Summary
Palmitovlation indebærer inkorporering af en 16-carbon palmitat moiety til cysteinrester af målproteiner på en reversibel måde. Her beskriver vi en biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay, at undersøge palmitoylering tilstand af ethvert protein af interesse i mus hjerne lysates.
Abstract
Aktivitetsafhængige ændringer i niveauet af synaptiske AMPA-receptorer (AMPARs) inden for postsynaptisk tæthed (PSD) menes at repræsentere en cellulær mekanisme til læring og hukommelse. Palmitoplation regulerer lokalisering og funktion af mange synaptiske proteiner, herunder AMPA-R'er, hjælpefaktorer og synaptiske stilladser på en aktivitetsafhængig måde. Vi identificerede synapse differentiering induceret gen (SynDIG) familie af fire gener (SynDIG1-4) kodning hjerne-specifikke transmembranproteiner, der forbinder med AMPARs og regulere synapse styrke. SynDIG1 palmitoladeres ved to cysteinrester på position 191 og 192 i den sideløbende transmembrane-region, der er vigtig for aktivitetsafhængig ekstuponitory synapseudvikling. Her beskriver vi en innovativ biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay, at undersøge palmitoylering tilstand af ethvert protein af interesse og demonstrere dens nytte med SynDIG familie af proteiner i musehjerne lysates.
Introduction
S-palmitovlation er en reversibel posttranslationel ændring af målproteiner, der regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraktioner1. Det indebærer tilsætning af en 16-carbon palmitatmoiety til cysteinrester via thioester kobling katalyseret af palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitolaated, herunder AMPA-Rs og PSD-95, i en aktivitetsafhængig måde at regulere stabilitet, lokalisering, og funktion2,3,4. Ændringer i niveauet af synaptiske AMPARs i PSD via interaktion mellem hjælpefaktorer med synaptiske stilladser såsom PSD-95 ligger til grund for synaptisk plasticitet; således giver metoder til bestemmelse af synaptiske proteiners palmitotolationstilstand vigtig indsigt i mekanismer for synaptisk plasticitet.
Tidligere identificerede vi SynDIG-familien på fire gener (SynDIG1-4), der koder hjernespecifikke transmembranproteiner, der forbinder med AMPARs5. Overekspression eller knock-down af SynDIG1 i dissociated rotte hippocampal neuroner stiger eller falder, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og antal med ~ 50% som opdaget ved hjælp af immuncytokemi og elektrofysiologi5. Vi udnyttede acyl-biotin-vekslingen (ABE) til at vise, at SynDIG1 palmitoladeres ved to bevarede sammentædningscycycysrester (findes i alle SynDIG-proteiner) på en aktivitetsafhængig måde for at regulere stabilitet, lokalisering og funktion6. ABE-analysen er baseret på udveksling af biotin på cysteiner, der er beskyttet af ændringer og efterfølgende affinitetsrensning7. Her beskriver vi en innovativ biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay8,9,10,11,12, som ikke kræver affinitet rensning og i stedet udnytter ændringer i gel mobilitet til at bestemme antallet af ændringer for et protein af interesse. Protokollen er beskrevet til undersøgelse af endogene membranproteiner fra musehjernen, for hvilke der findes egnede antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg fulgte retningslinjer fastsat af National Institutes of Health (NIH) og er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis.
1. Forberedelse af musehjernemembraner
- Halshugning mus ved hjælp af en guillotine apparat og dissekere hjernen ud hurtigt (i <1 min, hvis det er muligt, for at minimere palmitotastering ændringer, der kan opstå under dissektion procedure). Homogeniser straks i 10 ml homogeniseringsbuffer (tabel 1) i en glashomogenisator (~12 slag) på is.
- Lysater centrifugeres i 15 min ved 1.400 x g ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt rør på is. Pelletsen (~6 slag) resuspenderes i et tilsvarende volumen homogeniseringsbuffer og centrifuger ved 710 x g i 10 min. ved 4 °C.
- Supernatanterne blandes fra trin 1.2 og centrifugeres ved 40.000 x g i 20 min ved 4 °C.
- Supernatanten (cytosolic fraktion) kasseres, og den pelleterede membranfraktion (P2) suspenderes igen i homogeniseringsbufferen.
BEMÆRK: Prøverne kan lynfryses og opbevares ved -80 °C til senere brug. - Udfør en bicinchoninic syre (BCA) analyse til quantitate protein niveauer. For APEGS-analysen skal der begyndes med ~100−200 mg protein (højst 250 mg) i et volumen på 470 μL buffer A (tabel 1) i et 1,5 ml rør. Sonikere og centrifugeved >13.000 x g i 10 min ved 25 °C for at fjerne uopløseligt protein. Overfør opløseligt protein til et nyt 1,5 ml rør.
2. Acyl-PEGyl udveksling gel-shift (APEGS) assay
- Forstyrre disulfid obligationer og blokere frie cysteiner.
- Disulfidbindinger forstyrres ved at inkubere i 25 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP; 25 μL, tilsat fra en stamopløsning; Tabel 1) 60 min ved 55 °C.
- Blokfrie cysteiner med 50 mM N-ethylmaleimid (NEM; 12,5 μL, tilsat fra en stamopløsning; Tabel 1) ved stuetemperatur i 3 timer.
BEMÆRK: Reaktionen kan forlænges natten over.
- Udfør chloroform methanol (CM) nedbør.
- Proteinopløsningen overføres fra 1,5 ml rør til et polypropylen- eller glasrør, der kan centrifugeres i en svingende spandrotor med beskeden hastighed. Et 5 ml rør er ideelt. Der tilsættes kortvarigt fire bind methanol (MeOH) og vortex.
- Der tilsættes kortvarigt to bind (1 ml) chloroform og vortex.
- Der tilsættes kortvarigt tre bind (1,5 ml) dH2O og vortex.
- Prøverne centrifugeres ved 3.000 x g i 30 min ved 25 °C i en svingende skovlrotor.
- Fjern og kassér forsigtigt den øverste fase.
- Der tilsættes 3 bind (1,5 ml) MeOH, og bland forsigtigt, men grundigt, idet man er forsigtig med ikke at fragmentere den uigennemsigtige proteinpandekage.
- Der centrifugeres ved 3.000 x g i 10 min ved 25 °C i en svingende skovspandsrotor.
- Brug en glas serologisk pipet, fjerne så meget af den øverste fase som muligt uden at forstyrre protein pandekage.
- Skyl forsigtigt pelleten med 1 ml MeOH.
- Pelleten tørres i mindst 10 minutter.
BEMÆRK: Tørret pellet kan opbevares ved -20 °C.
- Udfør spaltning af palmitoyl-thioester forbindelser med hydroxylamin (NH2OH, HAM).
- Resuspender proteinudfældte i 125 μL buffer A og sonikere kortvarigt. Der centrifugeres ved >13.000 x g i 10 min ved 25 °C for at fjerne uopløseligt materiale. Overfør opløseligt protein til et nyt 1,5 ml rør.
- Der tilsættes 375 μL buffer H (HAM+; Tabel 1) eller buffer T (HAM-; Tabel 1) og inkubere prøver i 60 min ved 25 °C.
- Gentag den CM-udfældning, der er beskrevet i trin 2.2.
BEMÆRK: Tørret pellet kan opbevares ved -20 °C. - Føj mPEG til ubeskyttede cysteiner.
- Resuspender pellet i 100 μL buffer A indeholdende 10 mM TCEP. Overføres til et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Det er normalt, at der er sket betydeligt tab af protein under CM-udfældningstrin. Alle efterfølgende trin vil blive udført i et 1,5 ml rør, der begrænser proteinmængden til et maksimum på ~120−130 μL. Dette vil reducere proteintab under den endelige CM nedbør. - Der tilsættes 20 mM mPEG-5k (25 μL, tilsat fra en stamopløsning; Tabel 1) proteinprøve og blandes ved pipettering. Inkuber i 60 minutter ved 25 °C med end-over-end rotation.
- For at fjerne uinkorporeret mPEG-5k skal cm-udfældning som beskrevet i trin 2.2 udføres ved hjælp af disse justerede volumener: 4 mængder MeOH (500 μL), 2 mængder chloroform (250 μL) og 3 mængder dH2O (375 μL). >13.000 x g centrifugeres ved >13.000 x g i 10 min ved 25 °C.
- Fjern forsigtigt den øverste fase som før, undgå den tykke, flocculent pandekage. Tilsæt 1 ml MeOH og bland forsigtigt, men grundigt. >13.000 x g centrifugeres ved >13.000 x g i 10 min ved 25 °C.
- Fjern forsigtigt supernatanten og skyl pelleten med 1 ml MeOH. >13.000 x g centrifugeres ved >13.000 x g i 10 min ved 25 °C. Lufttør pellet.
BEMÆRK: Tørret pellet kan opbevares ved -20 °C. - Resuspender den tørrede pellet i 50 μL buffer A (uden TCEP eller noget reduktionsmiddel). Reserve 5 μL til BCA-proteinkvantificering. Efter kvantificering tilsættes en passende mængde 4x Laemmli-prøvebuffer, og afhængigt af det relevante protein opvarmes prøven til 70−100 °C i 10 min.
BEMÆRK: Kogning kan forårsage aggregering af nogle membranproteiner.
- Resuspender pellet i 100 μL buffer A indeholdende 10 mM TCEP. Overføres til et 1,5 ml rør.
3. Western blot analyse af PEGylated proteiner
- Prøven anbringes på en natriumdodetolkpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)gel 13.
BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt 10% polyacrylamid. - Brug standardseparations-, overførsels- og detektionsprotokoller til vestlig blotning14.
- Brug densitometri14 til at bestemme de relative mængder af PEGylated versus nonPEGylated proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunblotting med antistoffer mod det protein af interesse afslører palmitoladet tilstand (ikke, singly, dobbelt, osv.) i musehjernelysater som bestemt af mobilitetsskift sammenlignet med prøver, hvor HAM ikke var inkluderet. Tidligere havde vi vist, at SynDIG1 blev palmitoladet på to steder ved hjælp af ABE-analysen6; Vi kunne dog ikke afgøre, om begge steder blev ændret i hjernevæv. Her viser vi, at SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 og Prrt2 palmitoyleres i musehjernen, og at de har to potentielle palmitotasteringssteder (Figur 1). Interessant, hvert protein har en anden palmitoylering tilstand i musens hjerne baseret på signalet for den ikke, enkeltvis og dobbelt palmitoyleret protein. Densitometri analyse af blots giver kvantitative oplysninger om palmitoyleret tilstand.
Figur 1: Påvisning af PEGylated proteinarter i musemembranpræparater. Musehjerner blev dissekeret hurtigt og homogeniseret med det samme. P2 membranfraktioner blev underkastet APEGs-analysen som beskrevet i denne protokol. I dette eksperiment blev postnatal dag 18 (P18) adskilt ved hjælp af en 10% SDS-PAGE gel og immunblotted og undersøgt med antistoffer mod SynDIG1 (SD1), Prrt2 og SynDIG4 (SD4). Symboler angiver protein, der ikke palmerede (•), palmitoyleret singly (*) eller dobbelt (**). Tilstedeværelsen af svage bånd i HAM-betingelserne (-) indikerer enten en ufuldstændig reduktion af disulfidbindinger eller ufuldstændig blokering af frie cysteiner fra NEM's side. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Komponenter | Arbejder conc. | Kommentarer |
| Homogenisering | 0,32 M saccharose, 1 mM Tris pH 7,2, 1 mM MgCl2 | Tilsæt PMSF og proteasehæmmere umiddelbart før brug. | |
| Buffer A | PBS pH 7,2, 5 mM EDTA, 4% SDS (m/v) | Tilsæt PMSF og proteasehæmmere umiddelbart før brug. | |
| TCEP-opløsning | 500 mM TCEP i ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Tilføj 10 N NaOH for at øge pH. |
| NEM-løsning | 2,0 M NEM i 100% ethanol | 50 mM | Forbered dig frisk. |
| Buffer H (HAM+) | 1,33 M HAM, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (m/v) | 1,0 M | Forbered dig frisk. |
| Buffer T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (m/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k i ddH2O | 20 mM | Bland godt. Meget tyktflydende. |
Tabel 1: Opløsninger, der anvendes til APEGS-analyse. Homogeniseringsbuffer og buffer A kan forberedes i forvejen. der tilsættes proteasehæmmere og phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) umiddelbart før brug. Alle andre løsninger skal tilberedes frisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vores tidligere arbejde, vi udnyttede ABE analyse til at vise, at SynDIG1 er palmitoyleret på to bevarede sammenstilling-transmembrane Cys rester (findes i alle SynDIG proteiner) i en aktivitetsafhængig måde at regulere stabilitet, lokalisering, og funktion6. En begrænsning er, at ABE-analysen kræver affinitetsrensning med agaroseharpikser, der er konjugeret til avidin moieties som det sidste trin i proceduren, hvilket resulterer i et betydeligt tab af signal, der komplicerer den kvantitative analyse. Desuden kan ABE-analysen ikke skelne, hvis et protein palmeres én gang eller flere steder.
Her bruger vi APEGS-analysen8,,9,,10,,11,12 til at bestemme palmitoturationstilstanden af AMPAR's hjælpetransmembranproteiner SynDIG1 og de relaterede proteiner SynDIG4 (også kendt som Prrt1) og Prrt2 fra musehjerneekstrakter; Analysen kan dog anvendes på ethvert membranprotein, for hvilket der findes et specifikt antistof af høj kvalitet, der er egnet til vestlig blotting. Brug af hjernemembraner fra vilde type (WT) og knockout (KO) mus giver en ideel kontrol for antistof specificitet, som vi har vist for antistoffer mod SynDIG115 og SynDIG416. Udførelse af APEGS-analysen med hjernelysater fra WT- og KO-mus giver en vigtig kontrol for antistofspecificitet i denne metode. Denne metode kan også anvendes på forskellige membranfraktioner opnået via differentialcentrifugering efterfulgt af APEGS-analysen for at undersøge den subcellulære lokalisering af det protein, der er af interesse.
Et kritisk trin i APEGS-analysen er CM-udfældninger, hvis formål er at fjerne kemikalier (NEM og HAM) fra at forstyrre efterfølgende downstream-reaktioner. Selv om det er muligt at udføre CM udfældninger i et 1,5 ml rør, bør brugen af større rør og volumener give mere optimale resultater. På samme tid, til dels på grund af de mange CM nedbør, bør man forvente et betydeligt tab af protein fra start til. Dette kan resultere i tilsyneladende variation i det samlede proteinindhold i minus- og plus-HAM-betingelserne.
Som illustreret i figur 1medfører tilsætningen af mPEG-5k (5 kDa) ikke nødvendigvis et lineært skift på et immunblot. Dette kan have fordele i at løse proteiner, som er palmitoyleret på flere steder. Desuden indikerer tilstedeværelsen af frekvensbånd på mobilitetsskiftsteder under de negative forhold i HAM, at der enten er tale om en ufuldstændig reduktion af disulfidbindinger eller ufuldstændig blokering af frie cysteiner fra NEM's side. Alternativt kan tilsyneladende skiftbånd i HAM-negative tilstand indikere, at frie cysteiner inden for et bestemt protein er vanskelige at blokere. Der kan således være behov for yderligere optimering af blokeringstrinnet, hvis kun en lille procentdel af det samlede protein palmitolatres i modsætning til SynDIG1, SynDIG4 og Prrt2, hvor størstedelen af proteinet enten syngende eller dobbelt palmitoladet (figur 1).
Denne metode er ikke begrænset til musehjernelysater. For eksempel er denne metode blevet brugt til at screene for depalmitoylerende enzymer til PSD-95 udtrykt i heterologe celler9. Ekspression af proteiner i heterologe celler giver også mulighed for bestemmelse af det nøjagtige sted for ændring via sted-rettet mutagenese. Denne metode også informeret rolle synaptiske stillads AKAP150 i synaptisk plasticitet17,18, viser en bred anvendelse i neurovidenskab.
Det er vigtigt at bemærke, at APEGS assay ikke er eksklusivt til 16-carbon palmitatmoieties som analysen vil opdage andre langkædede fede acyl forbindelser, der er genstand for spaltning og udskiftning af mPEG. For at etablere palmitat ændring endegyldigt kræver yderligere eksperimenter såsom metabolisk mærkning med tritiated palmitate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker K. Woolfrey for rådgivning og input på APEGS assay. Disse undersøgelser blev finansieret af forskningsbevillinger til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al.
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
