV-FPOP debido a su transparencia en la longitud de onda láser de 248 nm necesaria para FPOP6. El acoplamiento de este método a la espectrometría de masas permite la identificación de múltiples proteínas modificadas utilizando enfoques proteómicos tradicionales de abajo hacia arriba.
En este protocolo, describimos cómo realizar IV-FPOP para el análisis de la estructura proteica en C. elegans. El protocolo experimental requiere el montaje y la configuración del sistema de flujo microfluídico para IV-FPOP adaptado de Konermann et al7. Después de IV-FPOP, las muestras se homogeneizan para la extracción de proteínas. Las muestras de proteínas son proteolizadas y los péptidos son analizados por ms tándem de cromatógrafo líquido (LC), seguido de cuantificación.
Protocol
1. C. elegans mantenimiento y cultura
- Cultivar y sincronizar colonias de gusanos a su cuarta etapa de larvas (L4) siguiendo los procedimientos de laboratorio estándar8.
- El día del experimento IV-FPOP, lave los gusanos L4 del césped bacteriano (OP50 E. coli) con tampón M9 (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Obtener 500 alícuotas de 10.000 gusanos por muestra IV-FPOP.
2. Montaje del sistema de flujo microfluídico
- Inicie el conjunto del sistema de flujo cortando una pieza de 2 cm de tubo de etileno propileno fluorado (FEP) (diámetro exterior de 1/16 pulg. (o.d.) x 0,020 pulg. diámetro interior (i.d.)).
- Usando una aguja de disuelto limpia, ensanchar la i.d. del tubo FEP para hacer un pequeño cráter en un solo extremo, de 50 mm de longitud. El cráter debe ser lo suficientemente grande como para caber dos piezas de 360 m o.d. de sílice fusionada.
NOTA: No ensanchen el extremo opuesto, ya que este extremo solo se utilizará para ajustar el capilar de salida. - Con un cortador cerámico, corte dos piezas de 15 cm de sílice fusionada de 250 m. Estas dos piezas se convertirán en las líneas de infusión del sistema de flujo.
- Usando cinta autoadhesiva, pegue los dos capilares de 250 m i.d. juntos asegurándose de que sean paralelos entre sí y sus extremos estén 100% lavados.
NOTA: Para asegurarse de que los extremos de sílice fusionado no se trituran después del corte, y se enrojecen y se enjuagen al 100% entre sí, se recomienda examinarlos con una lupa o bajo un microscopio estéreo. - Inserte los dos capilares grabados en el cráter hecho a mano del tubo FEP. Empuje los capilares hasta el borde mismo del cráter hecho a mano.
ADVERTENCIA: Para mantener la eficacia del sistema de flujo, no empuje más allá del cráter hecho a mano(Figura 1a). - Coloque un pequeño punto de resina epoxi sobre una superficie limpia y mezcle con una aguja de diselación.
- Rápidamente, usando la misma aguja, coloque una pequeña gota de resina al final de los capilares que se infunden donde se conectan con el tubo FEP y deje que la resina se seque, colgando del lado de salida hacia arriba, durante unos minutos(Figura 1a).
- Mientras la resina se seca, uniendo el tubo FEP y dos capilares juntos, cortar un nuevo capilar de 250 m i.d. El nuevo capilar se convertirá en el capilar de salida del sistema de flujo. La longitud deseada del capilar se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:
Donde l es la longitud del capilar a cortar en centímetros, t es el tiempo de reacción deseado en minutos, f es el caudal en ml/min, e i.d. es el diámetro interior del capilar en centímetros.
NOTA: Después de cortar el capilar de salida, examine los extremos asegurándose de que estén rectos y no aplastados. - Una vez que la resina se haya secado, inserte el nuevo capilar a través del extremo de salida de tubo FEP. Los extremos interiores del capilar de salida y los dos capilares de infusión deben estar al ras entre sí dentro del tubo FEP, esto crea la mezcla-T(Figura 1b).
- Enlazar el capilar de salida y el tubo FEP con resina epoxi fresca como se describe en los pasos 2.6 y 2.7.
- Deje que la resina se seque durante la noche uniendo el sistema de flujo. Configure el sistema de flujo microfluídico al día siguiente(Figura 1c).
3. Sistema de flujo microfluídico para FPOP in vivo
- Inserte cuatro agitadores magnéticos dentro de una jeringa de 5 ml. Esta jeringa se convierte en la jeringa de muestra. Los agitadores magnéticos evitan que los gusanos se asienten dentro de la jeringa durante el IV-FPOP(Figura 2A).
- Llene las dos jeringas de 5 ml con M9. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de cada jeringa, ya que pueden afectar el caudal y la eficiencia de mezcla.
- Conecte un adaptador Luer a cada jeringa de 5 ml asegurándose de que estén apretados con los dedos y asegurados en su lugar.
- Conecte cada jeringa a una sola válvula de 3-2. La jeringa debe estar conectada al puerto medio de la válvula(Figura 2B).
- Fije cada jeringa de 5 ml a la bomba de jeringa doble y ajuste el collar de tope mecánico para evitar una presión excesiva a la jeringa desde el bloque de empuje. Tenga en cuenta la adición de los agitadores magnéticos al ajustar el collar de tope.
- Fije cada extremo capilar infundidor del sistema de flujo microfluídico casero al puerto superior de cada válvula 3-2 utilizando una tuerca súper sin brida, un manguito FEP y una férula super flangeless(Figura 2B).
- Al puerto abierto restante de la válvula 3-2 (puerto inferior), conecte un capilar de 10 cm 450 m i.d. utilizando una tuerca super sin brida, un manguito FEP y una férula supers inflita(Figura 2B). Estos capilares se convierten en los capilares de la muestra de retirada.
- Encienda el flujo de la bomba y compruebe todas las conexiones del sistema de flujo microfluídico en busca de fugas visuales. Fluya al menos tres volúmenes de jeringa utilizando el caudal experimental. El caudal final depende de la ventana de irradiación láser, la frecuencia del láser y un volumen de fracción de exclusión cero.
NOTA: Para este protocolo, se calculó un caudal final de 375,52 l/min a partir de una ventana de irradiación láser de 2,55 mm, 250 m, es decir, sílice fundida, fracción de exclusión cero y frecuencia de 50 Hz.- La trayectoria de flujo está marcada por las flechas en la manija de la válvula 3-2. Cada jeringa se puede rellenar manualmente moviendo la manija de la válvula desde la posición de expulsión hasta la posición de extracción.
NOTA: Las fugas en la válvula 3-2 se pueden fijar volviendo a atornillar la tuerca super sin brida o reemplazando cualquiera de las conexiones de la válvula (tuerca super sin brida, manguito FEP o férula super sin bridas). Las fugas en la mezcla-T requieren un reensamblaje del sistema de flujo microfluídico (pasos 2.1 a 2.11).
- La trayectoria de flujo está marcada por las flechas en la manija de la válvula 3-2. Cada jeringa se puede rellenar manualmente moviendo la manija de la válvula desde la posición de expulsión hasta la posición de extracción.
- Mueva el sistema de flujo microfluídico al banco experimental y fije el capilar de salida a la etapa de radiación utilizando una unión de acero inoxidable de 360 m(Figura 2C,D).
- Usando un encendedor de largo alcance, queme el recubrimiento de la sílice fusionada en la ventana de irradiación láser. Limpie el recubrimiento quemado con tejido libre de pelusas y metanol.
NOTA: Alternar entre ciclos de combustión y ciclos de limpieza de metanol para evitar el sobrecalentamiento del capilar, ya que el exceso de calor puede derretirse y/o romper el capilar. - Coloque el bloque del agitador magnético por encima de la jeringa de 5 ml que contiene los agitadores magnéticos. Ajuste la velocidad y la posición del bloque del agitador magnético para que los agitadores magnéticos dentro de la jeringa de 5 ml giren lenta y constantemente.
4. In vivo FPOP
- Encienda el láser excimer KrF y permita que el thyratron se caliente.
ADVERTENCIA: El láser emite radiación visible e invisible a una longitud de onda de 248 nm que puede dañar los ojos. Se debe usar una protección ocular adecuada antes de encender el láser y abrir la ventana de salida del haz. - Mida la energía del láser a una frecuencia de 50 Hz durante al menos 100 pulsos colocando el sensor óptico en la ventana de salida del haz.
NOTA: Para este protocolo, se utilizó una ventana de irradiación de 2,55 mm con una energía láser de 150 x 2,32 mJ. - Obtener aproximadamente 10.000 gusanos (500 ml) y retirar manualmente la muestra en la jeringa de muestra.
- Llene la jeringa de muestra con 2,5 ml de tampón M9 para un volumen de muestra final de 3 ml. Asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en la jeringa de muestra.
- Llene la segunda jeringa con 3 ml de 200 mM H2O2, asegurando de nuevo que no se introduzcan burbujas de aire en la jeringa.
- Al final del capilar de salida, coloque un tubo cónico de 15 ml envuelto en papel de aluminio que contenga 6 ml de 40 mM N'-dimetiltiourea (DMTU), 40 mM N-tert-butilo-fenilnitrone (PBN), y 1% sulfóxido de dimetil para quesoqueelhado el exceso de H2O2, radicales de hidroxilo, e inhibir la actividad de metionina sulfúrgico.
- Inicie el láser excimer desde la ventana del software, espere el primer pulso e inicie el flujo de muestra desde la jeringa doble.
NOTA: Las muestras deben ejecutarse en duplicados biológicos en triplicados técnicos en 3 condiciones de muestra: irradiación láser con H2O2 (muestra), sin irradiación láser con H2O2 y sin irradiación láser no H2O2 (controles), totalizando a 9 muestras por conjunto biológico. - Recoja toda la muestra en el tubo de 15 ml, mientras supervisa activamente el flujo de muestra en busca de fugas visuales, ya que a veces se puede acumular cierta contrapresión de la jeringa de muestra.
- Después de IV-FPOP, gusanos de pellets por centrifugación a 805 x g durante 2 min. Retire la solución de temple, agregue 250 l de tampón de lisis (8 M de urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM Decl, 1 mM EDTA, 1 mM de flúor de fenilsulfoniliuro [PMSF]). Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio, congele el flash y guárdela a -80 oC hasta la digestión de la muestra.
5. Extracción, purificación y proteólisis de proteínas
- Descongelar muestras congeladas en hielo y homogeneizar por sonicación durante 10 s, seguido de una incubación de hielo de 60 s. Se pueden requerir múltiples rondas de sonicación, se puede observar homogeneización bajo un estereomicroscopio colocando una alícuota de muestra de 2 ml en una diapositiva del microscopio. La homogeneización de muestras se completa cuando se ven trozos pequeños o nulos de gusanos.
- Centrifugar gusanos homogeneizados a 400 x g durante 5 min a 4 oC y recoger el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga limpio.
- Determinar las concentraciones de proteínas de la muestra utilizando un ensayo de ácido bicincino (ensayo BCA) utilizando las instrucciones del fabricante.
NOTA: La concentración de la muestra se puede determinar utilizando cualquier ensayo de concentración de proteínas bioquímicas de su elección. Tenga en cuenta la compatibilidad de reactivos con tampón de lisis (8 M urea, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Además, puede ser necesaria una dilución tampón. - Obtener 100 g de proteína de cada muestra y colocar en tubos de microcentrífuga limpios.
- Añadir ditiothreitol (TDT) a una concentración final de 10 mM para reducir los enlaces de disulfuro en todas las muestras. Vórtice, espírese e incubar muestras a 50 oC durante 45 min.
- Enfríe las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
- Añadir yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 50 mM a residuos reducidos de alquilato. Vórtice, espírese e incubar muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.
- Inmediatamente después de la alquilación, precipitar la muestra de proteína agregando 4 volúmenes de acetona pre-enfriada al 100% e incubar a -20 oC durante la noche.
- Al día siguiente, la proteína pellet se precipita por centrifugación a 16.000 x g durante 10 min. Lavar el pellet de muestra con 90% de acetona, eliminar el sobrenadante y dejar que el pellet se seque durante 2-3 min.
- Vuelva a suspender el pellet proteico en Tris-HCl de 25 mM (1 g/L). Añadir la trippsina a una proporción final de proteasa a proteína de 1:50 (p/p) y digerir las muestras a 37 oC durante la noche.
- Al día siguiente aplacar la reacción de digestión de tripsina añadiendo un 5% de ácido fórmico.
NOTA: Se necesita un mínimo de 0,5 g de péptidos por muestra para el análisis de LC-MS/MS (pasos 6.1-6.5). Determinar las concentraciones de péptidos de muestra utilizando un ensayo cuantitativo de péptidos colorimétricos (ver la Tabla de Materiales)como se describe en el protocolo del fabricante.
6. Espectrometría de masas tándem de cromatografía líquida de alto rendimiento (LC-MS/MS)
- Utilice las siguientes fases móviles de LC: agua en 0,1% FA (A) y ACN en 0,1% FA (B).
- Cargue 0,5 g de péptidos en una columna de trampa (180 m a 20 mm) que contenga C18 (5 m, 100 o) y lave la muestra con un 99% de disolvente A y un 1% de B durante 15 minutos a un caudal de 15 ml/min.
- Separe los péptidos utilizando una columna empaquetada interna (0,075 mm i.d. a 20 mm) con material de fase inversa C18 (5 m, 125 o).
- Utilice el siguiente método de separación analítica: el gradiente se bombeó a 300 nL/min durante 120 min: 0 x 1 min, 3% B; 2 x 90 min, 10-45% B; 100-105 min, 100% B; 106-120 min, 3% B.
- Realizar la adquisición de datos de péptidos en modo iónico positivo de ionización nanoelectrospray (nESI) utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución.
NOTA: Para este protocolo, se utilizó una pareja de instrumentos LC (UPLC) de ultra-rendimiento a un espectrómetro de masas de alta resolución. Se utilizó la adquisición dependiente de datos. El rango de escaneo m/z para MS1 fue de 3750–1500 con una resolución de 60.000 y una exclusión dinámica de 60 s. Se excluyeron los iones con estados de carga de +1 y >6. Se utilizó un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 5,5e5 con un tiempo máximo de inyección de 50 ms y un umbral de intensidad de 5,5e4. Los iones seleccionados para MS2 fueron sometidos a una fragmentación de disociación de colisiones de mayor energía (HCD) utilizando una energía de colisión normalizada del 32%. Se detectaron iones de fragmentos en el espectrómetro con una resolución de 15.000 y un objetivo de 5.0e4 AGC.
7. Análisis de datos
- Buscar archivos MS en tándem con un software de análisis proteómico de abajo hacia arriba contra la base de datos C. elegans.
- Establezca los parámetros de búsqueda de análisis de proteínas de la siguiente manera: un escote perdido de trippsina, rango de masa de péptidodes de 375–1500 m/z, tolerancia de masa de fragmentos de 0,02 y tolerancia de masa precursora de 10 ppm. La carbamidometilación se establece como una modificación estática y todos conocen las modificaciones de la cadena lateral de radicales hidroxilo9,,10 como dinámicas. La identificación de péptidos se establece en un 95% de confianza (medio) y residuos con una confianza del 99% (alta). La tasa de detección falsa (FDR) se establece un 1%.
- Exportar datos a una base de datos electrónica y resumir el grado de oxidación por péptido o residuo utilizando la ecuación siguiente11:
NOTA: Donde el área EIC modificada es el área cromatográfica iónica extraída (EIC) del péptido o residuo con una modificación oxidativa, y el área EIC es el área total del mismo péptido o residuo con y sin la modificación oxidativa.
Representative Results
En el sistema de flujo microfluídico utilizado para IV-FPOP, H2O2 y los gusanos se mantienen separados hasta justo antes de la irradiación láser. Esta separación elimina la descomposición de H2O2 por catalasa endógena y otros mecanismos celulares12. El uso de un capilar de 250 m i.d. muestra una recuperación total de la muestra entre el 63 y el 89 % en dos réplicas biológicas, mientras que el capilar de 150 m i.d. sólo muestra una recuperación del 21-31%(Figura 3A). El uso de un capilar i.d. más grande (250 m) conduce a un mejor flujo de gusano durante el IV-FPOP y el flujo de gusano único(Figura 3B)en comparación con un capilar i.d. más pequeño (150 m)(Figura 3C). El capilar de 150 m i.d. no permite un solo flujo de gusano(Figura 3C)y se ven varios gusanos fluyendo juntos en la ventana de irradiación láser que disminuye la cantidad de exposición láser por gusano individual.
IV-FPOP es una técnica de etiquetado covalente que sondea la accesibilidad solvente en C. elegans. La Figura 4A muestra un representativo cromatogramas iónicos extraídos (EIC) de un péptido modificado y no modificado por FPOP. La etiqueta de radical hidroxilo cambia la química de los péptidos modificados oxidativamente, haciendo que los péptidos modificados FPOP sean más polares. En la cromatografía de fase inversa, los péptidos modificados IV-FPOP tienen tiempos de retención más tempranos que los péptidos no modificados. La fragmentación MS/MS de péptidos aislados permite la identificación de residuos modificados oxidativamente(Figura 4B).
IV-FPOP ha demostrado modificar oxidativamente un total de 545 proteínas a través de dos réplicas biológicas dentro de C. elegans (Figura 5A,B). Una ventaja de IV-FPOP como método de huella proteica se basa en la capacidad de la técnica para modificar proteínas en una variedad de sistemas corporales dentro de los gusanos (Figura 5C). Este método permitiría sondear la estructura de proteínas y las interacciones proteicas independientemente del tejido corporal u órgano dentro del gusano. Además, el análisis de LAM en tándem confirma la accesibilidad in vivo de las sondas IV-FPOP. Se analizó el patrón de oxidación de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90) en complejo con la proteína de chaperon de miosina UNC-45 (Figura 6). El análisis de MS/MS para Hsp90 muestra cuatro residuos modificados oxidativamente(Figura 6C,D),la extensión normalizada de la modificación FPOP (ln(PF))5 indica que el residuo M698 de Hsp90 es menos accesible al disolvente que los residuos R697, E699 y E700 cuando se enlazan a UNC-45(Figura 6C). Estas diferencias en la oxidación se validan mediante cálculos de superficie accesible con disolvente de literatura (SASA) (PDB 4I2Z13). El residuo M698 tiene un valor SASA de 0,03 que se considera un residuo enterrado en comparación con los residuos R697, E699 y E700 con valores SASA más altos(Figura 6C). 14
Figura 1. Esquema del sistema de flujo microfluídico In vivo FPOP. (A) Las dos líneas de infusión (naranja) del sistema de flujo IV-FPOP se muestran dentro del tubo FEP (amarillo), la posición de unión correcta de la resina epoxi está representada por el círculo azul claro. (B) Mezcla completa montada-T formada por los tres capilares de 250 m i.d. La posición correcta de unión a la resina del capilar de salida al tubo FEP está representada por el círculo azul claro. (C) El sistema de flujo ensamblado completo para el etiquetado covalente in vivo de C. elegans. Antes de FPOP, los gusanos se mantienen separados de H2O2 hasta justo antes del etiquetado; la ventana de irradiación láser se muestra en azul claro y el rayo láser está representado por el rayo púrpura. Las cifras no se escalan. Esta cifra ha sido modificada de Espino et al.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Sistema microfluídico durante IV-FPOP. (A) Imagen representativa de C. elegans dentro de la jeringa de 5 ml. Sin agitar, los gusanos se asientan en la parte inferior de la jeringa (izquierda). Los agitadores magnéticos y el bloque del agitador mantienen a los gusanos en suspensión durante los experimentos IV-FPOP (derecha). (B) Imagen representativa de una jeringa de 5 ml, que infunde capilar y extrae capilar conectado a la válvula 3-2. La manija de la válvula 3-2 se muestra en la posición de retirada. (C) Sistema de flujo microfluídico durante IV-FPOP, el bloque de agitador magnético se coloca por encima de la jeringa de 5 ml de los gusanos. (D) Capilar de salida fijado a la etapa radiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación del flujo y recuperación de C. elegans utilizando dos capilares i.d. (A) Porcentaje de recuperación de gusanos después de IV-FPOP para dos réplicas biológicas (BR) con 250 (gris) y 150 (negro) ám i.d. capilares. Las barras de error se calculan a partir de la desviación estándar entre los triplicados técnicos. C. elgans que fluyen a través de la ventana de irradiación láser a través de un capilar de 250 m(B)y 150 m(C)i.d. Los gusanos están más estrechamente compactados en el capilar más pequeño. El capilar de 150 m i.d. muestra aglomeración de gusanos. Esta cifra ha sido modificada de Espino et al.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Resultados representativos de LC-MS/MS tras IV-FPOP. (A) EIC de un péptido modificado FPOP (rojo) y no modificado (azul). El péptido seleccionado pertenece a la proteína actin-1. (B) Espectro MS/MS de péptido de actina-1 doblemente cargado 317-327. (C) El espectro MS/MS del péptido modificado FPOP doblemente cargado 317-327, en este ejemplo P323 se modificó oxidativamente(y 5+ ion, rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. IV-FPOP modifica oxidativamente las proteínas dentro de C. elegans. (A) Diagrama de Venn de proteínas modificadas oxidativamente en presencia de peróxido de hidrógeno de 200 mM a 50 Hz a través de dos réplicas biológicas (BR), BR1 está en azul y BR2 está en amarillo. (B) Diagrama de Venn de proteínas modificadas oxidativamente identificadas en muestras irradiadas, control de peróxido de hidrógeno y control solo de gusano en BR2 a través de triplicados técnicos. (C) Gráfico circular de proteínas oxidativamente modificadas dentro de diferentes sistemas corporales De. elegans. Esta cifra ha sido modificada de Espino et al.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Correlacionar las modificaciones IV-FPOP en la accesibilidad de disolventes. (A) Proteína de chaperon de miosina UNC-45 (gris) (PDB ID 4I2Z13) destacando dos péptidos modificados identificados por el análisis LC/MS/MS, 669-680 y 698-706 (verde, recuadro izquierdo). UNC-45 está unido al fragmento de péptido Hsp90 (azul). Los residuos modificados oxidativamente dentro de este fragmento se muestran en palos (rojo), y UNC-45 se representa como una superficie (recuadro derecho). (B) Espectros tándem ms del péptido UNC-45 669-680 (arriba) y 698-706 (abajo) que muestran los iones b e y para la pérdida de CO2,una modificación fPOP. (C) El ln(PF) calculado para los residuos modificados oxidativamente Hsp90, R697, M698, E699 y E700. Los valores SASA calculados para Hsp90 se indican por encima de cada residuo. (D) Espectros tándem MS para R697, M698, E699 y E700 que muestran una modificación +16 FPOP. Esta cifra ha sido modificada de Espino et al.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El punto de referencia actual para el estudio de las interacciones proteína-proteína in vivo (PPI) es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En su forma más simple, esta técnica estudia EL IBP por transferencia de energía entre dos moléculas cuando están muy cerca unas15. A diferencia de las técnicas de EM, FRET no tiene la resolución de caracterizar los cambios de conformación y los sitios de interacción a nivel de aminoácidos. Las técnicas basadas en la EP se han utilizado cada vez más para el estudio del IBP16. IV-FPOP es un método HRPF que permite el análisis estructural de proteínas in vivo en C. elegans. Con el fin de etiquetar con éxito C. elegans por IV-FPOP, es importante montar correctamente el sistema de flujo microfluídico para reducir la pérdida de muestra. El capilar de 250 m i.d. ha demostrado maximizar la recuperación4de la muestra en comparación con los capilares 4 más pequeños. Los capilares i.d. más grandes no han sido probados, sin embargo el sistema de flujo microfluídico está diseñado utilizando un capilar con el mismo i.d. que un sistema de citometría de flujo disponible comercialmente para la clasificación de C. elegans. 17 El tamaño de la muestra de gusano también es importante, un tamaño de muestra inferior a 10.000 euros por muestra anterior a FPOP no produce concentraciones de proteínas lo suficientemente altas como para el análisis de LC-MS/MS. También se pueden utilizar tamaños de muestras más altos (>10.000 gusanos) ajustando el volumen inicial (paso 4.5).
El montaje adecuado del sistema de flujo microfluídico es importante. Las fugas en la vía de la muestra dan lugar a un flujo inconsistente de los gusanos o H2O2. Las férulas, manguitos y 3-2 válvulas se pueden reutilizar de múltiples experimentos IV-FPOP si se limpian correctamente después de cada experimento. Sin embargo, recomendamos ensamblar un nuevo sistema de flujo microfluídico para cada réplica biológica. Si los microfluídicos se montan correctamente, los gusanos y H2O2 se mezclarán en la mezcla-T con una contrapresión mínima. Como control de calidad (QC) del sistema de flujo microfluídico, recomendamos probar la eficiencia de mezcla utilizando colorantes de color. Es importante controlar el movimiento de los agitadores magnéticos dentro de la jeringa de gusano durante el IV-FPOP, la mezcla incorrecta de muestras en la jeringa de gusano o la mezcla-T puede resultar en la contrapresión que causa fugas. Además, las malas condiciones de mezcla conducen a grandes pérdidas de muestra, mala exposición láser de gusanos en la ventana láser y obstrucción.
El mantenimiento de C. elegans es importante para disminuir la oxidación del fondo. Recomendamos cultivar los gusanos a bajas temperaturas en condiciones de baja tensión, ya que las altas temperaturas pueden afectar a la oxidación total del fondo. Se recomienda un conjunto de muestras de control de gusanos solamente, sin H2O2 y sin irradiación láser, para todos los experimentos IV-FPOP para tener en cuenta la oxidación de fondo debido al mantenimiento de laboratorio. Una de las limitaciones actuales de esta técnica es el número total de péptidos modificados oxidativamente identificados y el número total de residuos oxidados por péptido con el fin de obtener mayor información estructural proteica. Aunque no se recomienda, un aumento en las modificaciones oxidativas podría lograrse mediante el uso de concentraciones más altas de peróxido de hidrógeno. Un aumento en el peróxido de hidrógeno podría alterar significativamente las vías biológicas importantes, así como conducir a un desarrollo inducido por la oxidación. Si se aumenta la concentración de peróxido de hidrógeno para IV-FPOP, se recomienda probar la viabilidad del gusano y la oxidación de fondo, ya que no se han probado concentraciones superiores a 200 mM.
El protocolo LC-MS/MS descrito se puede optimizar y modificar para cumplir con el control de calidad MS de otros laboratorios. El uso de técnicas de cromatografía 2D se ha demostrado previamente para aumentar la identificación de péptidos y proteínas modificados oxidativamente18. No obstante, no se recomiendan técnicas de enriquecimiento de proteínas que se dirigen a una proteína específica de interés, incluyendo pero no limitado a la precipitación de anticuerpos o ensayos de extracción. Estas técnicas pueden sesgar hacia un conformador de proteínas si el sitio de epítopo/unión de la proteína ha sido modificado oxidativamente por IV-FPOP. Los nuevos desarrollos en la huella de reactivos radicales, como el anión radical de sulfato10 o la trifluorometilación19 podrían aumentar la versatilidad de IV-FPOP. Aunque el único reactivo de etiquetado probado in vivo hasta ahora es el peróxido de hidrógeno, otros radicales activados por láser podrían optimizarse. El uso de otros radicales debe ser compatible con la viabilidad del gusano, permeable a la célula y la longitud de onda láser de 248 nm. Debido al uso de C. elegans como un sistema modelo para muchas enfermedades humanas, IV-FPOP tiene el potencial de tener un fuerte impacto en el estudio del papel de la estructura proteica en la patogénesis de la enfermedad.
Disclosures
Esta publicación fue escrita en cumplimiento parcial de la tesis de JAE Ph.D. Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Start-up de la Universidad de Maryland, Baltimore y el NIH 1R01 GM 127595 otorgado a LMJ. Los autores agradecen al Dr. Daniel Deredge su ayuda en la edición del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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