Summary
이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.
Abstract
배아 성 신장 organotypic 문화, 특히 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드는 발달 과정을 따르고 신장 질환을 모델링하기위한 훌륭한 도구입니다. 그러나, 모델은 혈관화 및 기능의 부족에 의해 제한된다. 이를 해결하기 위해, 조류 배아의 융모란투막(CAM)에 세포 및 조직을 이식하는 방법에 대한 개선된 프로토콜이 개발되어 혈관을 혈관화하고 혈류의 회복을 얻었다. 접목은 샘플을 CAM에 고정하고 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지를 공급하는 맞춤형 미니 저장소로 오버레이됩니다. 개선된 배양 방법은 이종이식을 최대 9일 동안 자랄 수 있게 합니다. 원고는 또한 이전에 간행된 고정 Z 방향 (FiZD) 방법을 사용하여 신장 오르가노이드 및 orgnotnotypic 문화의 장기 공초점 화상 진찰을 위한 최적 조건을 제공하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 유리 커버슬립과 멤브레인 사이에 배아 장기 또는 오르가노이드를 다량의 배지로 부드럽게 압축하고 최대 12일 동안 이미징을 위한 우수한 조건을 제공합니다. 함께, 이 방법은 향상한 공초점 화상 진찰을 가진 신장 오르가노이드 및 organotypic 신장 문화에 혈관화 그리고 혈류량을 허용합니다. 여기에 설명 된 방법은 생체 내 신장의 기본 및 적용 기능을 연구하는 데 매우 유용합니다. 두 방법 모두 다양한 유형의 조직 및 오르가노이드에 적용 가능합니다.
Introduction
배아 신장의 오르가노티픽 배양은 수십 년 전신발생을연구하는 중요한 모델이 되었다1,2,,3. 신장 오르가노이드는 건강하고 병에 걸린 신장의 발달을 연구하기위한 고급 모델 시스템을 나타냅니다4. 그러나 두 방법의 주요 단점은 두 방법 모두 신장의 주요 기능인 혈액 여과를 다시 요약하지 않는다는 것입니다. 네프론과 신장 혈관 구조는 생체 내 발달의 초기 단계와 유사하게 신장 오르가노이드 및 organotypic 문화에서 개발; 그러나, 시험관내에서 형성된 사구체는 avascular5. 생체내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 혈관화는 생체내 조건 하에서만 이식 실험에서 이전에 입증되었다. 예를 들어, 마우스 신장 캡슐 하에 인간 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드의 이식은 기능적 단계6에오르가노이드에서 네프론의 발달을 허용한다.
순전히 생체외 배양과 생체 내 이식 방법 사이의 중간 접근법은 조류 배아의 CAM에 대한 이종이식이다. 그대로 마우스 신장 프리모르디아의 혈관화는 이전에 이 시스템을 사용하여 입증되었다7,,8. 그러나, 또한, 이종이이식된 뮤린 신장에서의 신장 혈관구조는 이식편9가아닌 숙주 내피로부터 유래된 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 실험 조건이 공여자 유래 내피 세포의 생존을 위해 허용되지 않기 때문에 신장 혈관구조의 개발을 연구하기 위해 배아 신장의 키메라(조류-포유류) 모델의 잠재력을 현저히 감소시켰습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 부분에서 제시 조류 계란의 CAM에 마우스 배아 신장의 재배에 대 한 향상 된 방법, organotypic 문화와 이종 이식의 미세 환경 조건을 결합. 이전 방법의 주요 개선은 마우스 배아 신장과 신장 오르가노이드를 CAM에 직접 배치하는 대신 이식 된 조직을 공급하는 배양 배지로 채워진 투과성 미니 저장소로 겹쳐져 있다는 것입니다. 영양분과 함께 건조로부터 보호합니다. 실험의 성공률은 크게 증가하고 기증자 유래 혈관 구조의 개발을위한 조건이 향상됩니다. 이 방법을 이방법에서 이방법 으로 이식 배양하는 것은 공여자 신장으로부터 내인성 내피 세포로 구성된 사구체 혈관구조의 발달을 초래한다.
세포 형태 형성의 상세한 분석은 신장 문화 모형의 또 다른 중요한 응용입니다. 신장 배양의 타임랩스 이미지 획득의 이전에 보고된 방법은 배아 신장의 전반적인 형태 및 패터닝의 분석에만 충분하지만, 개별세포(10)를추적하는 것은 아니다. 최근, 신장 오르가노이드 및 오르노티픽 배양의 고해상도 공초점 3D 타임랩스 영상을 겨냥한 새로운 고정 Z-Direction(FiZD) 방법을11개기하였다. 이 방법에서, 오르가노이드와 배아 기관은 샘플의 두께가 70 μm에 도달 할 때까지 맞춤형 설계 플레이트에 트랜스 웰 삽입의 유리 커버 슬립과 투과성 멤브레인 사이에 부드럽게 압축되어 이미징을위한 최적의 광학 조건을 제공합니다. 방법의 두 번째 부분에서는, 장기 오르가노이드 화상 진찰을 위한 사용자 정의 디자인한 격판덮개 및 FiZD 실험의 설치를 위한 상세한 프로토콜이 기술됩니다.
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Protocol
동물 관리 및 절차는 실험실 동물의 사용을위한 핀란드 의 국가 법률, 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약 (ETS 123), EU 지침 86/609 / EEC에 따라 시행되었습니다.
1. 닭 CAM에 마우스 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 재배를위한 미니 저수지의 제조 및 이종이식 실험을 설정
- 6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 트랜스웰 세포 배양 인서트를 사용하십시오.
참고: 특정 실험에 따라 크거나 작은 미니 저장소를 사용할 수 있습니다. 최대 8개의 배아 신장을 이식하거나 동일한 닭 배아에 여러 개의 미니 저장소를 놓을 때(예: 동일한 닭 CAM에서 실험 및 대조군 샘플을) 작은 미니 저장소를 사용하는 것이 가장 좋습니다. - 원형 톱날 또는 핸드 톱이 달린 회전식 멀티툴을 사용하여 인서트 의 측면을 잘라내어 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.
- 메스 나 날카로운 칼로이 미니 저수지의 가장자리를 연마.
- 미니 저장소를 70% 에탄올로 1시간 이상 살균합니다.
- 미니 저수지를 오토클레이브 이중 증류수로 세척하고 층상 후드에서 건조시키십시오.
- PBS 및 배양 매체 (고혈당 DMEM / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙 토미신)에서 미니 저장소를 헹구고 있습니다.
- 페트리 접시에 저수지를 놓고, 멤브레인이 위를 향하여 배양 배지의 한 방울(600 μL/400 μL) 위에 놓습니다.
- 파이펫 또는 유리 모세관의 도움으로 멤브레인에 골고루 해부 된 생체 내 배아 신장 또는 신장 오르가노이드를 배열하십시오. 신장 주위에 액체를 많이 남기지 마십시오.
- 샘플을 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 2-24시간 동안 멤브레인에 부착시키십시오.
참고: 최대 8개의 E11.5 배아 마우스 신장 또는 신장 오르가노이드를 작은 삽입에 배열할 수 있습니다. 큰 삽입은 배아 조직의 더 큰 조각이 CAM의 더 큰 지역에 xenotransplant 또는 세포 하이드로겔 혼합물을 위해 사용될 경우에 추천됩니다. - 세포 배양 인큐베이터12,,13에서이전에 공표된 방법에 따라 제조된 8일된 전 오보 배양 배아 닭을 복용한다.
- 접목이 CAM을 향하도록 미니 저장소를 CAM으로 옮기고 멤브레인이 오버레이되도록 합니다. 닭 배아를 덮지 않도록 CAM 주변에 미니 저장소를 놓습니다.
참고: 12개의 웰 플레이트용 트랜스웰 인서트에서 제작된 소형 미니저장소를 사용할 경우 하나의 CAM에 최대 3개의 미니 저장소를 배치할 수 있습니다. - 500 μL (6 웰 인서트를) 또는 300 μL (12 웰 삽입)의 배양 배지를 미니 저장소에 추가합니다.
- 치킨 CAM에서 샘플을 최대 9 일 동안 재배하십시오. 매일 미니 저수지의 배양 매체를 교체하십시오.
참고 : 시료의 혈관 화는 이식 후 24-48 시간 즉시 관찰 할 수 있습니다.
2. 맞춤형 플레이트 제작 및 FiZD 문화 설정
- 6 웰 플레이트의 바닥에 20mm 직경 구멍을 뚫습니다.
참고: FiZD 실험의 경우 깊이가 16mm인 6개의 웰 플레이트를 사용합니다(재료 표에명시됨). - 카운터싱크 드릴 비트, 메스 또는 날카로운 칼이 있는 전기 드릴을 사용하여 구멍의 테두리(특히 위쪽)를 연마합니다.
- 플레이트를 70% 에탄올로 살균하여 1시간 이상 살균합니다.
- 오토클레이브 이중 증류수로 플레이트를 세척하고 멸균 조건에서 건조시키십시오.
- 철저하게 70 % 에탄올로 22mm x 22mm 유리 커버 슬립을 세척하거나 Saarela 등11에의해 게시 된 프로토콜에 따라 청소합니다.
- 무독성 조직 접착제를 사용하여 6 웰 플레이트의 구멍의 상부에 덮개 입술을 붙입니다. 구멍 주위에 접착제를 바르고 커버슬립을 가볍게 두어 덮습니다. 접착제를 말리십시오.
- 스테레오현미경으로 플레이트를 검사하고 필요한 경우 커버슬립 표면에서 여분의 건조 접착제를 제거합니다.
참고: 커버슬립 위에 접착제가 없는지 확인하여 시료를 균일하게 압축합니다. - 폴리스티렌 비드(70 μm 입자 크기)를 동일한 양의 하이드로겔과 혼합합니다. 웰당 50-100 μL의 부피는 충분합니다.
참고 : 하이드로 겔과 폴리스티렌 구슬의 혼합물을 얼음에 보관하십시오. - 트랜스웰 삽입을 해부 현미경 아래에 멤브레인을 위로 배치합니다.
- 시료(예를 들어, 생체내 배아 신장 또는 신장 오르가노이드)를 막에 고르게 배열한다.
- 연약한 조직에 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 샘플 옆에 하이드로겔 / 폴리스티렌 비드 혼합물을 추가합니다.
- 트랜스웰 인서트를 뒤집어 서식샘플이 있는 멤브레인이 아래를 향할 수 있도록 합니다.
- 수정 된 6 웰 플레이트의 웰에 삽입을 부드럽게 놓고 샘플이 구슬 수준으로 압축되도록 부드럽게 누릅니다.
참고 : 현미경을 사용하여 압축의 진행 상황을 따르십시오. - 인서트를 한 손으로 우물에 살짝 누르고 인서트 주변의 3점에서 납땜 인두로 플라스틱을 녹여 플레이트에 고정시십시오.
- 인서트가 플레이트에 고정되면 배양 배지 2 mL (DMEM / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙 토마이신)을 웰에 추가하고 동일한 방법으로 플레이트에 남아있는 우물을 계속 조립하십시오.
- 시간 경과 이미징을 위해 반전 된 현미경의 무대 인큐베이터에 완성 된 플레이트를 전송합니다.
- 적절한 실험 설정을 사용하여 샘플의 타임랩스 이미징을 수행합니다.
참고: 타임랩스 실험 중에 플레이트의 우물에서 배양 배지를 변경하는 것은 필요하지 않지만 인서트가 있는 구멍을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
여기에 제시된 CAM 배양 프로토콜은 닭 CAM에 대한 이종이식의 결과로 신장 오르가노이드 및 배아 신장의 고효율 혈관을 가능하게하였다(그림 1, 영화 1). 배양 배지를 함유한 미니저수지는 기증자 조직에 영양분을 공급하고 적절한 혈관을 지정하기 전의 기간 동안 건조로부터 보호하였다. 이 방법은 기증자 유래 내피 세포가 성장하기 위한 관대한 조건을 제공했다. 따라서, 이식된 신장 및 오르가노이드에서 신장 혈관구조는 주로, 전적으로는 아니지만, 공여자 특이적 세포에 의해나타났다(도 2B,C,F). 더 성숙한 사구체 혈관구조는 신장 오르골형 배양보다 CAM에 이식된 신장 및 신장 오르가노이드에서 수득되었다(도2D,E).
FiZD 프로토콜은 고해상도 공초점 현미경을 사용하여 생체 내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 장기 시간 경과 이미징을 위해 설계된 방법입니다. Trowell14에의해 설계된 고전적인 orgnotnotypic 문화 프로토콜에서, 시편은 금속 그리드에 의해 지지되는 다공성 필터 상에 배치되고, 공기-액체 인터페이스에서 유지된다(그림3A). 이 방법은 직립 또는 반전 된 유형의 현미경에 대 한 최적이 아니다. 여기에 제시된 방법은 화상 진찰을 위한 반전한 현미경으로 작동하도록 특별히 디자인되었습니다. 샘플을 아래에서 유리 커버슬립과 트랜스웰 인서트의 다공성 멤브레인 사이에 고정하였다(위 참조)(도3B). 멤브레인과 커버슬립 사이의 최적 거리는 ~70 μm이었다. 폴리스티렌 비즈는 이 범위에서 시편의 두께를 설정하는 스페이서로사용되었다(도 3B).
유리 커버 슬립이 우물의 바닥의 상부 표면에 있는 상업적으로 사용할 수있는 6 개의 우물 플레이트가 없습니다. 따라서, 이 기능을 가진 맞춤형 플레이트의 제조를 위한 프로토콜이 개발되었다(도3B). 도 4는 배아 신장 배양의 대표적인형태(도 4A,D–F)및 신장 오르가노이드(도4B,C)를나타낸다. Movie 2는 FiZD 설정에서 배양된 마우스 배아 신장에서 내피 세포의 고해상도 타임랩스 이미징의 결과를 나타낸다. Movie 2의 오른쪽 패널은 이 방법을 사용하여 개별 셀의 배포와 마이그레이션을 모두 관찰할 수 있음을 보여 줍니다.
도 1: 뮤린 배아 신장을 닭 배아 CAM에 이식한다. E11.5 배아 마우스 신장의 xenotransplantation은 8일령 전오보 닭 배아로; 뮤린 배아 신장을 CAM에서 7일 동안 배양하였다. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1: 닭 배아 CAM에 이종이 이식 후 뮤린 배아 신장의 혈류. 뮤린 E11.5 배아 신장을 8일된 닭 배아의 CAM에 이종이 이식하고 7일 동안 배양시켰다. 영화는 7일째에 이종이식에서 닭의 혈류를 보여줍니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
그림 2: 닭 배아 CAM에 뮤린 배아 신장 이종이식. 뮤린 E11.5 배아 신장(m)은 8일 된 배아 닭 CAM(c)(즉, 실험)에 대한 지조배양배(즉, 대조군) 또는 이종이식으로 재배되었다. 배아 신장 재배 5일 후, 대조군 및 실험 샘플은 내피 마커 CD31(적색)에 대해 고정 및염색(A-E)및 핵(Hoechst; blue)(D, E)을하였다. (C)닭과 마우스 혈관 (화살촉) 사이의 아나스토모세.. (D,E) 네프론의 중간에서 하나의 공초점 슬라이스가 표시됩니다. (F)뮤린 E11.5 배아 신장을 7일 동안 유전자 변형 GFP-치킨 CAM으로 이식하고, CD-31(적색)에 염색하였다. 배율 막대 = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Z 방향 배분 방법을 수정했습니다. (a)시료가 그리드에 의해 지지되는 다공성 멤브레인상에서 자라는 전통배양방법 및 공기-액체 계면에서 배양을 유지한다. (B)새로운 FiZD 설정에서, 샘플은 유리 커버슬립과 트랜스웰 다공성 멤브레인 사이에서 부드럽게 압축되었다. 폴리에스테르 비드는 z 방향으로 조정된 시료의 두께를 조절하였다. 이 그림은 사아레라 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 새로운 FiZD 배양 방법에서 배아 신장 및 신장 오르가노이드 발달. 배아신장(A, D-F)및 신장 오르가노이드(B-C)는 새로운 FiZD 설정을 사용하여 재배하였다.B–C (A)FiZD 배양 7일째에 손상되지 않은 배아 마우스 신장의 브라이트필드 이미지. (B)FiZD 배양 7일째에 마우스 신장 오르가노이드의 브라이트필드 이미지. (C)MtmG(적색) 마우스 신장 오르가노이드를 새로운 FiZD 설정을 이용하여 4일 동안 배양하였다. 타임랩스 이미지 스택의 스냅샷은 개발 중인 네프론에서 Wnt4Cre-활성화된GFP(녹색) 식을 보여줍니다. (D)마우스 배아 신장을 새로운 FiZD 설정을 이용하여 7일 동안 배아하였다. 식스2(녹색) 및 Troma-1(Krt8, red) 염색은 각각 네프론 전구체 및 요도 싹(UB) 분기를 나타냈다. (E)마우스 배아 신장 기초는 새로운 FiZD 설정을 사용하여 12일 동안 배양하였다. Troma-1(적색)과 네프린(녹색)으로 염색하였고, UB 분기와 포도극을 각각 나타냈다. (F)Troma-1 + (적색) UB와 네프린 (녹색) + 포도 막의 고출력 배율이 있는(E)와동일한 샘플. 이 그림은 사아레라 외11에서수정되었습니다. 스케일 바 = A-D, F 100 μm; E 1,000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2: GFP로 표지된 신장 내피 세포는 새로운 FiZD 설치에서 성장하고 고해상도 공초점 현미경으로 관찰될 수 있습니다. E11.5 mTmG로부터의 배아 신장; Tie1Cre 마우스를 해부하고 새로운 FiZD 설정을 사용하여 6일 성장하였다. 영화는 내피 세포에서 Tie1Cre-유도된GFP 발현을 보여준다. 20 z 레이어의 스택은 10x / 0.45 목표를 사용하여 촬영되었으며 이미지는 15 분마다 얻어졌습니다. 영화에서는 5개의 GFP z 레이어와 하나의 밝은 필드 초점 평면이 병합됩니다. 오른쪽 패널은 발달 신장의 클로즈업을 보여줍니다. S자형 단계 네프론의 혈관 갈라진 부분으로 이동하는 내피 세포를 볼 수 있다. 오른쪽 패널에서 GFP z 레이어와 하나의 밝은 필드 초점 평면이 병합됩니다. 빠르게 움직이는 세포는15. GFP 신호는 또한 일부 혈액 세포에 의해 발현되었다. 복셀 크기 0.69 μm x 0.69 μm x 4.13 μm. 이 영화는 사아레라 외11에서수정되었습니다 . 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
2개의 상세한 프로토콜은 고전적인 신장 organotypic 문화 방법을 구체화하고, 전 생체 내 배아 신장 및 오르가노이드의 혈관 세포화, 확장된 발달 및 최적 4D (즉, 3D 심상 및 시간) 화상 진찰을 가능하게 합니다 제시됩니다. 이 섹션에서는 메서드의 중요한 단계를 중대하고 문제 해결에 대해 설명합니다.
다른 CAM 배양 방법과 이 개선된 치킨 CAM 배양 방법의 유의한 차이점은 CAM에 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 이종이식에서 맞춤형 미니저장소를 사용하는 것입니다. 수정된 트랜스웰 삽입의 멤브레인 바닥은 닭 CAM에 대한 샘플을 누르고 제자리에 유지합니다. 인서트의 측면은 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지의 저장소 역할을 합니다. 이 방법은 미니저장소를 배치할 수 있는 CAM의 더 큰 영역을 노출시키고 혈관화과정(12,,13)을시각적으로 쉽게 따를 수 있도록 하기 때문에, 엑스노이식을 전 오보 배양배배아용 닭 CAM을 강력하게 권장한다.
치킨 CAM 배양 방법의 단점은 이종이이식을 수행하기 위한 시간 창이 닭 배아의 CAM이 작동하기 전에 작동할 때 8-9일로 제한된다는 것입니다. 발달하는 데 더 긴 시간이 필요한 이식편은 따라서 다른 조직(예를 들어, 마우스 신장 캡슐)에 대한 이종이식으로 혈관화되어야 한다6. 공여자 조직의 직렬 이종이식은 이러한 긴 배양 시간 문제에 대한 해결책이 될 수 있다. 이 방법은 이식편 혈관 화 및 발달의 시간 경과 이미징을 위해 적응될 수 있지만, 먼저 장기 적인 이미징을 위한 미니 저장소 및 CAM의 안정화요건을 해결해야 합니다. 이러한 개선된 신장 이종이식 프로토콜의 주요 장점은 이 방법이 공여자 유래 내피 세포가 번창할 수 있는 조건을 제공한다는 것이다.
FiZD 프로토콜은 고해상도 공초점 현미경을 사용하여 생체 내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 장기 시간 경과 이미징을 위해 설계된 방법을 설명합니다. 설정의 경우 웰 및 인서트 치수가 일치하는 것이 중요합니다. 커버 슬립이 6 웰 플레이트의 바닥에 접착되고 삽입이 웰에 놓이면 삽입막이 유리에 닿아야 합니다. 이어서, 배양이 설정되면, 스페이서 비드는 막의 위치를 결정하고 결과적으로 배양기관 또는 오르가노이드의 두께를 결정한다. 이러한 이유로, 여분의 접착제를 제거하고 어떤 재료가 커버 유리를 만지지에서 인서트를 제한하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 커버 유리를 부착하기 위해 무독성 조직 접착제를 사용하는 것도 중요합니다. 접착제는 매우 강하게 부착되지 않으므로 플레이트를 조심스럽게 취급하는 것이 중요합니다. 플레이트를 재사용할 수 있으며 세척 단계에서 커버 유리가 분리되면 다시 접착 할 수 있습니다.
FiZD 화상 진찰 방법은 단 하나 세포 수준에 신 발생의 연구 를 허용합니다. 고해상도 타임랩스 이미지의 고품질을 통해 자동 세포 분절을 적용하여 신장 오르가노이드 및 신장 배양에서 세포 행동을 연구할 수 있습니다. 6 웰 플레이트의 상이한 웰에 위치한 여러 샘플은 상이한 배양 조건에서 동시에 연구될 수 있다. 이 기술은 스페이서 비드의 크기를 변경하여 조직 및 오르가노이드의 다양한 크기 및 유형에 대해 쉽게 변형 될 수있다; 이는 난소 세포배양체 14로입증되었다. 이 방법의 추가 최적화로, FiZD 설치를 최근에 간행된 미세 유체 접근법16과 결합하는 것은 신장 발달의 나중 단계에서 세포 형태 형성의 고해상도 현미경 분석에 매우 유익할 지도 모릅니다.
FiZD 방법의 한 가지 장점은 사용 가능한 배양 매체가 많고 이미징 1 주 동안 변경할 필요가 없다는 것입니다. 그러나 미디어 변경이 필요한 경우 인서트가 있는 개구부에서 매체를 쉽게 변경할 수 있습니다. FiZD 방법은 또한 현미경 목표에 가까운 견본을 가져온다는 점에서 그밖 기관 배양 방법 보다 우수합니다. 다른 널리 사용되는 배양 방법에서는 이미지 샘플과 목적 사이에 멤브레인 또는 필터 및 유리 판 바닥이 있는데, 정확한 고해상도이미징(17)을금지한다. FiZD 방법을 사용하면 살아있는 조직의 고해상도 이미지를 획득 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 수오멘 아카테미아 (핀란드 아카데미)에 의해 재정적으로 지원되었다 (206038, 121647, 250900, 260056; 우수 교부금 센터 2012-2017 251314), Munuaissätiö - 핀란드 신장 및 간 협회, 시그리드 주셀리우크센 Sätiö, 빅토리아스티프텔센, 핀란드의 스웨덴 문화 재단, 노보 노디스크, Syöpäjärjestöt (핀란드 암 학회), 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-혁신-1 EURenOmics 305608), 및 H2020 마리 Sklodowska-Curie 혁신적인 행동 "6" RE2. 저자는 파울라 하이퍼스, 요한나 케콜라티-리아스, 하넬 레크만에게 기술 지원을 해주셔서 감사합니다.
그림 3, 4 및 무비 2는 개발의허가를 받아 재인쇄됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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