Summary
पलमिटोइलेशन में 16 कार्बन पामिटेट मोईटी को रिवर्सिबल तरीके से लक्षित प्रोटीन के अवशेषों को शामिल करने पर जोर दिया जाता है। यहां, हम माउस मस्तिष्क lysates में रुचि के किसी भी प्रोटीन के palmitoylation स्थिति की जांच करने के लिए, एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण, acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट (APEGS) परख का वर्णन करते हैं ।
Abstract
पोस्टसिनैप्टिक घनत्व (पीएसडी) के भीतर सिनैप्टिक एम्पा रिसेप्टर्स (AMPARs) के स्तर में गतिविधि-निर्भर परिवर्तन सीखने और स्मृति के लिए एक सेलुलर तंत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए सोचा जाता है। पलमिटोइलेशन स्थानीयकरण और एम्पा-रुपये, सहायक कारकों और सिनैप्टिक मचान ों सहित कई सिनैप्टिक प्रोटीन के कार्य को गतिविधि-निर्भर तरीके से नियंत्रित करता है। हमने चार जीन (सिंडिजी 1-4) के सिनेप्स विभेदन प्रेरित जीन (सिंडिग) परिवार की पहचान की जो मस्तिष्क-विशिष्ट ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को एन्कोडिंग करता है जो एम्प्रर्स के साथ संबद्ध होते हैं और सिनैप्स शक्ति को विनियमित करते हैं। सिंडिजी1 गतिविधि पर निर्भर उत्तेजक सिनेप्स विकास के लिए महत्वपूर्ण मुक़ाबला-ट्रांसझिल्ली क्षेत्र में 1 9 1 और 1 9 2 की स्थिति में स्थित दो साइटीन अवशेषों पर पामिटोयेटेड है। यहां, हम एक अभिनव जैव रासायनिक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट (APEGS) परख, ब्याज के किसी भी प्रोटीन के palmitoylation राज्य की जांच करने के लिए और माउस मस्तिष्क lysates में प्रोटीन के SynDIG परिवार के साथ अपनी उपयोगिता का प्रदर्शन ।
Introduction
एस-पालिटोइलेशन लक्ष्य प्रोटीन का एक रिवर्सिबल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो स्थिर झिल्ली संघ, प्रोटीन तस्करी और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को नियंत्रित करता है1। इसमें पालिटोइल एसिलट्रांसफरेज (पैट) एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरक थिओस्टर लिंकेज के माध्यम से साइटीन अवशेषों के लिए 16 कार्बन पामिटेट मोईटी शामिल है। मस्तिष्क में कई सिनैप्टिक प्रोटीन को पामोलिटोयेटेड किया जाता है, जिसमें एम्पा-आरएस और पीएसडी-95 शामिल हैं, स्थिरता, स्थानीयकरण और कार्य2,3,3,4को विनियमित करने के लिए गतिविधि-निर्भर तरीके से। पीएसडी में सिनैप्टिक एएमपीआर के स्तर में परिवर्तन पीएसडी-95 अंडरलिटसिटिक प्लास्टिसिटी जैसे सिनैप्टिक मचानके के साथ सहायक कारकों की बातचीत के माध्यम से; इस प्रकार, सिनैप्टिक प्रोटीन की पापिटोइलेशन स्थिति निर्धारित करने के तरीके सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
इससे पहले, हमने चार जीन (SynDIG1-4) के सिंडिग परिवार की पहचान की जो मस्तिष्क-विशिष्ट ट्रांसम्मेब्रेन प्रोटीन को एन्कोडिंग करता है जो AMPARs5के साथ संबद्ध होता है। अतिअभिव्यक्ति या असंबद्ध चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में SynDIG1 के नीचे क्रमशः बढ़ जाती है या कम हो जाती है, AMPA-R सिनैप्स आकार और संख्या ~ 50% के रूप में इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी5का उपयोग कर का पता चला। हमने यह प्रदर्शित करने के लिए acyl-biotin एक्सचेंज (ABE) परख का उपयोग किया कि सिंडिग्गी 1 स्थिरता, स्थानीयकरण और कार्य6को विनियमित करने के लिए एक गतिविधि-निर्भर तरीके से दो संरक्षित मुक़ाबला-ट्रांसमेम्ब्रेन सीस अवशेषों (सभी सिंडिग प्रोटीन में पाया जाता है) पर पामोलिटोयेटेड है। अबे परख संशोधन और बाद में आत्मीयता शुद्धि7द्वारा संरक्षित साइस्टीन पर बायोटिन के आदान- प्रदान पर निर्भर करता है । यहां, हम एक अभिनव जैव रासायनिक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट (APEGS) परख8,,9,,10,,11,,12,जो आत्मीयता शुद्धि की आवश्यकता नहीं है और इसके बजाय जेल गतिशीलता में परिवर्तन का उपयोग करता है ब्याज की एक प्रोटीन के लिए संशोधनों की संख्या निर्धारित करते हैं । प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क से एंडोजेनस झिल्ली प्रोटीन की जांच के लिए वर्णित है जिसके लिए उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध हैं।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों का पालन किया और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. माउस मस्तिष्क झिल्ली की तैयारी
- एक गिलोटिन उपकरण का उपयोग करके माउस को काटना और मस्तिष्क को तेजी से काटना (यदि संभव हो तो, विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान होने वाले पामिटोइलेशन परिवर्तनों को कम करने के लिए)। बर्फ पर ग्लास होमोजेनाइजर (~ 12 स्ट्रोक) में समरूपीकरण बफर(टेबल 1)के 10 mL में तुरंत समरूपता।
- 15 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज किया जाता है। बर्फ पर एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 710 x ग्राम पर समरूपता बफर और अपकेंद्रित्र की बराबर मात्रा में गोली (~ 6 स्ट्रोक) को फिर से निलंबित करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए चरण 1.2 और सेंट्रलाइज्ड 40,000 x ग्राम से सुपरनेटेंट को मिलाएं।
- अधिनायक (साइटोसोलिक अंश) को त्यागें और समरूपता बफर में पैलेट झिल्ली (पी 2) अंश को फिर से निलंबित करें।
नोट: नमूने फ्लैश जमे हुए और बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक बिकिरोनिक एसिड (बीसीए) परख करें। APEGS परख के लिए, 1.5 मिलीग्राम ट्यूब में बफर ए(टेबल 1)के 470 माइक्रोन की मात्रा में ~ 100−200 मिलीग्राम प्रोटीन (अधिकतम 250 मिलीग्राम) के साथ शुरू करें। अघुलनशील प्रोटीन को दूर करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 13,000 x ग्राम पर सोनीकेट और अपकेंद्री। एक नए 1.5 mL ट्यूब के लिए घुलनशील प्रोटीन स्थानांतरण।
2. Acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल-शिफ्ट (APEGS) परख
- डिसुल्फिड बांड को बाधित करें और मुक्त साइस्टीन को अवरुद्ध करें।
- 25 एमएम ट्रिस (2-कार्बोसेथिल) फॉस्फिन (टीसीईपी; 25 माइक्रोन, स्टॉक समाधान से जोड़े गए) में इनक्यूबेटिंग करके डिसुल्फिफाइड बांड को बाधित करें; तालिका 1) 55 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए।
- 50 एमएम एन-एथिलमालेमिड (एनईएम; 12.5 माइक्रोन, स्टॉक समाधान से जोड़ा गया) के साथ मुक्त साइस्टीन ब्लॉक करें; तालिका 1) 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर।
नोट: प्रतिक्रिया रातोंरात बढ़ाया जा सकता है ।
- क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (सीएम) वर्षा करें।
- प्रोटीन समाधान को 1.5 मिलीएल ट्यूब से पॉलीप्रोपाइलीन या ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसे मामूली गति से झूलते बाल्टी रोटर में केंद्रित किया जा सकता है। एक 5 मिलील ट्यूब आदर्श है। मेथनॉल (MeOH) और भंवर संक्षेप में चार खंडों (2 mL) जोड़ें।
- क्लोरोफॉर्म और भंवर के दो खंड (1 mL) संक्षेप में जोड़ें।
- डीएच2ओ और भंवर संक्षेप में तीन खंड (1.5 mL) जोड़ें।
- सेंट्रलाइज 3,000 x जी पर 30 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर झूलते बाल्टी रोटर में नमूने लिए।
- ऊपरी चरण को सावधानी से हटाएं और त्यागें।
- MeOH के 3 संस्करणों (1.5 mL) जोड़ें और धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिश्रण, अपारदर्शी प्रोटीन पैनकेक टुकड़ा नहीं सावधान किया जा रहा है।
- एक झूल बाल्टी रोटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- एक ग्लास सीरोलॉजिकल पाइप का उपयोग करना, प्रोटीन पैनकेक को परेशान किए बिना जितना संभव हो सके शीर्ष चरण को हटा दें।
- ध्यान से MeOH के 1 mL के साथ गोली कुल्ला।
- हवा कम से कम 10 00 के लिए गोली सूखी।
नोट: सूखे गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
- हाइड्रोक्सीलामाइन (एनएच2ओह, हैम) के साथ पामिटोइल-थिओस्टर लिंकेज के दरार का प्रदर्शन करें।
- बफर ए के 125 माइक्रोन में प्रोटीन को फिर से निलंबित करें और संक्षेप में सोनीकेट करें। अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। एक नए 1.5 mL ट्यूब के लिए घुलनशील प्रोटीन स्थानांतरण।
- बफर एच (हैम +) के 375 माइक्रोन जोड़ें; तालिका 1) या बफर टी (हैम-; तालिका 1) और 25 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए इनक्यूबेट नमूने।
- चरण 2.2 में वर्णित सीएम वर्षा को दोहराएं।
नोट: सूखे गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - असुरक्षित साइस्टीन में एमपीईजी जोड़ें।
- 10 एमएम टीसीईपी युक्त बफर ए के 100 माइक्रोन में पैलेट को फिर से निलंबित करें। 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
नोट: सीएम वर्षा चरणों के दौरान प्रोटीन की महत्वपूर्ण हानि के लिए यह सामान्य है। बाद के सभी चरणों को 1.5 मिलील ट्यूब में किया जाएगा, जिससे प्रोटीन की मात्रा अधिकतम ~ 120−130 माइक्रोन तक बाधित होगी। इससे अंतिम सीएम वर्षा के दौरान प्रोटीन की हानि कम होगी। - 20 एमएम एमईईजी-5k (25 माइक्रोन, स्टॉक समाधान से जोड़ा गया) जोड़ें; तालिका 1) प्रोटीन नमूना और पाइपिंग द्वारा मिश्रण करने के लिए। अंत-ओवर-एंड रोटेशन के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए इनक्यूबेट।
- अनिगमित एमपीईजी-5k को हटाने के लिए, इन समायोजित खंडों का उपयोग करके चरण 2.2 में वर्णित सीएम वर्षा करें: मेओएच (500 माइक्रोन) के 4 खंड, क्लोरोफॉर्म (250 माइक्रोन) के 2 खंड, और डीएच2ओ (375 माइक्रोन) की 3 खंड। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- ध्यान से पहले की तरह ऊपरी चरण को हटा दें, मोटी, flocculent पैनकेक से परहेज। MeOH के 1 mL जोड़ें और धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिलाएं। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- ध्यान से अतिशयोक्ति को हटा दें और MeOH के 1 mL के साथ गोली कुल्ला। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। एयर ड्राई पैलेट।
नोट: सूखे गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - बफर ए (टीसीईपी या किसी भी कम करने वाले एजेंट के बिना) के 50 माइक्रोन में सूखे गोली को फिर से निलंबित करें। बीसीए प्रोटीन क्वांटिको के लिए रिजर्व 5 माइक्रोन। मात्रा के बाद, 4x लैमली नमूना बफर की उचित मात्रा जोड़ें और ब्याज के प्रोटीन के आधार पर, संभावित रूप से 10 मिमी के लिए नमूना को 70−100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
नोट: उबलते कुछ झिल्ली प्रोटीन के एकत्रीकरण का कारण बन सकता है।
- 10 एमएम टीसीईपी युक्त बफर ए के 100 माइक्रोन में पैलेट को फिर से निलंबित करें। 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
3. पेग्येटेड प्रोटीन का वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण
- एक सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) जेल13पर नमूना लोड करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में 10% पॉलीएक्रिलैमाइड का उपयोग किया गया था। - वेस्टर्न ब्लॉटिंग14के लिए स्टैंडर्ड सेपरेशन, ट्रांसफर और डिटेक्शन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करें ।
- पेग्व्येटेड बनाम नॉनपेग्नेटेड प्रोटीन की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करने के लिए घनत्व14 का उपयोग करें।
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Representative Results
ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलोटिंग माउस मस्तिष्क lysates में palmitoylated राज्य (गैर, singly, दोगुना, आदि) के रूप में नमूनों जिसमें हैम शामिल नहीं किया गया था की तुलना में गतिशीलता बदलाव द्वारा निर्धारित पता चलता है । पहले, हमने दिखा दिया था कि SynDIG1 अबे परख6का उपयोग कर दो साइटों पर palmitoylated था; हालांकि, हम यह निर्धारित नहीं कर सके कि दोनों साइटों को मस्तिष्क के ऊतकों में संशोधित किया गया था या नहीं। यहां हम बताते है कि SynDIG1, SynDIG4/Prrt1, और Prrt2 माउस मस्तिष्क में palmitoylated हैं और वे दो संभावित palmitoylation साइटों(चित्रा 1)है । दिलचस्प बात यह है कि प्रत्येक प्रोटीन में माउस मस्तिष्क में एक अलग पामिटोइलेशन राज्य होता है जो गैर, गायन और दोगुना पलमितोलेटेड प्रोटीन के लिए संकेत के आधार पर होता है। धब्बों का घनत्व विश्लेषण पामोलिटोयेटेड राज्य के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है।
चित्रा 1: माउस झिल्ली तैयारी में PEGylated प्रोटीन प्रजातियों का पता लगाना। माउस दिमाग को तेजी से विच्छेदित किया गया और तुरंत समरूप किया गया। पी 2 झिल्ली अंशों को इस प्रोटोकॉल में वर्णित APEGs परख के अधीन किया गया था। इस प्रयोग में, प्रसवोत्तर दिन 18 (P18) को 10% एसडी-पेज जेल और इम्यूनोब्लास्टेड का उपयोग करके अलग किया गया था और सिंडिजी1 (एसडी1), Prrt2 और SynDIG4 (SD4) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। प्रतीक प्रोटीन का संकेत देते हैं जो पालिटोयेटेड (•), पालिटोयेटेड सिंगली (*), या दोगुना (**) नहीं है। हैम (-) स्थितियों में बेहोश बैंड की उपस्थिति या तो डिसल्फाइड बांड की अधूरी कमी या एनईएम द्वारा मुफ्त साइस्टीन की अधूरी रुकावट को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| बफ़र | घटक | वर्किंग कॉन्स। | टिप्पणियाँ |
| समरूपता | 0.32 मीटर सुक्रोज, 1 एमएम ट्रिस पीएच 7.2, 1 एमएम एमजीसीएल2 | उपयोग से तुरंत पहले पीएमएसएफ जोड़ें और अवरोधकों को प्रोटीज़ करें। | |
| बफर ए | पीबीएस पीएच 7.2, 5 एमएम ईटीए, 4% एसडीएस (w/v) | उपयोग से तुरंत पहले पीएमएसएफ जोड़ें और अवरोधकों को प्रोटीज़ करें। | |
| टीसीईपी समाधान | डीडीएच2ओ में 500 एमटी टीसीईपी (पीएच 7.2) | 25 एमएम | पीएच बढ़ाने के लिए 10 एन NaOH जोड़ें। |
| एनीएम समाधान | 100% इथेनॉल में 2.0 एम एनईएम | 50mm | नए सिरे से तैयारी करें। |
| बफर एच (हैम +) | 1.33 एम हैम, पीएच 7.0, 5 एमएम ईटीए, 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (w/v) | 1.0 मीटर | नए सिरे से तैयारी करें। |
| बफर टी (हैम-) | 1.33 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.0, 5 एमएम ईटीए, 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (w/v) | ||
| एमपीईजी-5k | डीडीएच2ओ में 100 एमएम एमपीईजी-5k | 20 एमएम | अच्छी तरह मिलाएं। अत्यधिक चिपचिपा। |
तालिका 1: एपेग्स परख के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान। समरूपीकरण बफर और बफर ए को समय से पहले तैयार किया जा सकता है; हालांकि, उपयोग से तुरंत पहले प्रोटीज़ अवरोधक और फिनाइलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) जोड़ें। अन्य सभी समाधान नए सिरे से तैयार किए जाने चाहिए ।
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Discussion
हमारे पिछले काम में, हमने यह प्रदर्शित करने के लिए आबे परख का उपयोग किया कि SynDIG1 स्थिरता, स्थानीयकरण और कार्य6को विनियमित करने के लिए गतिविधि-निर्भर तरीके से दो संरक्षित मुक़ाबला-ट्रांसमेम्ब्रेन सीवाईएस अवशेषों (सभी सिंडिग प्रोटीन में पाया जाता है) पर पामिटोलेटेड है। एक सीमा यह है कि अबे परख प्रक्रिया में अंतिम कदम के रूप में avidin moieties के लिए conjugated agarose resins के साथ आत्मीयता शुद्धि की आवश्यकता है, संकेत है कि मात्रात्मक विश्लेषण जटिल के महत्वपूर्ण नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, ABE परख भेद नहीं कर सकते अगर एक प्रोटीन एक बार या कई साइटों पर palmitoylated है ।
यहां हम एम्पार सहायक ट्रांसमिम्ब्रिम्ब्रेन प्रोटीन सिंडिजी 1 और संबंधित प्रोटीन SynDIG4 (जिसे Prrt1 के रूप में भी जाना जाता है) और माउस मस्तिष्क अर्क से Prrt2 की पामिटोइलेशन स्थिति निर्धारित करने के लिए APEGS परख8,,9,,10,,11,,12 का उपयोग करते हैं; हालांकि, परख किसी भी झिल्ली प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है जिसके लिए पश्चिमी दाग के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाला और विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध है। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और नॉकआउट (KO) चूहों से मस्तिष्क झिल्ली का उपयोग एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए एक आदर्श नियंत्रण प्रदान करता है क्योंकि हमने सिंडिग्115 और सिंडिग416के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन किया है। डब्ल्यूटी और KO चूहों से मस्तिष्क lysates के साथ APEGS परख प्रदर्शन इस विधि में एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण प्रदान करता है । इस विधि को अंतर केंद्रीकरण के माध्यम से प्राप्त विभिन्न झिल्ली अंशों पर भी लागू किया जा सकता है जिसके बाद एपेग्स परख के बाद ब्याज के प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण की जांच की जा सकती है।
APEGS परख का एक महत्वपूर्ण कदम सीएम वर्षा है, जिसका उद्देश्य रसायनों (NEM और HAM) को बाद में डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप करने से हटाना है । हालांकि 1.5 एमएल ट्यूब में सीएम वर्षा करना संभव है, लेकिन बड़ी ट्यूबों और वॉल्यूम के उपयोग से अधिक इष्टतम परिणाम निकलने चाहिए। साथ ही, कई सेमी वर्षा के कारण, किसी को शुरू से अंत तक प्रोटीन के पर्याप्त नुकसान की उम्मीद करनी चाहिए। यह ऋण और प्लस हैम स्थितियों में कुल प्रोटीन के स्तर में स्पष्ट परिवर्तनशीलता में परिणाम हो सकता है ।
जैसा कि चित्र 1में सचित्र, एमपीईजी-5k (5 केडीए) के अलावा जरूरी नहीं कि इम्यूनोब्लॉट पर रैखिक बदलाव का उत्पादन हो। इससे प्रोटीन को हल करने में फायदे हो सकते हैं जो कई साइटों पर पाजिटोयेटेड होते हैं। इसके अलावा, हैम नकारात्मक स्थितियों में गतिशीलता बदलाव स्थानों पर बैंड की उपस्थिति या तो डिसल्फाइड बांड की अधूरी कमी या एनईएम द्वारा मुफ्त साइस्टीन की अधूरी रुकावट को इंगित करती है। वैकल्पिक रूप से, हैम नकारात्मक स्थिति में स्पष्ट स्थानांतरित बैंड संकेत मिलता है कि एक विशेष प्रोटीन के भीतर मुफ्त cysteines ब्लॉक करने के लिए मुश्किल हो सकता है । इस प्रकार, अवरुद्ध चरण के अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है यदि कुल प्रोटीन का केवल एक छोटा प्रतिशत सिंडिजी 1, सिंडिग 4 और Prrt2 के विपरीत है जिसमें प्रोटीन का बहुमत या तो सिंग्जी 1, सिंडिग 4 और Prrt2 के विपरीत है जिसमें प्रोटीन का बहुमत या तो सिंग्ली या दोगुना पलमिटोयेटेड(चित्रा 1)है।
यह विधि माउस मस्तिष्क के लिए सीमित नहीं है। उदाहरण के लिए, इस विधि का उपयोग विषमलोगोस कोशिकाओं9में व्यक्त पीएसडी-95 के लिए डिपामेमिटोयलेटिंग एंजाइमों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया है। विषमलोगोस कोशिकाओं में प्रोटीन की अभिव्यक्ति साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से संशोधन की सटीक साइट के निर्धारण के लिए भी अनुमति देता है। इस विधि ने न्यूरोसाइंस में एक व्यापक अनुप्रयोग का प्रदर्शन करते हुए सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी17,,18में सिनैप्टिक पाड़ AKAP150 की भूमिका को भी सूचित किया।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि APEGS परख 16-कार्बन palmitate moieties के लिए विशेष नहीं है के रूप में परख अंय लंबी श्रृंखला फैटी acyl लिंकेज है कि दरार और mPEG द्वारा प्रतिस्थापन के अधीन है का पता लगाने जाएगा । पापिटेट संशोधन स्थापित करने के लिए निर्णायक रूप से ट्राइटिट ्ड पामिट के साथ मेटाबोलिक लेबलिंग जैसे अतिरिक्त प्रयोग की आवश्यकता होती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक एपेग्स परख पर सलाह और इनपुट के लिए के वूल्फ्रे का शुक्रिया अदा करते हैं। इन अध्ययनों को व्हाइटहॉल फाउंडेशन और एनआईएच-एनआईएम (1R01MH119347) से ईस्वी को अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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