Summary
Palmitolerisering innebär införlivande av en 16-karbon palmitat moiety till cysteinrester av målproteiner på ett reversibelt sätt. Här beskriver vi en biokemisk metod, acyl-PEGyl utbyte gel skift (APEGS) analys, att undersöka palmitoylering tillstånd av något protein av intresse för mus hjärnan lysates.
Abstract
Aktivitetsberoende förändringar i nivåerna av synaptiska AMPA-receptorer (AMPARs) inom den postsynaptiska densiteten (PSD) tros representera en cellulär mekanism för inlärning och minne. Palmitolering reglerar lokalisering och funktion av många synaptiska proteiner inklusive AMPA-Rs, hjälpfaktorer och synaptiska byggnadsställningar på ett aktivitetsberoende sätt. Vi identifierade synaps differentiering inducerad gen (SynDIG) familj av fyra gener (SynDIG1-4) kodning hjärnan-specifika transmembrane proteiner som associerar med AMPARs och reglera synaps styrka. SynDIG1 är palmitoylerad vid två cysteinrester belägna vid positionerna 191 och 192 i regionen juxta-transmembrane som är viktig för verksamhetsberoende excitatorisk synapsutveckling. Här beskriver vi en innovativ biokemisk metod, acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) analys, att undersöka palmitolering tillstånd av något protein av intresse och visa dess nytta med SynDIG familj av proteiner i mus hjärnan lysates.
Introduction
S-palmitoylation är en reversibel post-translationell modifiering av målproteiner som reglerar stabil membranassociation, proteinhandel och protein-proteininteraktioner1. Det innebär tillsats av en 16-kol palmitat moiety till cystein rester via thioester länkage katalyseras av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Många synaptiska proteiner i hjärnan är palmitoylerade, inklusive AMPA-Rs och PSD-95, på ett aktivitetsberoende sätt att reglera stabilitet, lokalisering och funktion2,3,4. Förändringar i nivåerna av synaptiska AMPARs i PSD via interaktion av hjälpfaktorer med synaptiska byggnadsställningar såsom PSD-95 ligger till grund för synaptisk plasticitet; Således ger metoder för att bestämma palmitoleriseringstillståndet hos synaptiska proteiner viktig insikt i mekanismer för synaptisk plasticitet.
Tidigare har vi identifierat SynDIG-familjen av fyra gener (SynDIG1-4) kodande hjärnspecifika transmembranproteiner som associerar med AMPARs5. Överuttryck eller knock-down av SynDIG1 i dissocierade råtta hippocampus nervceller ökar eller minskar, respektive, AMPA-R synaps storlek och antal med ~ 50% som detekteras med hjälp av immuncytokemi och elektrofysiologi5. Vi använde acyl-biotin utbyte (ABE) analys för att visa att SynDIG1 är palmitoylerade vid två bevarade juxta-transmembrane Cys rester (finns i alla SynDIG proteiner) på ett verksamhetsberoende sätt att reglera stabilitet, lokalisering och funktion6. ABE-analysen bygger på utbyte av biotin mot cysteiner som skyddas genom modifiering och efterföljande rening av affinitet7. Här beskriver vi en innovativ biokemisk metod, acyl-PEGyl utbyte gel skift (APEGS) analys8,9,10,11,12, som inte kräver affinitet rening och i stället använder förändringar i gel rörlighet för att bestämma antalet ändringar för ett protein av intresse. Protokollet beskrivs för undersökning av endogena membranproteiner från mushjärna för vilka lämpliga antikroppar finns tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök följde riktlinjer som fastställts av National Institutes of Health (NIH) och har godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee vid University of California, Davis.
1. Beredning av mushjärnmembran
- Halshugga musen med hjälp av en giljotinapparat och dissekera hjärnan ut snabbt (i <1 min, om möjligt, för att minimera palmitoylering förändringar som kan uppstå under dissekering förfarande). Homogenisera omedelbart i 10 ml homogeniseringsbuffert (tabell 1) i en glashomogenisator (~12 slag) på is.
- Centrifuglyseras i 15 min vid 1 400 x g vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt rör på is. Resuspend pelleten (~ 6 slag) i en lika stor mängd homogenisering buffert och centrifug vid 710 x g för 10 min vid 4 °C.
- Kombinera supernatanterna från steg 1.2 och centrifugen vid 40 000 x g i 20 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten (cytosolisk fraktion) och återsuspend pelleted membranet (P2) fraktion i homogenisering buffert.
OBS: Proverna kan blinkas och förvaras vid -80 °C för senare användning. - Utför en bicinchoninic syra (BCA) analys till quantitate proteinnivåer. För APEGS-analysen, börja med ~100−200 mg protein (maximalt 250 mg) i en volym av 470 μL buffert A (tabell 1) i ett 1,5 ml-rör. Sonikera och centrifug på >13 000 x g i 10 min vid 25 °C för att avlägsna olösligt protein. Överför lösligt protein till ett nytt 1,5 ml-rör.
2. Acyl-PEGyl utbyte gel-shift (APEGS) analys
- Stör disulfid obligationer och blockera fria cysteiner.
- Störa disulfidbindningar genom att inkubera i 25 mM tris(2-karboxyetyl)fosfin (TCEP; 25 μL, tillsats från en stamlösning; Tabell 1) 60 min vid 55 °C.
- Blockfria cysteiner med 50 mM N-etylmaleimid (NEM; 12,5 μL, tillsatta från en stamlösning. Tabell 1) rumstemperatur i 3 timmar.
OBS: Reaktionen kan förlängas över natten.
- Utför utfällning av kloroform metanol (CM).
- Överför proteinlösningen från 1,5 ml-röret till ett polypropylen- eller glasrör som kan centrifugeras i en svängande skopa rotor med blygsam hastighet. Ett 5 ml-rör är idealiskt. Tillsätt fyra volymer (2 ml) metanol (MeOH) och virvel kort.
- Tillsätt två volymer (1 ml) kloroform och virvel kort.
- Tillsätt tre volymer (1,5 ml) dH2O och virvel kort.
- Centrifugera proverna vid 3 000 x g i 30 min vid 25 °C i en svängande skopa.
- Ta försiktigt bort och kassera den övre fasen.
- Tillsätt 3 volymer (1,5 ml) MeOH och blanda försiktigt men noggrant, var noga med att inte fragmentera den ogenomskinliga proteinpannkakan.
- Centrifugera vid 3 000 x g i 10 min vid 25 °C i en svängande skopa.
- Med hjälp av ett serologiskt rör av glas tar du bort så mycket av toppfasen som möjligt utan att störa proteinpannkakan.
- Skölj försiktigt pelleten med 1 ml MeOH.
- Lufttorka pelleten i minst 10 min.
OBS: Torkad pellet kan förvaras vid -20 °C.
- Utför klyvning av palmitoyl-tioester kopplingar med hydroxylamin (NH2OH, HAM).
- Resuspend protein fällning i 125 μL buffert A och sonikerat kort. Centrifugera vid >13 000 x g i 10 min vid 25 °C för att avlägsna olösligt material. Överför lösligt protein till ett nytt 1,5 ml-rör.
- Tillsätt 375 μl buffert H (HAM+; Tabell 1) eller buffert T (HAM-; Tabell 1) och inkubera prover i 60 min vid 25 °C.
- Upprepa CM-nederbörden som beskrivs i steg 2.2.
OBS: Torkad pellet kan förvaras vid -20 °C. - Tillsätt mPEG till oskyddade cysteiner.
- Resuspend pellet i 100 μL buffert A som innehåller 10 mM TCEP. Överför till ett 1,5 ml-rör.
OBS: Det är normalt att betydande förlust av protein har inträffat under CM nederbörd steg. Alla efterföljande steg kommer att utföras i ett 1,5 ml-rör, vilket begränsar proteinvolymen till maximalt ~120−130 μL. Detta kommer att minska proteinförlust under den slutliga CM nederbörd. - Tillsätt 20 mM mPEG-5k (25 μL, tillsats från en stamlösning; Tabell 1) proteinprov och blandning genom pipettering. Inkubera i 60 min vid 25 °C med end-over-end rotation.
- För att avlägsna oregistrerad mPEG-5k, utför CM-utfällning enligt beskrivningen i steg 2.2 med hjälp av dessa justerade volymer: 4 volymer MeOH (500 μL), 2 volymer kloroform (250 μL) och 3 volymer dH2O (375 μL). Centrifug vid >13 000 x g i 10 min vid 25 °C.
- Ta försiktigt bort den övre fasen som tidigare, undvika den tjocka, flocculent pannkaka. Tillsätt 1 ml MeOH och blanda försiktigt men noggrant. Centrifug vid >13 000 x g i 10 min vid 25 °C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och skölj pelleten med 1 ml MeOH. Centrifug vid >13 000 x g i 10 min vid 25 °C. Lufttork pellets.
OBS: Torkad pellet kan förvaras vid -20 °C. - Resuspend den torkade pelleten i 50 μL buffert A (utan TCEP eller något reduktionsmedel). Reservera 5 μl för BCA-proteinmängdering. Efter kvantationen ska du lägga till en lämplig mängd 4x Laemmli-provbuffert och, beroende på det protein som är av intresse, eventuellt värma provet till 70−100 °C i 10 minuter.
OBS: Kokning kan orsaka aggregering av vissa membranproteiner.
- Resuspend pellet i 100 μL buffert A som innehåller 10 mM TCEP. Överför till ett 1,5 ml-rör.
3. Västerländsk blot analys av PEGylated proteiner
- Lasta provet på en natriumdydecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) gel13.
OBS: I detta protokoll användes 10% polyakrylamid. - Använd standardprotokoll för separation, överföring och detektion för western blotting14.
- Använd densitometri14 för att bestämma de relativa mängderna PEGylated kontra nonPEGylated proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunoblotting med antikroppar mot protein av intresse avslöjar palmitoylerat tillstånd (icke, singly, dubbelt, etc.) i mus hjärnan lysates som bestäms av rörlighet skift jämfört med prover där HAM inte ingick. Tidigare hade vi visat att SynDIG1 var palmitoylerade på två platser med HJÄLP av ABE-analysen6; Vi kunde dock inte avgöra om båda platserna har modifierats i hjärnvävnad. Här visar vi att SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 och Prrt2 är palmitoylerade i mushjärna och att de har två potentiella palmitoyleringsplatser (figur 1). Intressant, varje protein har en annan palmitoylation tillstånd i mus hjärnan baserat på signalen för icke, enskilt och dubbelt palmitoylerat protein. Densitometri analys av blots ger kvantitativ information om palmitoylerade tillstånd.
Figur 1: Detektion av PEGylated protein arter i musmembran preparat. Mus hjärnor dissekerades snabbt och homogeniseras omedelbart. P2 membran fraktioner utsattes för APEGs analysen som beskrivs i detta protokoll. I detta experiment separerades postnatala dag 18 (P18) med en 10% SDS-PAGE gel och immunoblotted och sonderade med antikroppar mot SynDIG1 (SD1), Prrt2 och SynDIG4 (SD4). Symboler indikerar protein som inte är palmitoylerat (•), palmitoylerat singly (*) eller dubbelt (**). Förekomsten av svaga band i HAM (-) förhållanden tyder antingen på en ofullständig minskning av disulfid obligationer eller ofullständig blockering av fria cysteiner av NEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Komponenter | Arbetar conc. | Kommentarer |
| Homogenisering | 0,32 M sackaros, 1 mM Tris pH 7,2, 1 mM MgCl2 | Tillsätt PMSF och proteashämmare omedelbart före användning. | |
| Buffert A | PBS pH 7,2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w / v) | Tillsätt PMSF och proteashämmare omedelbart före användning. | |
| TCEP-lösning | 500 mM TCEP i DDH2O (pH 7.2) | 25 mM | Lägg till 10 N NaOH för att öka pH. |
| NEM-lösning | 2,0 M NEM i 100% etanol | 50 mM | Förbered dig på det här. |
| Buffert H (HAM+) | 1,33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 (w/v) | 1,0 M | Förbered dig på det här. |
| Buffert T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w /v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k i ddH2O | 20 mM | Blanda väl. Mycket trögflytande. |
Tabell 1: Lösningar som används för APEGS-analys. Homogeniseringsbuffert och buffert A kan förberedas i förväg. Tillsätt dock proteashämmare och fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) omedelbart före användning. Alla andra lösningar bör beredas färska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt tidigare arbete använde vi ABE-analysen för att visa att SynDIG1 är palmitoylerat vid två bevarade juxta-transmembrane Cys rester (finns i alla SynDIG-proteiner) på ett aktivitetsberoende sätt för att reglera stabilitet, lokalisering och funktion6. En begränsning är att ABE-analysen kräver affinitetsrening med agarose hartser konjugerade till avidin moieties som det sista steget i förfarandet, vilket resulterar i betydande förlust av signal som komplicerar kvantitativ analys. Dessutom kan ABE-analysen inte skilja om ett protein palmitoyleras en gång eller på flera ställen.
Här använder vi APEGS-analysen8,9,10,11,12 för att bestämma palmitoleringstillståndet för AMPAR-extratransmembranproteinerna SynDIG1 och de relaterade proteinerna SynDIG4 (även känd som Prrt1) och Prrt2 från mushjärnextrakt; Analysen kan dock appliceras på vilket membranprotein som helst för vilket en högkvalitativ och specifik antikropp som är lämplig för västra blotting finns tillgänglig. Användning av hjärnmembran från vilda typ (WT) och knockout (KO) möss ger en idealisk kontroll för antikroppar specificitet som vi har visat för antikroppar mot SynDIG115 och SynDIG416. Utföra APEGS-analysen med hjärnlystnater från WT- och KO-möss ger en viktig kontroll för antikroppssub specificitet i denna metod. Denna metod skulle också kunna tillämpas på olika membranfraktioner som erhållits via differentialcentrifugering följt av APEGS-analysen för att undersöka den subcellulära lokaliseringen av det protein som är av intresse.
Ett kritiskt steg i APEGS-analysen är CM-nederbörd, vars syfte är att avlägsna kemikalier (NEM och HAM) från att störa efterföljande nedströmsreaktioner. Även om det är möjligt att utföra CM-utfällning i ett 1,5 ml-rör, bör användningen av större rör och volymer ge mer optimala resultat. Samtidigt, delvis på grund av flera CM nederbörd, bör man förvänta sig en betydande förlust av protein från början till. Detta kan leda till uppenbara variationer i de totala proteinnivåerna i minus- och plus-HAM-förhållandena.
Som illustreras i figur 1ger tillsatsen mPEG-5k (5 kDa) inte nödvändigtvis en linjär förskjutning på en immunoblot. Detta kan ha fördelar med att lösa proteiner som palmitoyleras på flera platser. Dessutom tyder förekomsten av band på platser för mobilitetsförskjutningar under de negativa förhållandena i HAM antingen på en ofullständig minskning av disulfidobligationer eller ofullständig blockering av fria cysteiner från NEM. Alternativt kan uppenbara skiftade band i HAM:s negativa tillstånd tyda på att fria cysteiner inom ett visst protein är svåra att blockera. Således kan ytterligare optimering av blockeringssteget krävas om endast en liten andel av det totala proteinet palmitoyleras i motsats till SynDIG1, SynDIG4 och Prrt2 där majoriteten av proteinet antingen är slug eller dubbelt palmitoylerad (figur 1).
Denna metod är inte begränsad till mus hjärnan lysates. Till exempel har denna metod använts för att skärmen för depalmitoylating enzymer för PSD-95 uttryckt i heterologa celler9. Uttryck av proteiner i heterologa celler möjliggör också bestämning av den exakta platsen för modifiering via plats-riktad mutagenesis. Denna metod informerade också rollen av den synaptiska byggnadsställningen AKAP150 i synaptisk plasticitet17,18, visar en bred tillämpning i neurovetenskap.
Det är viktigt att notera att APEGS-analysen inte är exklusiv för 16-karbon palmitat moieties eftersom analysen kommer att upptäcka andra långa fett-acyl kopplingar som är föremål för klyvning och ersätts av mPEG. För att fastställa palmitate modifiering kräver slutgiltigt ytterligare experiment såsom metabolisk märkning med tritiated palmitate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar K. Woolfrey för råd och input på APEGS-analysen. Dessa studier finansierades genom forskningsanslag till E.D. från Whitehall Foundation och NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al.
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
