Summary
팔미토일화는 가역적인 방식으로 표적 단백질의 시스테인 잔류물까지 16탄소 팔미네이트 모이티의 혼입을 수반한다. 여기서, 우리는 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석법을 설명하고, 마우스 뇌 용해액에 관심 있는 임의의 단백질의 팔미토일화 상태를 조사한다.
Abstract
시 냅 스 AMPA 수용 체의 수준에서 활동 의존 변경 (AMPARs) 후 층 내 밀도 (PSD) 학습 및 메모리에 대 한 세포 메커니즘을 나타내는 것으로 생각 된다. 팔미토일화는 AMPA-Rs, 보조 인자 및 시냅스 스캐폴드를 포함한 많은 시냅스 단백질의 국소화 및 기능을 활성 의존적 방식으로 조절합니다. 우리는 4개의 유전자의 시냅스 분화 유도한 유전자 (SynDIG1-4) AMPA와 연관되고 시냅스 강도를 통제하는 두뇌 특정 막 막 단백질을 인코딩하는 것을 확인했습니다. SynDIG1은 활성 의존적 흥분성 시냅스 개발에 중요한 병타-트랜스멤브레인 영역에서 위치하는 2개의 시스테인 잔기에서 191 및 192에 위치한다. 여기에서, 우리는 혁신적인 생화확적인 접근법, 아실-PEGyl 교환 젤 시프트(APEGS) 분석법을 기술하여, 관심 있는 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하고 마우스 뇌 용해액에 있는 단백질의 SynDIG 제품군과 그 유용성을 입증한다.
Introduction
S-팔미토일화는 안정적인 막 연관성, 단백질 인신 매매 및 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 표적 단백질의 가역적 번역 후변형1. 그것은 팔미토일 아실 트랜스퍼 라제 (PAT) 효소에 의해 촉매 티오 에스터 링키지를 통해 시스테인 잔기에 16 탄소 팔미테 모티의 추가를 포함한다. 뇌의 많은 시냅스 단백질은 AMPA-Rs 및 PSD-95를 포함하는, 안정성, 국소화 및 기능2,,3,,4를조절하는 활성 의존적 방식으로 팔미토틸화된다. PSD-95와 같은 시냅스 스캐폴드와 보조 요인의 상호 작용을 통해 PSD에 있는 시냅스 AMPARs의 수준에 있는 변경은 시냅스 가소성을 기초로 합니다; 따라서, 시냅스 단백질의 팔미토일화 상태를 결정하는 방법은 시냅스 가소성의 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공한다.
이전에는 AMPARs5와연관된 뇌 특이적 막 간 단백질을 코딩하는 4개의 유전자(SynDIG1-4)의 SynDIG 제품군을 확인했습니다. 해리된 랫트 해마 뉴런에서 SynDIG1의 과발현 또는 노크다운은 각각 면역세포화학 및전기생리학을사용하여 검출된 바와 같이, AMPA-R 시냅스 크기 및 수 ~50%에 의해 증가 또는 감소한다. 우리는 아실-비오틴 교환(ABE) 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능을 조절하는 활성 의존적 방식으로 두 개의 보존된 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토틸화된다는 것을 입증하였다6. ABE 분석은 변형 및 후속 친화성 정제에 의해 보호 시스테인에 비오틴의 교환에 의존7. 여기서, 우리는 혁신적인 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS)8분석8,9,10,,11,,12,친화성 정제를 필요로 하지 않고 대신 겔 이동성의 변화를 활용하여 관심 있는 단백질에 대한 수정 횟수를 결정한다., 프로토콜은 적합한 항체가 유효한 마우스 두뇌에서 내인성 막 단백질의 조사를 위해 기술됩니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH)에 의해 명시된 지침을 따르고 캘리포니아 대학, 데이비스에 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 뇌막의 준비
- 기요틴 장치를 사용하여 마우스를 참수하고 뇌를 빠르게 해부하십시오 (<1 분, 가능하면 해부 절차 중에 발생할 수있는 팔미토일화 변화를 최소화하십시오). 얼음 에 유리 균질화 제 (~12 스트로크)에서 균질화 완충제(표 1)의10 mL에서 즉시 균질화.
- 원심분리기는 4°C에서 1,400 x g에서 15분 동안 용해됩니다. 상급체를 얼음에 새 튜브로 옮김. 펠릿(~6 스트로크)을 균질화 완충제와 원심분리기의 동일한 부피에서 710 x g에서 4°C에서 10분 동안 재중단합니다.
- 4°C에서 20분 동안 40,000 x g에서 1.2단계와 원심분리기를 결합합니다.
- 상판(cytosolic 분획)을 폐기하고 균질화 완충제에서 펠릿막(P2) 분획을 재중단한다.
참고: 시료는 플래시 냉동 및 -80°C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다. - 단백질 수준을 정량화하기 위해 비신코닌산(BCA) 분석기를 수행합니다. APEGS 분석의 경우, 1.5 mL 튜브에서 완충A(표1)의부피에서 ~100-200 mg 단백질(최대 250 mg)으로 시작한다. 불용성 단백질을 제거하기 위해 25°C에서 10분 동안 >13,000 x g에서 초음파 및 원심분리기를 제거하였다. 용해된 단백질을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.
2. 아실-PEGyl 교환 젤 시프트 (APEGS) 분석
- 이황화 결합을 방해하고 무료 시스테인을 차단합니다.
- 25 mM 트리스 (2-카르박스체틸)인 포스핀 (TCEP; 25 μL, 주식 용액으로부터 첨가된)에서 배양함으로써 이황화 결합을 중단; 표 1) 55 °C에서 60 분 동안.
- 50 mM N-에틸 말레미드와 블록 무료 시스테인 (NEM; 12.5 μL, 주식 용액에서 추가; 표 1) 3 시간 동안 실온에서.
참고 : 반응은 하룻밤 연장 될 수 있습니다.
- 클로로포름 메탄올(CM) 침전을 수행합니다.
- 1.5 mL 튜브에서 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심 분리 할 수있는 폴리 프로필렌 또는 유리 튜브로 단백질 용액을 옮니다. 5 mL 튜브가 이상적입니다. 메탄올(MeOH)과 와류의 4개 부피(2mL)를 짧게 추가합니다.
- 클로로포름과 와류의 두 부피(1mL)를 짧게 추가합니다.
- dH2O와 소용돌이의 3개 볼륨(1.5mL)을 짧게 추가합니다.
- 스윙 버킷 로터에서 25°C에서 30분 동안 3,000 x g에서 시료를 원심분리한다.
- 조심스럽게 제거하고 상부 단계를 폐기.
- MeOH 3권(1.5mL)을 넣고 불투명한 단백질 팬케이크를 조각하지 않도록 주의하면서 부드럽고 철저하게 섞으세요.
- 스윙 버킷 로터에서 25°C에서 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리기.
- 유리 혈청 학적 파이펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 상단 위상을 많이 제거하십시오.
- MeOH 1 mL로 펠릿을 조심스럽게 헹구십시오.
- 펠릿을 적어도 10분 동안 공기 건조시.
참고 : 건조 된 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
- 하이드록실라민 (NH2OH, HAM)과 팔미토일 티에스터 링키지의 분열을 수행합니다.
- 완충A의 125 μL에서 단백질 침전을 재중단하고 잠시 초음파 처리한다. 불용성 물질을 제거하기 위해 25 °C에서 10 분 동안 >13,000 x g에서 원심 분리기. 용해된 단백질을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.
- 버퍼 H의 375 μL추가 (HAM +; 표 1) 또는 버퍼 T(HAM-; 표 1) 25 °C에서 60 분 동안 샘플을 배양하십시오.
- 2.2단계에서 기재된 CM 강수량을 반복한다.
참고 : 건조 된 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. - 보호되지 않은 시스테인에 mPEG를 추가합니다.
- 100 μL의 완충A에서 펠릿을 10 mM TCEP를 함유한다. 1.5 mL 튜브로 옮김.
참고: CM 강수 단계 동안 단백질의 상당한 손실이 발생하는 것은 정상입니다. 모든 후속 단계는 1.5 mL 튜브에서 수행되어 단백질의 부피를 최대 ~120-130 μL로 제한합니다. 이것은 최종 CM 강수량 도중 단백질 손실을 감소시킬 것입니다. - 20 mM mPEG-5k (25 μL, 재고 용액에서 추가; 표 1) 단백질 샘플에 파이펫팅하여 혼합합니다. 25°C에서 60분 동안 배양하여 엔드 오버-오버-엔드 회전을 합니다.
- 통합되지 않은 mPEG-5k를 제거하려면, 이러한 조정된 부피를 사용하여 2.2단계에서 설명한 대로 CM 침전을 수행하십시오: MeOH 4부 볼륨(500 μL), 클로로폼 2부(250 μL), 3개의 dH2O(375 μL). >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
- 조심스럽게 두꺼운, 응집팬케이크를 피하고, 이전과 같이 상부를 제거합니다. MeOH 1 mL을 넣고 부드럽게 완전히 섞으세요. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.
- 조심스럽게 상류를 제거하고 MeOH의 1 mL로 펠릿을 헹구십시오. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기. 공기 건조 펠릿.
참고 : 건조 된 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. - 완충A의 50 μL에서 건조 된 펠릿을 다시 일시 중단하십시오 (TCEP 또는 환원제없이). BCA 단백질 정량화를 위해 5 μL을 예약하십시오. 정량화 후, 적당한 양의 Laemmli 샘플 버퍼를 추가하고, 관심 있는 단백질에 따라, 잠재적으로 샘플을 70-100°C로 10분 동안 가열한다.
참고: 끓이면 일부 막 단백질이 응집을 일으킬 수 있습니다.
- 100 μL의 완충A에서 펠릿을 10 mM TCEP를 함유한다. 1.5 mL 튜브로 옮김.
3. PEGylated 단백질의 서쪽 얼룩 분석
- 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)겔(13)에샘플을 적재한다.
참고:이 프로토콜에서는 10% 폴리아크릴아미드가 사용되었다. - 서양 블로팅14에표준 분리, 전송 및 감지 프로토콜을 사용합니다.
- 밀도측정14를 사용하여 PEGylated 대 비PEGylated 단백질의 상대적 양을 결정합니다.
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Representative Results
관심 있는 단백질에 대하여 항체를 가진 면역 blotting은 HAM가 포함되지 않은 견본과 비교된 이동성 교대에 의해 결정된 마우스 두뇌에 있는 palmitoylated 상태 (비, singly, 이중 등)를 제시합니다. 이전에는 SynDIG1이 ABE 분석6을사용하여 두 사이트에서 팔미토틸화되었다는 것을 입증했습니다. 그러나, 우리는 두 사이트가 뇌 조직에서 수정되었는지 여부를 확인할 수 없습니다. 여기서 우리는 SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 및 Prrt2가 마우스 뇌에서 팔미토화되어 있고 두 개의 잠재적인 팔미토일화 부위가 있다는 것을보여줍니다(그림 1). 흥미롭게도, 각 단백질은 비, 단리 및 이중 팔미토일화 단백질에 대한 신호에 기초하여 마우스 뇌에서 상이한 팔미토일화 상태를 가지고 있다. 블롯의 밀도 측정 분석은 손바닥에 절인 상태에 대한 정량적 정보를 제공합니다.
그림 1: 마우스 막 제제에서 PEGylated 단백질 종의 검출. 마우스 뇌는 빠르게 해부되었고 즉시 균질화되었습니다. P2 막 분획은 본 프로토콜에 기재된 바와 같이 APEGGs 분석기를 실시하였다. 본 실험에서, 산후일 18(P18)은 10% SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고 면역블로틴화하고 SynDIG1(SD1), Prrt2, 및 SynDIG4(SD4)에 대한 항체로 프로브하였다. 기호는 팔미토일화(•), 팔미토일화된(*), 이중(**)이 아닌 단백질을 나타냅니다. HAM (-) 조건에서 희미한 밴드의 존재는 NEM에 의한 이황화 결합의 불완전한 감소 또는 자유 시스테인의 불완전한 막힘을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 | 구성 요소 | 작업 conc. | 코멘트 |
| 균질 | 0.32 M 자당, 1 mM 트리스 pH 7.2, 1 mM MgCl2 | 사용하기 직전에 PMSF와 프로테아제 억제제에 추가하십시오. | |
| 버퍼 A | PBS pH 7.2, 5mM EDTA, 4% SDS (v w) | 사용하기 직전에 PMSF와 프로테아제 억제제에 추가하십시오. | |
| TCEP 솔루션 | ddH2O에서 500 mM TCEP (pH 7.2) | 25 mM | pH를 높이기 위해 10 N NaOH를 추가합니다. |
| NEM 솔루션 | 100% 에탄올2.0M NEM | 50 mM | 신선하게 준비하세요. |
| 버퍼 H(HAM+) | 1.33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100 (v) | 1.0 M | 신선하게 준비하세요. |
| 버퍼 T(HAM-) | 1.33 M 트리스-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100 (v) | ||
| mPEG-5k | ddH2O에서 100 mM mPEG-5k | 20 mM | 잘 섞으세요. 점성이 높습니다. |
표 1: APEGS 분석에 사용되는 솔루션입니다. 균질화 버퍼 및 버퍼 A는 미리 준비될 수 있고; 그러나 사용 직전에 프로테아제 억제제와 페닐메틸설포닐 불소(PMSF)를 첨가하십시오. 다른 모든 솔루션은 신선해야합니다.
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Discussion
전작에서는 ABE 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능6을조절하는 활성 의존적 방식으로 보존된 두 개의 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토화된다는 것을 입증했습니다. 한계는 ABE 분석이 절차의 마지막 단계로 아비딘 모에티에 공액 된 아가로즈 수지와의 친화정화가 필요하며, 이로 인해 정량적 분석이 복잡해지는 신호의 상당한 손실이 발생한다는 것입니다. 더욱이, ABE 분석은 단백질이 한 번 또는 다중 사이트에 손바닥에 박혀 있는지 구별할 수 없습니다.
여기서 우리는 APEGS8분석8,9,10,,,11,,12를 사용하여 AMPAR 보조 막 횡단 단백질 SynDIG1 및 관련 단백질 SynDIG4(Prrt1라고도 함) 및 마우스 뇌 추출물로부터의 Prrt2의 팔미토일화 상태를 결정합니다. 그러나, 상기 분석은 서양 블로팅에 적합한 고품질 및 특이적 항체가 이용 가능한 임의의 막 단백질에 적용될 수 있다. 야생형(WT) 및 녹아웃(KO) 마우스로부터의 뇌막의 사용은 SynDIG115 및 SynDIG416에대한 항체에 대해 입증한 바와 같이 항체 특이성에 대한 이상적인 대조군을 제공한다. WT 및 KO 마우스로부터 뇌 용해물로 APEGS 분석법을 수행하는 것은 이 방법에서 항체 특이성에 대한 중요한 대조군을 제공한다. 이 방법은 또한 관심 있는 단백질의 세포하 국소화를 조사하기 위하여 APEGS 분석법에 선행된 차동 원심분리를 통해 장악된 다른 막 분획에 적용될 수 있었습니다.
APEGS 분석의 한 중요한 단계는 CM 강수량입니다, 그 목적은 후속 다운스트림 반응을 방해에서 화학 물질 (NEM 및 HAM)를 제거하는 것입니다. 1.5 mL 튜브에서 CM 침전을 수행 할 수 있지만 더 큰 튜브와 부피를 사용하면 보다 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 동시에, 다중 CM 강수량 때문에 부분적으로, 하나는 처음부터 끝까지 단백질의 상당한 손실을 기대해야한다. 이것은 마이너스 및 플러스 HAM 조건에 있는 총 단백질 수준에 있는 명백한 가변성 귀착될 수 있습니다.
도 1에도시된 바와 같이, mPEG-5k(5 kDa)의 첨가는 반드시 면역블롯상에서 선형 시프트를 생성하지는 않는다. 이 여러 사이트에서 palmitoylated 단백질을 해결에 이점을 가질 수 있습니다. 더욱이, HAM 음성 조건에 있는 이동성 교대 위치에 밴드의 존재는 NEM에 의하여 이황화 결합의 불완전한 감소 또는 자유로운 시스테인의 불완전한 막힘이 표시합니다. 대안적으로, HAM 음성 조건에 있는 명백한 이동한 밴드는 특정 단백질 내의 자유로운 시스테인이 차단하기 어렵다는 것을 나타낼 수 있습니다. 따라서, 전체 단백질의 극히 일부에 불과한 경우, SynDIG1, SynDIG4 및 Prrt2와 는 대조적으로 단백질의 대부분이 단연 또는 이중으로 이중으로 되어 있는 경우 차단 단계의 추가적인 최적화가 필요할 수있다(도 1).
이 방법은 마우스 뇌 가해에 국한되지 않습니다. 예를 들어, 이 방법은 이종 세포9에서발현되는 PSD-95에 대한 데팔미토일화 효소를 스크리닝하는 데 사용되어 왔다. 이종 세포에서 단백질의 발현은 또한 사이트 지시 돌연변이 발생을 통해 수정의 정확한 부위의 결정을 허용한다. 이 방법은 또한 시냅스 소성17,,18에서시냅스 스캐폴드 AKAP150의 역할을 알려주어 신경 과학에서 광범위한 응용을 입증하였다.
APEGS 분석은 분석이 mPEG에 의한 분열 및 교체의 대상이되는 다른 긴 사슬 지방 아실 링키지를 감지하기 때문에 16 탄소 팔미네이트 모에티에만 국한되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 결정적으로 팔미테 수정을 확립하기 위해서는 삼중 팔미테로 대사 라벨링과 같은 추가 실험이 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 APEGS 분석에 대한 조언과 입력K. 울프리 감사합니다. 이 연구 결과는 화이트홀 재단과 NIH-NIMH (1R01MH119347)에서 E.D.에 연구 보조금에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
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