Aqui descrevemos um protocolo para imagens de células vivas do citoesqueleto de microtúbulos cortical no meristem apical de tiro e monitorando sua resposta às mudanças nas forças físicas.
A compreensão da regulação do nível celular e tecidual do crescimento e da morfogênese está na vanguarda da pesquisa biológica há muitas décadas. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter insights sobre como os sinais bioquímicos influenciam eventos morfogenéticos. No entanto, é cada vez mais evidente que, além dos sinais bioquímicos, as pistas mecânicas também impactam vários aspectos do crescimento celular e tecidual. A Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) é uma estrutura em forma de cúpula responsável pela geração de todos os órgãos acima do solo. A organização do citoesqueleto de microtúbulo cortical que media a deposição de celulose apoplásica em células vegetais é espacialmente distinta. A visualização e a avaliação quantitativa dos padrões dos microtúbulos corticais são necessárias para entender a natureza biofísica das células no SAM, já que a celulose é o componente mais rígido da parede celular da planta. A forma estereotipada da organização dos microtúbulos cortical também é uma consequência das forças físicas em todo o tecido existentes no SAM. A perturbação dessas forças físicas e o monitoramento subsequente da organização de microtúbulos corticais permitem a identificação de proteínas candidatas envolvidas na mediação da mecano-percepção e transdução. Aqui descrevemos um protocolo que ajuda a investigar tais processos.
As células vegetais são cercadas por uma matriz extracelular de polissacarídeos e glicoproteínas que se assemelha mecanicamente a um material composto reforçado com fibra capaz de mudar dinamicamente suas propriedades mecânicas1. O crescimento das células vegetais é impulsionado pela absorção de água na célula, o que resulta em um acúmulo concomitante de forças de tração na parede celular. Em resposta a tais forças, modificações no estado físico da parede celular permitem a expansão celular. As células com paredes primárias são capazes de sofrer um rápido crescimento em comparação com a parede celular secundária contendo células principalmente devido a diferenças na composição química dos polissacarídeos dentro. As células de parede primárias são compostas de celulose, hemicellulose e pectina, além de glicoproteínas, e falta de lignina, componente presente na parede celular secundária2. A celulose, um polímero de glicose ligado através de β-1,4 ligações, é o principal componente das paredes celulares. É organizado em estruturas fibrilares capazes de suportar altas forças de tração experimentadas durante o crescimento celular3. Além de resistir às forças de tração, o reforço mecânico ao longo de uma direção preferencial resulta em expansão orientada por turgor ao longo de um eixo perpendicular à orientação líquida do microfibril de celulose. A organização dos microfibrilas de celulose é influenciada pelo citoesqueleto de microtubulos cortical, pois orientam o movimento direcional dos complexos de celulose-sintetizadores localizados na membrana plasmática4. Portanto, monitorar a organização de microtúbulos corticais usando uma proteína associada a microtúbulos ou tubulina fundida com uma molécula fluorescente serve como proxy para a observação de padrões de sobrepesca de celulose em células vegetais.
A padronização do citoesqueleto de microtúbulos cortical está sob o controle de forças mecânicas derivadas da morfologia celular e tecidual. A organização de microtúbulos corticais não possui nenhuma organização preferencial ao longo do tempo em células localizadas no ápice do SAM, enquanto as células da periferia e a fronteira entre o SAM e o órgão emergente possuem uma matriz supracelular estável e altamente organizada de microtúbulos corticais5. Várias abordagens foram desenvolvidas para perturbar fisicamente o estado mecânico das células. Alterações no estado osmótico, bem como tratamento com compostos farmacológicos e enzimáticos que influenciam a rigidez da parede celular podem resultar em alterações subsequentes nas forças de tração experimentadas pela célula6,7. O uso de engenhocas que permitem o aumento gradual das forças compressivas experimentadas pelos tecidos é outra alternativa8. A aplicação de forças centrífugas também tem sido demonstrada para influenciar as forças mecânicas sem qualquer contato físico com as células9. No entanto, os meios mais amplamente utilizados de mudança de forças direcionais em um grupo de células se aproveitam do fato de que todas as células epidérmicas estão sob tensão e a ablação física das células eliminará a pressão de turgor localmente, bem como interromperá a adesão célula-celular, modificando assim as forças de tração experimentadas pelas células vizinhas. Isto é realizado tanto visando um laser ultravioleta pulsado de alta potência ou por meio de uma agulha fina.
Aqui elaboramos sobre o processo de imagem e avaliação do comportamento de microtúbulos corticais para perturbação mecânica no SAM.
A avaliação dos eventos de transdução de sinal mecânico é crucial para identificar os reguladores moleculares envolvidos nas vias de mecano-percepção e transdução. O protocolo descrito aqui fornece uma visão quantitativa de tais eventos usando a resposta de microtúbulos corticais como leitura para tal processo em SAMs Arabidopsis. O procedimento descrito aqui é utilizado rotineiramente em diversos estudos em diversos tipos de tecidos16,17,<s…
The authors have nothing to disclose.
Nenhum.
FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
myo-inositol | Sigma | I5125 | |
N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |