Summary
この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。
Abstract
胚性腎臓の有機的培養、特に多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、発達過程および腎臓病のモデリングに優れたツールである。しかし、モデルは血管化と機能性の欠如によって制限されています。これに対処するために、血液の血管化と回復を得るために鳥の胚の絨毛管内膜(CAM)に細胞および組織を異種移植する方法のための改良されたプロトコルが開発された。移植片はCAMにサンプルを固定し、乾燥から移植片を保護する培養媒体とそれらを供給するカスタムメイドのミニ貯蔵所と重ねられる。改善された培養法により、異種移植片は最大9日間増殖する。また、この原稿は、以前に発表された固定Z方向(FiZD)法を用いて、腎オルガノイドおよび有機的培養物の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供する方法についても説明しています。この方法は、ガラスカバースリップと膜の間の胚器官またはオルガノイドを大量の媒体で穏やかに圧縮し、最大12日間のイメージングに優れた条件を提供します。これらの方法は、共焦点イメージングを改善した腎オルガノイドおよび有機的な腎臓培養物への血管化および血流を可能にする。ここに記載されている方法は、腎臓ex vivoの基本的および応用機能を研究するために非常に有益である。どちらの方法も、様々なタイプの組織やオルガノイドに適用可能です。
Introduction
胚性腎臓のオルガノーチ培養は、数十年前2、2、3年前に腎生年月1日を研究する重要なモデルとなった。,3腎オルガノイドは、健康で病気の腎臓の発達を研究するための高度なモデルシステムを表す4.しかし、両方の方法の主な欠点は、どちらの方法も腎臓の主な機能である血液濾過を再現していないということです。腎血管系と腎血管系は、生体内開発の初期段階と同様に、腎オルガノイドおよび有機的培養で発達する。しかし、体外で形成された糸球体は血管5のままである。元生体胚性腎臓および腎組織性の血管化は、インビボ条件下でのみ移植実験において以前に実証された。例えば、マウス腎臓カプセルの下でヒト多能性幹細胞由来の腎オルガノイドを移植することにより、機能ステージ6へのオルガノイド中のネフロンの開発が可能になる。
純粋にインビトロ培養と生体内移植方法の中間的アプローチは、鳥類胚のCAMへの異種移植である。インタクトマウス腎臓原始の血管化は、このシステム77,88を用いて以前に実証されている。しかしながら、異種移植されたマウス腎臓における腎脈管系は、移植片9ではなく宿主内皮由来であったことも示された。この観察は、ドナー由来の内皮細胞の生存のために実験条件が非透過性であったため、胚性腎臓のキメラ(鳥類哺乳類)モデルの可能性を著しく低下させ、腎臓血管系の発達を研究した。
このプロトコルの最初の部分で提示された鳥卵のCAM上のマウス胚性腎臓の培養のための改善された方法である、organotypic培養と異種移植の微小環境条件を組み合わせた。以前の方法の主な改善は、マウスの胚性腎臓と腎オルガノイドをCAMに直接置く代わりに、移植領域が移植された組織を供給する培養培地で満たされた透過性ミニリザーバーで重ね合せることである栄養素を使用し、乾燥から保護します。実験の成功率は大幅に増加し、ドナー由来血管系の発達条件は改善する。この方法を異種移植培養物に適用すると、ドナー腎臓からの内因性内皮細胞から構成される糸球体血管系の発達が生じる。
細胞形態形成の詳細な分析は、腎臓培養モデルのもう一つの重要なアプリケーションです。腎臓培養のタイムラプス画像取得の以前に報告された方法は、胚性腎臓の全体的な形態およびパターニングの分析にのみ十分であるが、個々の細胞10を追跡するためのものではない。近年、腎オルガノイドとオルガノピック培養物の高解像度共焦点共焦点3Dタイムラプスイメージングを目的とした新規固定Z方向(FiZD)法が11に記載された。この方法では、オルガノイドと胚器官は、サンプルの厚さが70μmに達するまで、カスタム設計プレート内のガラスカバースリップと透過性のトランスウェルインサートの透過膜の間で穏やかに圧縮され、イメージングに最適な光学条件を提供します。方法の第2部では、カスタム設計プレートの製造と長期オルガノイドイメージングのためのFiZD実験の設定のための詳細なプロトコルが記載されている。
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Protocol
動物のケアと手順は、実験動物の使用に関するフィンランドの国内法、実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(ETS 123)、およびEU指令86/609/EECに従っていました。
1. 鶏CAM上でマウス胚性腎臓及び腎オルガノイドを培養するためのミニリザーバーの製造と異種移植実験の実施
- 6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたトランスウェル細胞培養インサートを使用してください。
注: 特定の実験に応じて、大小のミニ貯蔵所を使用できます。最大8つの胚性腎臓を異種移植したり、同じ鶏の胚に複数のミニ貯蔵所を置いたりする場合(例えば、同じ鶏CAM上の実験および制御サンプル)に小さなミニリザーバーを使用するのが最善です。 - 円形の鋸刃または手鋸を備えた回転式マルチツールを使用して、挿入物の側面を切り取り、透過性膜が取り付けられた高さ2mmのプラスチックリングを作成します。
- メスや鋭利なナイフでこれらのミニ貯水池の端を磨きます。
- ミニ貯蔵器を70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。
- ミニリザーバーをオートクレーブされた二重蒸留水で洗い、薄層フードで乾燥させます。
- PBSおよび培養培地(高グルコースDMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)でミニリザーバをリンスします。
- ペトリ皿にリザーバーを置き、膜を上に向けて培地の滴(600 μL/400 μL)の上に置きます。
- 解剖された外生体胚性腎臓または腎オルガノイドをピペットまたはガラス毛細管の助けを借りて膜上に均等に配置する。腎臓の周りに多くの液体を残さないようにしてください。
- サンプルを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターで2〜24時間膜に取り付け2ましょう。
注:最大8つのE11.5胚性マウス腎臓または腎臓オルガノイドは、小さなインサートに配置することができます。大きなインサートは、異種移植またはCAMのより広い領域上の細胞ヒドロゲル混合物に胚組織のより大きな部分が使用される場合に推奨される。 - 細胞培養インキュベーター12,13,13から以前に発表された方法に従って調製された8日間の元ovo培養胚鶏を取る。
- ミニリザーバをCAMに移して、移植片がCAMに向き、膜がそれらをオーバーレイするようにします。ミニリザーバをCAMの周囲に置き、鶏の胚を覆わないようにします。
注:トランスウェルインサートから製造された小型ミニリザーバを12ウェルプレートに使用する場合、最大3つのミニ貯蔵所を1つのCAMに置くことができます。 - 500 μL (6 ウェルインサート) または 300 μL (12 ウェルインサート) の培養液をミニリザーバに加えます。
- 最大9日間のチキンCAMでサンプルを栽培します。ミニリザーバの培養培地を毎日交換してください。
注:サンプルの血管の血管は移植後24-48時間で観察できます。
2. カスタムデザインプレートの製作とFiZD文化の設定
- 6ウェルプレートの底部に直径20mmの穴を開けます。
注:FiZD 実験では、16 mm の深さ(材料表で指定)を持つ 6 つのウェルプレートを使用してください。 - カウンターシンクドリルビット、メス、または鋭利なナイフで電気ドリルを使用して穴の縁(特に上側)を磨きます。
- プレートを70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。
- プレートをオートクレーブ二重蒸留水で洗い、無菌状態で乾燥させます。
- 70%エタノールで22mm x 22mmガラスカバーリップを十分に洗浄するか、Saarelaらの公表されたプロトコルに従ってきれいにしてください。
- 無毒なティッシュの接着剤を使用して6つの井戸の版の穴の上側にカバースリップを接着する。穴の周りに接着剤を塗布し、カバースリップをそっと置いてカバーを覆います。接着剤を乾燥させます。
- プレートを実体顕微鏡で検査し、必要に応じてカバーリップの表面から余分な乾燥接着剤を取り除きます。
メモ:カバースリップの上に接着剤がないことを確認して、サンプルの圧縮を確実にします。 - ポリスチレンビーズ(70 μm粒径)を等量のヒドロゲルと混合します。ウェルあたり50~100μLの体積で十分です。
注:ヒドロゲルとポリスチレンビーズの混合物を氷の上に保管してください。 - トランスウェルインサートを、膜を上にして解剖顕微鏡の下に置きます。
- サンプル(例えば、元の生体胚性腎臓または腎オルガノイド)を膜上に均等に配置する。
- 壊れやすい組織への損傷を避けるために、サンプルの隣にヒドロゲル/ポリスチレンビーズ混合物を慎重に追加します。
- トランスウェル挿入物を反転して、サンプルを組み立てた膜が下向きになるようにします。
- 修正された6ウェルプレートのウェルに挿入物をそっと置き、サンプルがビーズのレベルまで圧縮されるようにそっと押し下げます。
メモ:顕微鏡で圧縮の進行を追従してください。 - 挿入物を片手でウェルに少し押し付け、挿入物の周囲の3点ではんだ付け鉄でプラスチックを溶かしてプレートに固定します。
- インサートがプレートに固定されたら、2 mLの培養培地(DMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)をウェルに加え、残りのウェルをプレートに同じように組み立て続けます。
- 完成したプレートを逆回し顕微鏡のステージ上のインキュベーターに移して、タイムラプスイメージングを行います。
- 適切な実験設定を使用してサンプルのタイムラプスイメージングを行います。
注:タイムラプス実験中にプレートのウェル内の培養培地を交換する必要はありませんが、挿入物の側面の穴を通して簡単に行うことができます。
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Representative Results
ここで提示されるCAM培養プロトコルは、鶏CAMの異種移植の結果として腎オルガノイドおよび胚性腎臓の高効率な血管形成を可能にした(図1、動画1)。培養培地を含むミニリザーバは、ドナー組織に栄養素を供給し、適切な血管化前の期間中に乾燥から保護した。この方法は、ドナー由来の内皮細胞が増殖するための寛容な条件を提供した。したがって、移植された腎臓およびオルガノイドにおける腎血管系は、主に、排他的ではないが、ドナー特異的細胞によって表された(図2B、C、F)。CFより成熟した糸球体血管系は、腎性素性培養よりもCAMに移植された腎臓および腎オルガノイドで得られた(図2D、E)。E
FiZDプロトコルは、高解像度共焦点顕微鏡を用いた、エキビボ胚性腎臓および腎オルガノイドの長期のタイムラプスイメージング用に設計された方法である。Trowell14によって設計された古典的なorganotypic培養プロトコルでは、標本は金属グリッドによって支えられ、空気液体界面に保たれて、多孔質フィルターに置かれる(図3A)。この方法は、直立型または反転型の顕微鏡に最適ではありません。ここで提示される方法は、イメージング用の反転顕微鏡で機能するように特別に設計されました。試料を下からガラスカバースリップとトランスウェルインサートの多孔質膜(上記参照)の間に固定化した(図3B)。膜とカバースリップの間の最適な距離は〜70μmであったが、ポリスチレンビーズはこの範囲で試料の厚さを設定するスペーサーとして使用した(図3B)。
ガラスカバースリップがウェルの底面の上面に位置する6ウェルプレートは市販されていない。したがって、この機能を備えたカスタム設計プレートの製作用プロトコルが開発されました (図 3B)。図4は、胚性腎臓培養の代表的な形態(図4A、D–F)および腎オルガノイド(D図4B、C)を示す。FCムービー2は、FiZDセットアップで培養したマウス胚性腎臓における内皮細胞の高解像タイムラプスイメージングの結果を表す。ムービー 2の右側のパネルでは、この方法を使用して個々のセルの分布と移動の両方を観察できることを示しています。
図1:鶏胚CAMに異種移植したマウス胚性腎臓。E11.5胚性マウス腎臓を8日齢の元ovo鶏胚に異種移植する。マウス胚性腎臓をCAMで7日間培養した。スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:鶏胚CAMへの異種移植後のマウス胚性腎臓における血流。マウスE11.5胚性腎臓を8日前の鶏胚のCAMに異種移植し、7日間培養した。映画は7日目に異種移植片の鶏の血流を示しています。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
図2:鶏胚CAMに対するマウス胚性腎臓異種移植。マウスE11.5胚性腎臓(m)は、8日前の胚性鶏CAM(c)に組織語培養(すなわち対照)または異種移植として栽培された(すなわち、実験)。5日間の胚性腎臓培養の後、コントロールおよび実験サンプルを固定し、内皮マーカーCD31(赤)(A-E)および核(Hoechst;青)(D、E)について染色した。 (C) 鶏とマウスの血管の間のアナストモーゼス (矢頭).(D,E)ニーフロンの中央からの単一の共焦点スライスが示される。(F)マウスE11.5の異種移植E11.5胚性腎臓を7日間の遺伝子導入GFPチキンCAMに、CD-31(赤色)に染色した。スケールバー = A–B 100 μm;C-E 20 μm;F 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Z方向の培養方法を修正。(A)サンプルがグリッドで支えられ、空気と液体の界面で外植を保持する多孔質膜上に成長する伝統的な培養方法。(B)新しい FiZD セットアップでは、サンプルをガラスカバースリップとトランスウェル多孔質膜の間で静かに圧縮した。ポリエステルビーズは、Z方向に調整されたサンプルの厚さを制御しました。この図は、Saarelaら11.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:新しいFiZD培養法における胚性腎臓および腎臓オルガノイドの発達胚性腎臓(A、D-F)および腎臓オルガノイドA(B-C)は、新しいFiZDセットアップを用いて栽培された。(A)FiZD培養7日目の無傷の胚性マウス腎臓のブライトフィールド画像。(B) FiZD培養7日目のマウス腎臓オルガノイドのブライトフィールド画像。(C)MtmG (赤) マウスの腎臓オルガノイドは、新しいFiZDセットアップを使用して4日間栽培された。タイムラプス画像スタックのスナップショットは、開発中のネフロンにおけるWnt4Cre活性化GFP(緑色)発現を示しています。(D)新しいFiZDセットアップを用いて、マウス胚性腎臓を7日間培養した。62(緑色)およびトロマ-1(Krt8、赤色)染色は、それぞれネフロン前駆体及び尿管芽(UB)分岐を示した。(E)新しいFiZDセットアップを用いて12日間マウス胚性腎臓初歩を培養した。Troma-1(赤)とニーフリン(緑色)で染色し、UB分岐とポドサイトをそれぞれ示した。(F) Troma-1+(赤)UBとネフリン(緑)+ポドサイトの高出力倍率を有する(E)と同じサンプル。この図は、Saarelaら11.スケールバー = A-D, F 100 μm;E 1,000 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ムービー2:GFPで標識された腎内皮細胞は、新しいFiZDセットアップで増殖し、高解像度共焦点顕微鏡で観察することができます。E11.5 mTmGからの胚性腎臓;Tie1Creマウスを解剖し、新しいFiZDセットアップを使用して6日間増殖させた。映画は、内皮細胞におけるTie1Cre誘導GFP発現を示しています。20 Z層のスタックは、15分ごとに取得された画像で、10x / 0.45の目的を使用して撮影されました。映画では、5つのGFP Z層と1つの明るいフィールドフォーカルプレーンがマージされています。右側のパネルは、発達中の腎臓のクローズアップを示しています。S字型のステージニーフロンの血管裂け目に移行する内皮細胞が見られる。右側のパネルでは、GFP Z層と明視野焦点面が1つマージされます。急速に動く細胞は、マクロファージ15である可能性が高い。GFP シグナルは、いくつかの血液細胞によっても発現した。ボクセルサイズ 0.69 μm x 0.69 μm x 4.13 μmこの映画は、サアレラら11から変更されています。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
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Discussion
古典的な腎性素培養法を改良し、血管化、拡張開発、および最適4D(すなわち、3D画像および時間)ex vivo胚性腎臓およびオルガノイドのイメージングを可能にする2つの詳細なプロトコルが提示される。このセクションでは、この方法の重要な手順を説明し、トラブルシューティングについて説明します。
他のCAM培養法とこの改良された鶏CAM培養法との有意な違いは、CAMへの胚性腎臓および腎臓オルガノイドの異種移植におけるカスタムメイドのミニリザーバーの使用である。変更されたトランスウェルインサートの膜底部は、サンプルを鶏CAMに対して押し付け、所定の位置に保ちます。挿入物の側面は、乾燥から移植片を保護する培養培地のための貯蔵所として機能する。この方法は、ミニ貯蔵所を配置することができるCAMのより広い領域を露出させ、血管化プロセス12、13に視覚的に従うことを容易にするので、13元ovo培養胚鶏CAMへの異種移植が強く推奨される。
鶏CAM培養法の欠点は、異種移植を行うための時間枠が、鶏胚のCAMが分解を開始する前に機能する8〜9日に制限される点である。したがって、開発に長い時間を要する移植片は、異なる組織(例えば、マウス腎臓カプセル)6に異種移植によって血管化されるべきである。ドナー組織の連続異種移植は、この長いインキュベーション時間の問題の解決策である可能性があります。この方法は、移植片の血管化および発達のタイムラプスイメージングに適応することができるが、最初に長期的なイメージングのためのミニ貯蔵所およびCAMの安定化のための要件に対処しなければならない。この改良された鶏CAMへの腎異種移植プロトコルの主な利点は、この方法がドナー由来の内皮細胞が繁栄するための条件を提供することです。
FiZDプロトコルは、高解像度共焦点顕微鏡を用いた、エキビボ胚性腎臓および腎オルガノイドの長期タイムラプスイメージング用に設計された方法を記述する。セットアップのためには井戸と挿入の寸法が一致することが重要です。カバースリップが6ウェルプレートの底部に接着され、インサートがウェルに置かれると、挿入物の膜がガラスに触れるはずです。そして、培養がセットアップされると、スペーサービーズは膜の位置を決定し、結果的に培養された器官またはオルガノイドの厚さを決定する。このため、余分な接着剤を除去し、材料がカバーガラスに触れることから挿入物を制限していないかどうかを確認することが重要です。また、カバーガラスを取り付けるために、無毒なティッシュ接着剤を使用することも重要です。接着剤はあまり強く付着しないので、プレートを注意深く扱う必要があります。プレートは再利用でき、洗浄工程中にカバーガラスが取り外された場合は接着することができます。
FiZDイメージング法により、単一細胞レベルでの腎形成の研究が可能です。高解像度のタイムラプス画像の高品質は、腎オルガノイドや腎臓培養における細胞行動を研究するために、自動細胞セグメンテーションの適用を可能にします。6ウェルプレートの異なる井戸に位置するいくつかのサンプルは、異なる培養条件で同時に研究することができます。この技術は、スペーサービーズのサイズを変更することで、組織やオルガノイドの異なるサイズと種類に対して簡単に変更することができます。これは卵巣細胞培養14で実証された。この方法のさらなる最適化として、FiZDセットアップと最近発表されたマイクロ流体アプローチ16を組み合わせることは、腎臓開発の後期段階における細胞形態形成の高解像度顕微鏡的分析にとって非常に有益である可能性がある。
FiZD法の利点の1つは、利用可能な培養培地がたくさんあり、イメージングの1週間の間にそれを変更する必要がなされないことです。それでも、メディアの変更が必要な場合、メディアは挿入物の壁の開口部から簡単に変更できます。FiZD法は、標本を顕微鏡の目的に近づけるという他の臓器培養法よりも優れています。他の広く使用されている培養法では、画像化されたサンプルと目的との間に膜またはフィルターとガラス板底があり、正確な高解像度イメージング17を禁止する。FiZD法を用いて、生体組織の高解像度画像を取得することが可能です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、スオメン・アカテミア(フィンランドアカデミー)(206038、121647、250900、260056)によって財政的に支援されました。センター・オブ・エクセレンス助成金2012-2017 251314、ムヌアイサテオ - フィンランド腎臓肝臓協会、シグリッド・ジュセリュクセン・セーティオ、ビクトリアスティフテルセン、フィンランドのスウェーデン文化財団、 ノボノルディスク、シェーパヤイェシュト(フィンランド癌学会)、欧州共同体第7枠組みプログラム(FP7/2007-2013;FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608)、H2020マリー・スクロスカ・キュリー・アクション・トレーニング・イノヴェーティナル・ネットワーク「RETRACT3著者らはポーラ・ハイプス、ヨハンナ・ケコラハティ=リヤス、ハンネレ・ヘルクマンの技術支援に感謝している。
図3、4、映画2は開発の許可を得て復刻される。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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