Summary
Palmitoylation innebærer inkorporering av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester av målproteiner på en reversibel måte. Her beskriver vi en biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av ethvert protein av interesse for mus hjernen lysates.
Abstract
Aktivitetsavhengige endringer i nivåene av synaptiske AMPA-reseptorer (AMPARs) innenfor den postsynaptiske tettheten (PSD) antas å representere en cellulær mekanisme for læring og minne. Palmitoylation regulerer lokalisering og funksjon av mange synaptiske proteiner, inkludert AMPA-Rs, hjelpefaktorer og synaptiske stillas på en aktivitetsavhengig måte. Vi identifiserte synapsedifferensieringsindusertgen (SynDIG) av fire gener (SynDIG1-4) koding hjernespesifikke transmembrane proteiner som forbinder med AMPARs og regulerer synapsestyrke. SynDIG1 er palmitoylated ved to cysteinrester som ligger i stillinger 191 og 192 i den juxta-transmembrane regionen viktig for aktivitetsavhengig spenningssynapse utvikling. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av noe protein av interesse og demonstrere sin nytte med SynDIG familien av proteiner i mus hjernen lysates.
Introduction
S-palmitoylering er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av målproteiner som regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraksjoner1. Det innebærer tillegg av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester via thioester linkage katalysert av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitoylert, inkludert AMPA-Rs og PSD-95, på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon2,3,4. Endringer i nivåene av synaptiske AMPARs i PSD via interaksjon av hjelpefaktorer med synaptiske stillas som PSD-95 ligger til grunn for synaptisk plastisitet; dermed gir metoder for å bestemme palmitoyleringstilstanden til synaptiske proteiner viktig innsikt i mekanismer for synaptisk plastisitet.
Tidligere identifiserte vi SynDIG-familien med fire gener (SynDIG1-4) koding av hjernespesifikke transmembranproteiner som forbinder med AMPARs5. Overexpression eller knock-down av SynDIG1 i dissosierte rotte hippocampal nevroner øker eller reduseres, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og nummer med ~ 50% som detektert ved hjelp av immuncytokjemi og elektrofysiologi5. Vi benyttet acyl-biotin utveksling (ABE) analyse for å vise at SynDIG1 er palmitoylated på to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering, og funksjon6. ABE-analysen er avhengig av utveksling av biotin på cysteiner beskyttet av modifikasjon og påfølgende affinitetsrensing7. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse8,9,10,11,12, som ikke krever affinitet rensing og i stedet benytter endringer i gel mobilitet for å bestemme antall modifikasjoner for et protein av interesse. Protokollen er beskrevet for undersøkelse av endogene membranproteiner fra musehjernen som egnede antistoffer er tilgjengelige for.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer fulgte retningslinjer fastsatt av National Institutes of Health (NIH) og har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis.
1. Forberedelse av mus hjernemembraner
- Halshugge musen ved hjelp av et giljotinapparat og dissekere hjernen ut raskt (i <1 min, om mulig, for å minimere palmitoyleringsendringer som kan oppstå under disseksjonsprosedyren). Homogeniser umiddelbart i 10 ml homogeniseringsbuffer (Tabell 1) i en glasshomogenisator (~12 slag) på is.
- Sentrifuge lysates i 15 min ved 1400 x g ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nytt rør på isen. Resuspender pelleten (~6 slag) i et likt volum av homogeniseringsbuffer og sentrifuge ved 710 x g i 10 min ved 4 °C.
- Kombiner supernatrantene fra trinn 1,2 og sentrifuge ved 40 000 x g i 20 min ved 4 °C.
- Kast den supernatant (cytosolic fraksjon) og resuspend er avstøtende membran (P2) fraksjon i homogeniseringbuffer.
MERK: Prøvene kan bli slukkes og oppbevares ved -80 °C for senere bruk. - Utfør en bicinchoninsyre (BCA) analyse for å kvantatproteinnivåer. For APEGS-analysen begynner du med +100−200 mg protein (maksimalt 250 mg) i et volum på 470 μL buffer A (tabell 1) i et 1,5 ml rør. Sonicate og sentrifuge ved > 13 000 x g i 10 min ved 25 °C for å fjerne uoppløselig protein. Overfør løsebilisert protein til et nytt 1,5 ml rør.
2. Acyl-PEGyl utveksling gel-shift (APEGS) analyse
- Forstyrre disulfid obligasjoner og blokkere gratis cysteines.
- Forstyrre disulfid obligasjoner ved å inkubere i 25 mM tris (2-carboxyethyl)fosfin (TCEP; 25 μL, lagt fra en aksjeløsning; Tabell 1) 60 min ved 55 °C.
- Blokkfri cystein med 50 mM N-etylmaleimid (NEM; 12,5 μL, tilsatt fra en lagerløsning; Tabell 1) ved romtemperatur i 3 t.
MERK: Reaksjonen kan forlenges over natten.
- Utfør kloroform metanol (CM) nedbør.
- Overfør proteinoppløsningen fra 1,5 ml rør til et polypropylen- eller glassrør som kan sentrifugeres i en svingende bøtterotor med beskjeden hastighet. Et 5 ml rør er ideelt. Tilsett fire bind (2 ml) metanol (MeOH) og vortex kort.
- Tilsett to volumer (1 ml) kloroform og vortex kort.
- Tilsett tre bind (1,5 ml) dH2O og vortex kort.
- Sentrifugerprøvene ved 3000 x g i 30 min ved 25 °C i en svingende bøtterotor.
- Fjern og kast den øvre fasen forsiktig.
- Tilsett 3 bind (1,5 ml) meoh og bland forsiktig, men grundig, vær forsiktig så du ikke fragmenterer den ugjennomsiktige proteinpannekaken.
- Sentrifuge ved 3000 x g i 10 min ved 25 °C i en svingende bøtterotor.
- Bruk et glassserologisk rør, fjern så mye av toppfasen som mulig uten å forstyrre proteinpannekaken.
- Skyll pelleten forsiktig med 1 ml MeOH.
- Lufttørk pelleten i minst 10 min.
MERK: Tørket pellet kan oppbevares ved -20 °C.
- Utfør spalting av palmitoyl-tioester koblinger med hydroksylamin (NH2OH, HAM).
- Resuspender proteinutfelling i 125 μL buffer A og sonikere kort. Sentrifuge ved >13 000 x g i 10 min ved 25 °C for å fjerne uoppløselig materiale. Overfør løsebilisert protein til et nytt 1,5 ml rør.
- Tilsett 375 μL buffer H (HAM+; Tabell 1) eller buffer T (HAM-; Tabell 1) og inkubere prøver i 60 min ved 25 °C.
- Gjenta CM nedbør beskrevet i trinn 2.2.
MERK: Tørket pellet kan oppbevares ved -20 °C. - Legg mPEG til ubeskyttede cysteiner.
- Resuspender pellet i 100 μL buffer A som inneholder 10 mM TCEP. Overfør til et 1,5 ml rør.
MERK: Det er normalt at betydelig tap av protein har skjedd under CM nedbørstrinn. Alle påfølgende trinn vil bli utført i et 1,5 ml rør, noe som begrenser volumet av protein til maksimalt ~ 120-130 μL. Dette vil redusere proteintap under den endelige CM nedbøren. - Tilsett 20 mPEG-5k (25 μL, tilsatt fra en lagerløsning; Tabell 1) proteinprøve og blande si ved pipettering. Inkuber i 60 min ved 25 °C med ende-over-ende rotasjon.
- Hvis du vil fjerne ikke-inkorporerte mPEG-5k, utfør CM-nedbør som beskrevet i trinn 2.2 ved hjelp av disse justerte volumene: 4 volumer MeOH (500 μL), 2 volumer kloroform (250 μL) og 3 volumer dH2O (375 μL). Sentrifuge ved >13 000 x g i 10 min ved 25 °C.
- Fjern forsiktig den øvre fasen som før, unngå den tykke, flocculent pannekaken. Tilsett 1 ml MeOH og bland forsiktig, men grundig. Sentrifuge ved >13 000 x g i 10 min ved 25 °C.
- Fjern forsiktig supernatanten og skyll pelleten med 1 ml MeOH. Sentrifuge ved >13 000 x g i 10 min ved 25 °C. Lufttørr pellet.
MERK: Tørket pellet kan oppbevares ved -20 °C. - Resuspender den tørkede pelleten i 50 μL buffer A (uten TCEP eller et reduksjonsmiddel). Reserve 5 μL for BCA proteinkvantitet. Etter kvantasjon, legg til en passende mengde 4x Laemmli prøvebuffer og, avhengig av protein av interesse, potensielt varme prøven til 70-100 °C i 10 min.
MERK: Koking kan forårsake aggregering av noen membranproteiner.
- Resuspender pellet i 100 μL buffer A som inneholder 10 mM TCEP. Overfør til et 1,5 ml rør.
3. Vestlig blot analyse av PEGylated proteiner
- Last prøven på en natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel13.
MERK: I denne protokollen ble 10 % polyakrylamid brukt. - Bruk standard separasjons-, overførings- og deteksjonsprotokoller for western blotting14.
- Bruk densitometri14 for å bestemme de relative mengdene PEGylated versus ikkePEGylated proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunblotting med antistoffer mot proteinav interesse avslører palmitoylated tilstand (ikke, enkeltvis, dobbelt, etc.) i mus hjernen lysates som bestemmes av mobilitet skift sammenlignet med prøver der HAM ikke var inkludert. Tidligere hadde vi vist at SynDIG1 ble palmitoylated på to steder ved hjelp av ABE analyse6; Vi kunne imidlertid ikke avgjøre om begge nettstedene ble endret i hjernevev. Her viser vi at SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 og Prrt2 er palmitoylated i mushjernen, og at de har to potensielle palmitoyleringssteder (Figur 1). Interessant, hvert protein har en annen palmitoylering tilstand i mus hjernen basert på signalet for ikke, enkeltvis og dobbelt palmitoylated protein. Densitometrianalyse av blots gir kvantitativ informasjon om palmitoylated tilstand.
Figur 1: Påvisning av PEGylated proteinarter i musemembranpreparater. Mus hjerner ble dissekert raskt og homogenisert umiddelbart. P2 membran fraksjoner ble utsatt for APEGs analyse som beskrevet i denne protokollen. I dette eksperimentet ble postnatal dag 18 (P18) skilt ved hjelp av en 10% SDS-PAGE gel og immunblotted og undersøkt med antistoffer mot SynDIG1 (SD1), Prrt2 og SynDIG4 (SD4). Symboler indikerer protein som ikke er palmitoylert (•), palmitoylert singly (*), eller dobbelt (**). Tilstedeværelsen av svake bånd i HAM (-) forhold indikerer enten en ufullstendig reduksjon av disulfid obligasjoner eller ufullstendig blokkering av frie cystein av NEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer | Komponenter | Arbeider conc. | Kommentarer |
| Homogenisering | 0,32 M sukrose, 1 mM Tris pH 7.2, 1 mM MgCl2 | Tilsett PMSF- og proteasehemmere umiddelbart før bruk. | |
| Buffer A | PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, 4% SDS (m/v) | Tilsett PMSF- og proteasehemmere umiddelbart før bruk. | |
| TCEP-løsning | 500 mM TCEP i ddH2O (pH 7.2) | 25 mM (andre kan være på siden) | Tilsett 10 N NaOH for å øke pH. |
| NEM-løsning | 2,0 M NEM i 100% etanol | 50 mM (andre kan være på siden) | Forbered deg frisk. |
| Buffer H (HAM+) | 1.33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (m/v) | 1,0 M | Forbered deg frisk. |
| Buffer T (HAM-) | 1.33 M Tris-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | ||
| MPEG-5k (andre er i seg selv) | 100 mPEG-5k i ddH2O | 20 mM (andre kan være på siden) | Bland godt. Veldig viskøs. |
Tabell 1: Løsninger som brukes til APEGS-analyse. Homogeniseringbuffer og buffer A kan klargjøres på forhånd; Tilsett imidlertid proteasehemmere og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) umiddelbart før bruk. Alle andre løsninger skal tilberedes friskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt tidligere arbeid benyttet vi ABE-analysen til å vise at SynDIG1 er palmitoylated ved to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon6. En begrensning er at ABE-analysen krever affinitetsrensing med agaroseharpikser som konjugeres til avidin moieties som det siste trinnet i prosedyren, noe som resulterer i betydelig tap av signal som kompliserer kvantitativ analyse. Videre kan ABE-analysen ikke skille mellom om et protein er palmitoylert en gang eller på flere steder.
Her bruker vi APEGS-analysen8,,9,10,1111,12 for å bestemme palmitoylasjonstilstanden til AMPAR hjelpetransmembrane proteiner SynDIG1 og de relaterte proteinene SynDIG4 (også kjent som Prrt1) og Prrt2 fra mus hjerneekstrakter; Analysen kan imidlertid påføres et hvilket som helst membranprotein som et høykvalitets og spesifikt antistoff egnet for vestlig blotting er tilgjengelig. Bruk av hjernemembraner fra ville type (WT) og knockout (KO) mus gir en ideell kontroll for antistoffspesifisitet som vi har demonstrert for antistoffer mot SynDIG115 og SynDIG416. Ved å utføre APEGS-analysen med hjernelysater fra WT- og KO-mus gir en viktig kontroll for antistoffspesifisitet i denne metoden. Denne metoden kan også brukes på ulike membranfraksjoner oppnådd via differensentrifugering etterfulgt av APEGS-analysen for å undersøke den subcellulære lokaliseringen av proteinet av interesse.
Et kritisk skritt i APEGS-analysen er CM-nedbør, hvis formål er å fjerne kjemikalier (NEM og HAM) fra å forstyrre påfølgende nedstrømsreaksjoner. Selv om det er mulig å utføre CM nedbør i et 1,5 ml rør, bør bruk av større rør og volumer gi mer optimale resultater. Samtidig, delvis på grunn av flere CM nedbør, bør man forvente et betydelig tap av protein fra begynnelse til slutt. Dette kan føre til tilsynelatende variasjon i totale proteinnivåer i minus- og pluss SKINKE-forhold.
Som vist i figur 1, gir tillegg av mPEG-5k (5 kDa) ikke nødvendigvis et lineært skifte på en immunoblot. Dette kan ha fordeler med å løse proteiner som er palmitoylert på flere steder. Videre indikerer tilstedeværelsen av band på mobilitetsskiftsteder i HAM-negative forhold enten en ufullstendig reduksjon av disulfidbindinger eller ufullstendig blokkering av frie cysteiner av NEM. Alternativt kan tilsynelatende forskjøvet bånd i HAM negativ tilstand indikere at frie cysteiner i et bestemt protein er vanskelig å blokkere. Dermed kan ytterligere optimalisering av blokkeringstrinnet være nødvendig hvis bare en liten prosentandel av totalt protein er palmitoylert i motsetning til SynDIG1, SynDIG4 og Prrt2 der flertallet av proteinet enten er enkeltvis eller dobbelt palmitoylert (Figur 1).
Denne metoden er ikke begrenset til mus hjerne lysates. Denne metoden har for eksempel blitt brukt til å screene for depalmitoylating enzymer for PSD-95 uttrykt i heterologøse celler9. Uttrykk for proteiner i heterologøse celler gjør det også mulig å bestemme det nøyaktige modifikasjonsstedet via stedsstyrt mutagenese. Denne metoden informerte også rollen som synaptisk stillas AKAP150 i synaptisk plastisitet17,18, viser en bred anvendelse i nevrovitenskap.
Det er viktig å merke seg at APEGS-analysen ikke er eksklusivt for 16-karbon palmitatmoieties, da analysen vil oppdage andre lange kjedefettacylkoblinger som er utsatt for spalting og erstatning av mPEG. For å etablere palmitat modifikasjon krever endelig ytterligere eksperimentering som metabolsk merking med tritiated palmitat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker K. Woolfrey for råd og innspill på APEGS-analysen. Disse studiene ble finansiert av forskningstilskudd til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al.
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
