Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Summary

Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo’s die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.

Abstract

Embryonale nier organotypic culturen, en vooral pluripotente stamcel-afgeleide nier organoïden, zijn uitstekende instrumenten voor het volgen van ontwikkelingsprocessen en modellering nierziekte. De modellen worden echter beperkt door een gebrek aan vascularisatie en functionaliteit. Om dit aan te pakken, werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de methode van xenografting cellen en weefsels aan het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo om vascularisatie en herstel van de bloedstroom te krijgen. De grafts zijn bedekt met op maat gemaakte minireservoirs die de monsters vast te stellen aan de CAM en hen te voorzien van cultuur medium dat de grafts beschermt tegen het drogen. De verbeterde cultuurmethode maakt het mogelijk xenografts tot 9 dagen te laten groeien. Het manuscript beschrijft ook hoe optimale omstandigheden te bieden voor langdurige confocale beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen met behulp van de eerder gepubliceerde Fixed Z-Direction (FiZD) methode. Deze methode comprimeert voorzichtig een embryonaal orgaan of organoïde tussen een glazen afdekking en membraan in een grote hoeveelheid medium en biedt uitstekende omstandigheden voor beeldvorming voor maximaal 12 dagen. Samen maken deze methoden vascularisatie en bloedtoevoer naar nierorganoïden en organotypic nierculturen mogelijk met verbeterde confocale beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn zeer gunstig voor het bestuderen van fundamentele en toegepaste functies van nieren ex vivo. Beide methoden zijn van toepassing op verschillende soorten weefsels en organoïden.

Introduction

Organotypic cultuur van embryonale nieren werd een belangrijk model om nefrogenese decennia geleden te bestuderen^1,2,3. Nierorganoïden vertegenwoordigen een geavanceerd modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling van gezonde en zieke nieren⁴. Het belangrijkste nadeel voor beide methoden is echter dat geen van beide methoden de belangrijkste functie van de nier recapituleert: bloedfiltratie. Nefrons en niervabulatuur ontwikkelen zich in nierorganoïden en organotypic culturen op dezelfde manier als vroege stadium in vivo ontwikkeling; echter, de glomeruli gevormd in vitro blijven avasculaire⁵. Vascularisatie van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden werd eerder in transplantatie-experimenten alleen onder in vivo omstandigheden aangetoond. Bijvoorbeeld, transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide nier-organoïden onder een muis niercapsule maakt de ontwikkeling van de nefron in de organoïde naar een functionele fase⁶.

Een tussenbenadering tussen zuiver in vitro culturen en in vivo transplantatiemethoden is xenotransplantatie naar de CAM van vogelembryo’s. Vascularisatie van intacte muis nier primordia is eerder aangetoond met behulp van dit systeem^7,8. Er werd echter ook aangetoond dat de niervasculatuur in de xenotransplanted murinenier was afgeleid van het gastheerendotheel, niet het transplantaat⁹. Deze observatie verminderde het potentieel van chimaerige (aviaire zoogdieren) modellen van embryonale nieren aanzienlijk om de ontwikkeling van de niervasculatuur te bestuderen, omdat de experimentele omstandigheden niet tolerant waren voor het overleven van donor-afgeleide endotheelcellen.

Gepresenteerd in het eerste deel van dit protocol is een verbeterde methode voor de teelt van muis embryonale nieren op CAM van vogeleieren, een combinatie van micromilieuomstandigheden van organotypic cultuur en xenotransplantatie. De belangrijkste verbetering ten opzichte van eerdere methoden is dat in plaats van het plaatsen van de muis embryonale nieren en nierorganoïden direct op de CAM, de implantatie gebied is bedekt met doorlatende minireservoirs gevuld met cultuur medium dat de getransplanteerde weefsel te leveren met voedingsstoffen en te beschermen tegen het drogen. Het slagingspercentage van de experimenten neemt aanzienlijk toe en de voorwaarden voor de ontwikkeling van vasculatuur van donoren verbeteren. Toepassing van deze methode op xenotransplant culturen resulteert in de ontwikkeling van glomeraire vasculatuur bestaat uit endogene endotheelcellen uit donornieren.

Gedetailleerde analyse van cellulaire morfogenese is een andere belangrijke toepassing van niercultuur modellen. Eerder gerapporteerde methoden voor time-lapse beeldverwerving van nierculturen zijn alleen voldoende voor analyse van de algehele morfologie en patronen van embryonale nieren, maar niet voor het bijhouden van individuele cellen¹⁰. Onlangs werd een nieuwe Fixed Z-Direction (FiZD) methode gericht op hoge resolutie confocale 3D time-lapse beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen beschreven¹¹. Bij deze methode worden de organoïden en embryonale organen voorzichtig samengeperst tussen een glazen afdekkingsslip en een doorlaatbaar membraan van een transwellinsert in een op maat ontworpen plaat totdat de dikte van het monster 70 μm bereikt, wat optimale optische omstandigheden voor beeldvorming biedt. In het tweede deel van de methoden wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de fabricage van een op maat gemaakte plaat en de opstelling van FiZD-experimenten voor organoïde beeldvorming op lange termijn.

Protocol

De verzorging en procedures van dieren waren in overeenstemming met de Finse nationale wetgeving voor het gebruik van proefdieren, het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (ETS 123) en EU-Richtlijn 86/609/EEG. 1. Vervaardiging van minireservoirs voor de teelt van embryonale nieren van muizen en nierorganoïden op kipCAM en het opzetten van xenotransplantatie-experimenten Gebruik transwell …

Representative Results

Het hier gepresenteerde CAM-cultuurprotocol maakte een zeer efficiënte vascularisatie van nierorganoïden en embryonale nieren mogelijk als gevolg van xenotransplantatie op kip CAM(figuur 1, film 1). Minireservoirs met kweekmedium leverden voedingsstoffen aan donorweefsel en beschermden het tegen het drogen gedurende de periode voorafgaand aan de juiste vascularisatie. Deze methode voorzag in tolerante voorwaarden voor donor-afgeleide endotheelcellen om te groeien. Daarom w…

Discussion

Er worden twee gedetailleerde protocollen gepresenteerd die de klassieke nierorganotypic-kweekmethode verfijnen en vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en optimale 4D-beeldvorming (d.w.z. 3D-beeld en tijd) van ex vivo embryonale nieren en organoïden mogelijk maken. In deze sectie worden de kritieke stappen in de methoden belicht en worden probleemoplossingbesproken.

Het belangrijke verschil tussen andere CAM-kweekmethoden en deze verbeterde kipCAM-kweekmethode is het gebruik van op maat g…

Materials

Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22×22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610