Summary
غالباً ما تتطلب الأساليب الحالية لبناء أقطاب أقطاب أقطاب أقطابية ذات كفة محيطية قابلة للزرع بشكل مزمن لاستخدامها في القوارض الصغيرة معدات متخصصة و/أو موظفين مدربين تدريباً عالياً. في هذا البروتوكول نبرهن على نهج بسيط ومنخفض التكلفة لتصنيع أقطاب الكفة القابلة للزرع بشكل مزمن ، ونبرهن على فعاليتها لتحفيز العصب المبهم (VNS) في الفئران.
Abstract
منذ فترة طويلة تستخدم أقطاب الكفة العصبية الطرفية في علم الأعصاب والمجالات ذات الصلة لتحفيز ، على سبيل المثال ، الأعصاب المبهمة أو الوركية. وقد أظهرت العديد من الدراسات الحديثة فعالية VNS المزمنة في تعزيز اللدونة الجهاز العصبي المركزي لتحسين إعادة التأهيل الحركي، والتعلم الانقراض، والتمييز الحسي. إن بناء أجهزة قابلة للزرع بشكل مزمن لاستخدامها في مثل هذه الدراسات أمر صعب بسبب صغر حجم الفئران، وتتطلب البروتوكولات النموذجية تدريبًا مكثفًا للموظفين وطرقًا للذم الدقيق تستغرق وقتًا طويلاً. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء أقطاب أقطاب قابلة للزرع متاحة تجارياً بتكلفة أعلى بكثير. في هذا البروتوكول، نقدم طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لبناء أقطاب صغيرة ذات كفة عصب محيطية قابلة للزرع بشكل مزمن لاستخدامها في الفئران. نحن التحقق من موثوقية قصيرة وطويلة الأجل من أقطاب الكفة لدينا من خلال إثبات أن VNS في الكيتامين / xylazine الفئران تخدير تنتج انخفاض في معدل التنفس بما يتفق مع تفعيل منعكس هيرينغ بروير، سواء في وقت زرع وما يصل إلى 10 أسابيع بعد زرع الجهاز. نحن نبرهن كذلك على مدى ملاءمة أقطاب الكفة للاستخدام في دراسات التحفيز المزمن من خلال إقران VNS مع أداء الصحافة الرافعة الماهرة للحث على اللدونة الخرف الحركي للخريطة.
Introduction
في الآونة الأخيرة ، ازداد الطلب على أقطاب الكفة القابلة للزرع بشكل مزمن لتحفيز الأعصاب الطرفية ، حيث تظهر الدراسات بشكل متزايد الفائدة قبل الإكلينيكية لهذه التقنية لعلاج العديد من الأمراض الالتهابية1و2و 3 والاضطرابات العصبية4،5,،6 6،7،8،10,،11،,1313،14،15.10 VNS المزمنة، على سبيل المثال، وقد ثبت لتعزيز اللدونة القشرية الجديدة في مجموعة متنوعة من سياقات التعلم، وتحسين إعادة التأهيل الحركي4،,5،,6،,7،,8، الانقراض التعلم10،11،12،13،14، والتمييز الحسي15. وغالبا ما ترتبط أقطاب الكفة العصبية الطرفية المتاحة تجارياً بأوقات ممتدة لتحقيق الطلبات وتكاليف عالية نسبياً، مما قد يحد من إمكانية الوصول إليها. وبدلاً من ذلك، تظل بروتوكولات تصنيع أقطاب الكفة القابلة للزرع بشكل مزمن محدودة، كما أن تشريح القوارض يمثل تحديات خاصة بسبب صغر حجمها. وكثيرا ما تتطلب البروتوكولات الحالية لبناء أقطاب أقطاب الأصفاد لتجارب القوارض المزمنة استخدام معدات وتقنيات معقدة، فضلا عن موظفين مدربين تدريبا مكثفا. في هذا البروتوكول، ونحن نبرهن على نهج مبسطة لتكبيل تلفيق القطب على أساس الأساليب المنشورة سابقا وتستخدم على نطاق واسع16،17. نحن التحقق من صحة وظيفة لدينا الأقطاب المزروعة بشكل مزمن في الفئران من خلال إثبات أنه، في وقت زرع الكفة حول العصب المبهم العنقي الأيسر، والتحفيز المطبقة على أقطاب الكفة أنتجت بنجاح وقف التنفس وإسقاط في SpO2. ومن المعروف تحفيز مستقبلات الرئة الألياف vagal لإشراك منعكس هيرينغ بروير، الذي تثبيط العديد من النوى التنفسية في جذع الدماغ النتائج في إلهام قمع18. وهكذا، وقف التنفس بما يتفق مع منعكس هيرينغ-بروير، وانخفاض الناتجة في SpO2، وتوفير اختبار مباشر لزرع القطب السليم وظيفة الكفة في الفئران تخدير. للتحقق من صحة وظيفة طويلة الأجل من أقطاب الكفة المزروعة بشكل مزمن، تم قياس الاستجابات منعكس في وقت زرع ومقارنة إلى الاستجابات التي تم الحصول عليها في نفس الحيوانات بعد ستة أسابيع من زرع. تم زرع مجموعة ثانية من الفئران مع أقطاب كفة VNS بعد التدريب السلوكي على مهمة ضاغطة على الرافعة. في هذه الفئران، أنتجت VNS يقترن الأداء المهمة الصحيحة إعادة تنظيم الخريطة الحركية القشرية، بما يتفق مع الدراسات المنشورة سابقا19،20،21،22. في وقت رسم الخرائط القشرية الحركية تحت التخدير، والتي وقعت بعد 5-10 أسابيع من زرع الجهاز، ونحن التحقق من صحة وظيفة الكفة في الحيوانات المعالجة VNS من خلال التأكد من أن VNS تسبب بنجاح وقف التنفس وأكبر من 5٪ انخفاض في SpO2.
البروتوكولات التي تم نشرها مؤخرا من Childs etal. 17 و Rios etal. 16 توفر نقطة انطلاق مصدق عليها بشكل جيد لنهج بسيط لتلفيق أقطاب الكفة ، حيث تم استخدام هذه الطريقة الشعبية من قبل مختبرات متعددة تجري دراسات VNS المزمنة في القوارض1،2،3،4،5،6،,88،9،10،11.3 الأسلوب الأصلي ينطوي على عدة خطوات عالية الدقة للتلاعب في الأسلاك الدقيقة مثل أن تلفيق القطب الكفة يستغرق أكثر من ساعة لإكمال، والتدريب المكثف لأداء موثوق بها. ويتطلب النهج المبسط الموصوف هنا عددا أقل بكثير من المواد والأدوات ويمكن استكماله في أقل من ساعة من قبل موظفين مدربين تدريبا أدنى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول وفقًا لدليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات وقد تمت الموافقة عليها من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الحيواني المؤسسية لجامعة تكساس في دالاس.
1. تحفيز تلفيق القطب الكفة
- إعداد أنابيب الكفة.
- باستخدام شفرة حلاقة، وقطع قطعة من البوليمر أنابيب 2.5 ملم في الطول. إدراج نصائح ملقط أو مشبك ورقة من خلال أنابيب واستخدام شفرة لجعل شق بالطول من خلال جدار الأنابيب على جانب واحد الكفة.
- إزالة ملقط من الأنابيب وإدراج إبرة الخياطة كبيرة من خلال خط الوسط من الكفة، عمودي على محور طويل. أدخل الإبرة من خلال الشق (الجزء العلوي) وفي وسط الأنبوب المقابل (القاع). ضع الإبرة في لوحة الرغوة لتثبيت الكفة في مكانها خلال خطوات التجميع المتبقية.
- ضع خياطة لتأمين إغلاق الكفة أثناء الزرع.
- أدخل إبرة الخياطة الصغيرة من خلال جدار الكفة، على خط الوسط، حوالي 0.5 مم من الفتحة العلوية على جانب واحد. أدخل الإبرة من الداخل إلى الخارج لتجنب إتلاف أنابيب الكفة. أدخل 2 سم طول خياطة 6/0 من خلال العين من الإبرة وسحب الإبرة من خلال جدار أنابيب لخيط خياطة في الكفة.
- ترك الخيط في مكانه، وإزالة إبرة وثقب ثقب الثاني من خلال جدار الأنابيب ما يقرب من 0.5 ملم تحت الحفرة الأولى، على طول خط الوسط من الكفة. أدخل الغرزة من خلال عين الإبرة واسحب الإبرة من خلال جدار الأنابيب لخيط مرة أخرى خياطة من خلال الكفة.
- يجب أن يكون كلا طرفي الخيط خياطة الآن على الجانب الخارجي من الكفة. ضبط خياطة بحيث ~ 1.5 سم يمتد من ثقب أعلى، و ~ 0.5 مم يمتد من الحفرة السفلية.
- تطبيق كمية صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصق إلى نهاية قصيرة من خياطة تمتد من أسفل الحفرة وسحب نهاية خياطة أطول حتى ذيل أقل هو تدفق تقريبا مع الجدار الخارجي للأنابيب. استخدام عصا الأشعة فوق البنفسجية لعلاج لاصقة وعقد خياطة بحزم في مكان.
- كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.3 على الجانب الآخر من الكفة.
- وضع البلاتين: إيريديوم (Pt:Ir) الأسلاك يؤدي.
- استخدام إبرة الخياطة الصغيرة لجعل 4 ثقوب في جدار الكفة. يجب وضع كل زوج من الثقوب حوالي 0.5-0.8 مم من الخط الوسطي العمودي، مع ثقب حوالي 0.5-0.8 مم من الشق العلوي على جانبي الكفة.
تنبيه: للحصول على وضع أكثر اتساقا ودقة من يؤدي، إدراج إبرة من الداخل إلى الخارج لجعل جميع الثقوب، وذلك باستخدام وضع خياطة كدليل. - إدراج إبرة الخياطة مرة أخرى، وهذه المرة العمل من الخارج إلى الداخل، من خلال ثقب الرصاص 1. إدراج ما يقرب من 0.5 سم من طول 7.5 سم من Pt:Ir الأسلاك من خلال العين من الإبرة وسحب الإبرة من خلال أنابيب لخيط الرصاص الأسلاك من خلال جدار الكفة. ضبط السلك بحيث ~ 4.5 سم يمتد على الجانب الخارجي من الكفة (الشكل 1A).
- أدخل الإبرة من خلال ثقب الرصاص 1 مرة أخرى، والعمل مرة أخرى من الخارج إلى الداخل، وبالإضافة إلى ذلك إدراج الإبرة من خلال ثقب الرصاص 2 مباشرة عبر من ثقب الرصاص 1. إدراج ~ 0.5 سم من أقصر (الداخلية) نهاية Pt: Ir الأسلاك من خلال العين من الإبرة وسحب الإبرة من خلال أنابيب لخيط يؤدي الأسلاك من خلال جدران الكفة.
ملاحظة: يجب أن يكون كل من طرفي Pt:Ir السلك الآن على الجانب الخارجي من الكفة، وتتشكل حلقة سلكية حول حافة الشق ومن خلال ثقب الرصاص 1(الشكل 1B). - كرر الخطوات من 1.3.1 إلى 1.3.3 لوضع Pt:Ir عبر ثقوب الرصاص 3 و 4.
- باستخدام أخف وزنا من البوتان، وإزالة بعناية العزل من طول 5-6 ملم في نهاية Pt:Ir الأسلاك تمتد من ثقب الرصاص 2 وثقب الرصاص 4.
تنبيه: قم بعزل نهايات الخيوط عن باقي تجمع الكفة بعناية لتجنب الإضرار بالكفة. استخدام أدوات لعقد الأسلاك لتجنب الإصابة. - محاذاة الأسلاك العارية داخل الكفة لوضع يؤدي في مواقعها النهائية. للقيام بذلك، سحب بلطف على نهاية Pt: الأسلاك Ir تمتد من حفرة 1 حتى الجزء غير المسلم من الأسلاك هو تدفق مع ثقب 1. كرر مع الرصاص الأخرى لمحاذاة نهاية غير مُلَكّد من السلك المُخيط من خلال ثقوب الرصاص 3 و4.
- تطبيق كمية صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصقة لحلقات الأسلاك على الجانب الخارجي من الكفة في ثقوب الرصاص 1 و 3. استخدام عصا الأشعة فوق البنفسجية لعلاج لاصقة وتأمين يؤدي في مكان.
- استخدام تلميح ماصة صغيرة لدفع Pt uninsulated: Ir الأسلاك يؤدي ضد الجدار الداخلي للكد. مرة واحدة يؤدي في مكان، وقطع نهايات الأسلاك تمتد من ثقوب الرصاص 2 و 4 بحيث ما يقرب من 1 ملم من الأسلاك يمتد إلى ما وراء السطح الخارجي للجدار الكفة.
- أضعاف ذيول 1 ملم من الأسلاك شقة ضد السطح الخارجي للصفة، مع الحرص على عدم اختصار لهم معا. تطبيق كمية صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصقة لتغطية فقط ذيول اثنين وعلاج لاصق لتأمين وضع الرصاص وتوفير العزل الكهربائي.
تنبيه: من المهم أن تغطي بالكامل أسطح Pt:Ir المكشوفة خارجيًا مع مادة لاصقة لعزل الأسلاك وتجنب التحفيز خارج الهدف.
- استخدام إبرة الخياطة الصغيرة لجعل 4 ثقوب في جدار الكفة. يجب وضع كل زوج من الثقوب حوالي 0.5-0.8 مم من الخط الوسطي العمودي، مع ثقب حوالي 0.5-0.8 مم من الشق العلوي على جانبي الكفة.
- تأمين Pt: الأسلاك Ir يؤدي في مكان مع تأمين خياطة.
- إزالة إبرة كبيرة مع الجمعية الكفة من لوحة رغوة. أدخل 3 سم طول خياطة 6/0 من خلال العين من الإبرة وسحب الإبرة من خلال أنابيب لخيط خياطة من خلال الجزء السفلي من الكفة عند نقطة الوسط.
- التبديل إلى إبرة الخياطة الصغيرة لاستكمال خيوط خياطة لPt:Ir تأمين الرصاص. أدخل الإبرة من خلال نفس ثقب الخط الوسطي، والعمل مرة أخرى من الداخل إلى الخارج لتجنب تشوه الأنابيب ويؤدي الأسلاك. أدخل الذيل الخارجي للخياطة من خلال عين الإبرة واسحب الإبرة من خلال جدار الكفة لإنشاء حلقة من خياطة حول حافة الكفة (الشكل 1C).
ملاحظة: استخدام ملقط والعمل تحت المجهر لضمان توجه خياطة على طول محور طويل من الكفة وتقع شقة ضد أنابيب. هذه الخطوة تضمن أن تظل الخيوط منفصلة على الجانب الداخلي من الكفة ويتم عقدها في مكانها الجانبي إلى خط الوسط الكفة. - إنشاء حلقة ثانية حول الطرف الآخر من الكفة عن طريق ربط نهايات خياطة في عقدة نصف، على الجانب الخارجي من الكفة. ضمان خياطة يمتد على طول محور طويل من الكفة وتقع شقة ضد الأنابيب. في حين عقد عقدة ضيقة بحيث يضع شقة ضد الأنابيب، وتطبيق كمية صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصقة إلى نصف عقدة وعلاج لعقد في مكان.
- قطع بعناية نهايات الخيط خياطة أقرب إلى عقدة ممكن. إذا لزم الأمر، واستخدام كمية صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصق إضافية الغراء نهايات قصيرة من خياطة حتى أنها تكمن شقة ضد أنابيب (الشكل 1D).
- دبابيس موصل لحام إلى يؤدي Pt:Ir الأسلاك.
- باستخدام أخف وزنا من البوتان، وإزالة العزل من ~ 3 ملم في نهاية كل من يؤدي الأسلاك Pt:Ir. لحام جانب الكأس من دبوس ذهبي (راجع جدول المواد)إلى النهاية غير المحسوبة لكل من الرصاص.
- اختبار مقاومة الجهاز المجمع.
- قم بتوصيل دبابيس الذهب بمدخلات وحدة التحقق من مقاومة LCR أو القطب الكهربائي، ثم قم بتعيين تردد الاختبار على kHz 1. غمر أنابيب الكفة (وPt: Ir التحفيز اتصالات الداخلية إلى الكفة) في الكواب الصغيرة مليئة المالحة، مع الحرص على الحفاظ على دبابيس الرصاص الذهب وموصلات التحقيق الجافة. تحقق من أن الكفة المجمعة لها مقاومة عند kHz 1 أقل من 2 كيلو أوم قبل الشروع في عملية الزرع.
ملاحظة: غالباً ما يشير مقاومة عالية إلى عدم كفاية منطقة سطح Pt:Ir المكشوفة، والتي يمكن أن تنشأ بسبب عوامل مثل عدم كفاية إزالة العزل، والتطبيق العرضي للمادة اللاصقة في الداخل الكفة، وخيوط الأسلاك المكسورة، وما إلى ذلك. وينبغي أيضا أن يتم تفتيش الأصفاد عن خيوط الأسلاك المكسورة أو سيئة الموضوعة التي يمكن أن تؤدي إلى اتصالات قصيرة مع استخدام على المدى الطويل.
- قم بتوصيل دبابيس الذهب بمدخلات وحدة التحقق من مقاومة LCR أو القطب الكهربائي، ثم قم بتعيين تردد الاختبار على kHz 1. غمر أنابيب الكفة (وPt: Ir التحفيز اتصالات الداخلية إلى الكفة) في الكواب الصغيرة مليئة المالحة، مع الحرص على الحفاظ على دبابيس الرصاص الذهب وموصلات التحقيق الجافة. تحقق من أن الكفة المجمعة لها مقاومة عند kHz 1 أقل من 2 كيلو أوم قبل الشروع في عملية الزرع.
2. رئيس سقف البناء
ملاحظة: إجراءات تجميع غطاء الرأس مماثلة لتلك التي نشرت سابقا (تشايلدز وآخرون17)،ويتم تلخيصها هنا للراحة.
-
تجميع غطاء الرأس17
- قطع قطعتين صغيرتين من 30 AWG التفاف الأسلاك، واحد ~ 13 ملم في الطول واحد ~ 10 ملم في الطول. تجريد ~ 1.5 مم من العزل قبالة كل نهاية من كلا الأسلاك. لحام الجانب دبوس من دبوس الذهب إلى نهاية واحدة من كل سلك، أقرب إلى الكأس ممكن. استخدام قواطع الأسلاك لقطع طول الزائد من دبوس وراء المشترك لحام.
- لحام الطرف الآخر من الأسلاك AWG إلى اثنين من أكواب لحام المركزية من موصل microstrip 4 دبوس.
- ثني أغطية الرأس سلك يؤدي إلى أعلى نحو الموصل ووضع دبابيس الذهب شقة ضد الموصل، بالتوازي مع بعضها البعض، كما هو مبين في الشكل 2A. يجب وضع دبوس متصلة إلى الأسلاك أقصر تحت دبوس متصلا الأسلاك أطول. استخدام مسمار الاكريليك، أسمنت الأسنان، أو الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصق لتأمين يؤدي غطاء الرأس في مكان.
3. استخدام الجهاز
- زرع أقطاب الكفة لتحفيز العصب المبهم المزمن.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع العمليات الجراحية باستخدام تقنية معقمة أو معقمة تحت التخدير المناسب، وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ومع موافقة IACUC المحلية. تهدف الإجراءات التالية إلى توضيح استخدام ممثل للجهاز وليس المقصود أن تكون شاملة.- ضع الجرذ في إطار مجسم و قم بعمل شق رُبط على عظام الجدارية والقذالي للكشف عن سطح الجمجمة لزرع غطاء الرأس/الموصل. حفر بعناية 4 ثقوب في الجمجمة ومكان مسامير الصائغ. استخدام الاكريليك الأسنان لتأمين غطاء الرأس إلى الجمجمة ومسامير.
- إزالة الفئران من إطار stereotaxic ووضع على جانبها الأيمن. جعل شق عمودي في الجلد على الجانب الأيسر من الرقبة، وتشريح بعناية العصب المبهم الأيسر من الشريان السباتي، وتقع بين عضلات الروماتوماويد وستيروهويد وتحت العضلات omohyoid.
- نفق الكفة يؤدي تحت الجلد نحو الجمجمة. قم بتوصيل العملاء المتوقعين إلى قبعة الرأس باستخدام دبابيس الذهب.
- ضع العصب المبهم داخل الكفة وأقفل الجهاز المغلق عن طريق ربط عقدة مزدوجة في خياطة الكفة. كن حذرا لتجنب إتلاف العصب أثناء زرع عن طريق التلاعب في العصب مع خطاطيف حادة وغير غير مواصل أو عن طريق استيعاب النسيج الضام المحيطة العصب.
- اختبار الزرع عن طريق تطبيق التحفيز على الجهاز (10 ق القطار من 0.8 ميغامترا، 30 هرتز، 100 ميكروغرام البقول ثنائي الطور). زرع السليم سوف يؤدي إلى وقف التنفس وانخفاض في SpO2 من 5٪ أو أكثر.
- تغطية دبابيس الذهب وخيوط مكشوفة مع الاكريليك الأسنان، والجروح وثيقة مع الغرز، وتنظيف مواقع شق مع المالحة، والكحول، وحل بودينود povidone.
- توفير السوائل البديلة والتواسيه والرعاية بعد الجراحة بما يتماشى مع المبادئ التوجيهية للNIH وموافقة IACUC.
- تحفيز العصب المبهم أثناء السلوك المستيقظ.
ملاحظة: تم في السابق عرض تسليم VNS كالحيوانات أداء مهام حركية محددة لتوسيع تمثيل الخريطة الحركية للمحرك ذات الصلة بالمهمة. نحن نستخدم هذا النموذج الذي تم التحقق منه لتقديم مثال تمثيلي لاستخدام الجهاز ، ولكن العديد من النماذج السلوكية الأخرى و / أو معلمات التحفيز قد تكون ذات صلة بتطبيقات بديلة. تم تدريب الفئران على الكفاءة في مهمة الصحافة رافعة المستخدمة هنا قبل زرع الجهاز. بعد الجراحة، تم التحقق من الأداء الجيد مرة أخرى قبل تسليم VNS: الجرذان إجراء ما لا يقل عن 100 التجارب الناجحة في اثنين من دورات تدريبية 30 دقيقة يوميا. تم إقران VNS مع مطابعة الذراع الصحيحة خلال 10 دورات تدريبية لاحقة على مدى 5 أيام.- قم بتوصيل الجرذ بمولد تحفيز عبر غطاء الرأس المزروع والتكيف مع إعدادات التحفيز المناسبة. لإعادة التنظيم التي يسببها VNS للخريطة القشرية الحركية، قم بإقران كل مُحرّكة لرافعة صحيحة بقطار واحد من 15 نبضة ثنائية الطور، يبلغ عرض كل منها 100 ميكرومتر وبسعة 800 μA، ويُسلَّم على تردد 30 هرتز.
- يتم تسليم قطار التحفيز مباشرة بعد الكشف عن كل الصحافة رافعة ناجحة خلال عشر دورات تدريبية 30 دقيقة. أثناء تسليم VNS، استخدم منظارًا لمراقبة التوصيل الناجح للتحفيز الحالي.
- التحقق من صحة وظيفة الكفة المزروعة بشكل مزمن.
- في غضون 24 ساعة من آخر VNS- يقترن دورة تدريبية، واستخدام microstimulation داخل الجمجمة (ICMS) لتحديد خريطة somatotopic وظيفية في القشرة الحركية19،20،2121،22.
- بعد تحريض التخدير لرسم خرائط ICMS لقشرة المحرك، والتحقق من وظيفة الكفة مرة أخرى عن طريق تطبيق قطار 10 s من 30 هرتز، 0.8 mA التحفيز الحالي (100 ميكروس البقول الثنائية الطور)، والتي ينبغي أن تؤدي إلى وقف التنفس والحد في مستويات SpO2 على الأقل 5٪، بما يتفق مع منعكس هيرينغ بروير.
ملاحظة: اعتمادا على التطبيق، وظيفة الكفة قد تعتبر مقبولة إذا كان يمكن الاعتماد عليها SpO2 انخفاض أقل من 5٪ لوحظ، أو إذا كانت السعات الحالية أعلى (تصل إلى 1.6 مللي أمبير) إنتاج موثوق على الأقل 5٪ تخفيض في SpO2. عدم مراعاة وقف التنفس و / أو انخفاض موثوق بها في SpO2 يدل على فشل زرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم زرع أقطاب الكفة العصبية المبهمة وأغطية الرأس بشكل مزمن في الفئران وفقًا للإجراءات الجراحية المنشورة سابقًا17،19،20،21،22. قبل الزرع، تم قياس المعاوقة في 1 كيلوهرتز عبر يؤدي الكفة مع أنابيب الكفة المغمورة في المالحة (المعاوقة = 1.2 ± 0.17 كΩ [متوسط ± std]; N = 9). تم زرع الأصفاد فقط مع المعاوقات أقل من 2 كيلوواطΩ في المالحة; جميع الأصفاد التقى هذا المعيار (0/9 الأصفاد استبعاد). خلال عمليات الزرع الجراحية، تم إجراء التحقق الوظيفي من جميع الأصفاد عن طريق اختبار لوقف قصيرة التحفيز الناجم عن التنفس وانخفاض لاحق في تشبع الأكسجين في الدم يعزى إلى منعكس هيرينغ بروير. لاستحضار هذه الاستجابة، تم تسليم قطار 10 s من 30 هرتز، 0.8 mA التحفيز الحالي (100 ميكروغرام نبضات ثنائي الطور) عبر يؤدي الكفة. بالنسبة للأكمام المزروعة 9/9 ، لاحظنا توقف التنفس الناجم عن VNS لمدة التحفيز 10 ثوانٍ ، والذي كان مصحوبًا بانخفاض في SpO2 بنسبة 5٪ على الأقل (تغيير٪ في SpO2 = -10.3 ± 3.2 ٪ ، يعني ± std ؛ النطاق = -5.7 إلى -14.5٪) ، مما يؤكد وظيفة الأصفاد والزرع السليم. خلال عملية الزرع الأولية, وجدنا علاقة كبيرة بين قراءات SpO2 الأولية وتغيير نسبة في2 SpO أثارها VNS(الشكل 2B; R2 = 0.60، ع = 0.0083، الارتباط الخطي بيرسون)، بما يتفق مع نشر الأدب الذي يدل على أن عمق التخدير يؤثر على حجم منعكس هيرينغ-بروير23،24. لاختبار وظيفة طويلة الأجل من الأصفاد مزروعة بشكل مزمن، تم تخدير الفئران مرة أخرى بعد 6 أسابيع من زرع الجهاز وVNS تم تطبيقها لاستحضار استجابة منعكس هيرينغ بروير. ل 7 من 9 أجهزة، لاحظنا انخفاض أكبر من 5٪ في SpO2 باستخدام 10 S القطارات من 0.8 هرتز، 30 هرتز التحفيز(الشكل 2C). في هذه الأجهزة، لم يختلف حجم التغيير الذي أثاره التحفيز في SpO2 عن ذلك الذي لوحظ في الزرع الأولي ، مما يشير إلى الأداء المستمر الممتاز للأجهزة المزروعة بشكل مزمن (التغيير ٪ الأولي في SpO2 = -9.7 ± 3.4 ٪ ، التغيير % النهائي في SpO2 = -15.8 ± 6.5 ٪ ، يعني ± std ؛ p = 0.08 ، الاقتران t-test). في الأجهزة المتبقية 2, زيادة سعة التحفيز إلى 1.6 mA كان كافيا لاستحضار انخفاض موثوق بها في SpO2 من ما لا يقل عن 5%, مما يشير إلى أن هذه الأجهزة واصلت العمل, ولكن أن التغيرات في مقاومة, تلف الأعصاب, أو اتجاه الكفة مع مرور الوقت قد أدى إلى انخفاض الأداء.
لمزيد من الاختبار وظيفة طويلة الأجل لدينا الأقطاب المحفزة زرع مزمن، تم تدريب مجموعة ثانية من الفئران على نسخة مبسطة من مهمة المهرة الوصول إلى رافعة الصحافة التي وضعتها Hays وآخرون لتقييم كميا الأداء الحركي forelimb25. وقد أظهرت دراسات متعددة أن الاقتران VNS مع الأداء الحركي الصحيح على هذه المهمة النتائج في توسيع تمثيل forelimb القريبة في القشرة الحركية الأولية19،20،21،22. في نسختنا المبسطة من المهمة، كان مطلوبا الفئران للوصول إلى 2 سم خارج كشك التدريب للضغط تماما رافعة، ومن ثم الإفراج عنه في غضون 2 ق من أجل الحصول على مكافأة الغذاء(الشكل 2D). تلقت الحيوانات دورتين تدريبيتين لمدة 30 دقيقة في اليوم حتى حققت إتقانًا مستقرًا في المهمة (> 65٪ صحيح ، > 100 تجربة /جلسة ، لمدة 8/10 جلسات متتالية على الأقل). ثم خضعت الفئران لعملية جراحية لزرع قطب تكبيل محفز حول عصبهم المبهم الأيسر. بعد التعافي من الجراحة ، والتأقلم مع تنشيط الكابلات ، والعودة إلى الأداء السلوكي المتقن ، تلقت الفئران 10 دورات تدريبية إضافية تم فيها تسليم VNS (قطار 0.5 s من 0.8 mA ، 30 هرتز نبضات ؛ 100 ميكروغرام عرض النبض الثنائي الطور) ، أو التحفيز الصوري (عدم التحفيز) ، في وقت إطلاق الرافعة الصحيح. في غضون 24 ساعة بعد آخر دورة تدريبية VNS- يقترن, تم تخدير الفئران مع الكيتامين / xylazine (80/10 ملغ /كغ, i.p.), تم اختبار وظيفة قطب الكفة, وتم تنفيذ رسم خرائط المحركات القشرية وفقا للإجراءات المنشورة22. بما يتفق مع الدراسات السابقة التي تثبت أن VNS محركات التوسع في تمثيلات خريطة الحركة ذات الصلة المهمة ، VNS الجرذان المعالجة (N = 3) أظهرت تمثيلات أكبر بكثير من الجرذان المعالجة الصورية (N = 4) في دراستنا (الشكل 2D; PFL % من إجمالي مساحة الخريطة، متوسط + SEM: صور = 15.6 ± 6.7٪، VNS = 38.3 ± 1.0٪؛ p = 0.035، اختبار t 2-sample، قوة الاختبار = 0.8). في جميع الحيوانات المعالجة بالترددات VNS، تم التحقق من صحة وظيفة الكفة بعد تحريض التخدير في وقت رسم الخرائط، 5-10 أسابيع بعد الزرع، من خلال تأكيد تغيير أكبر من 5٪ في SpO2 حدث استجابة لـ VNS (قطار 10 s من 0.8 mA، 30 هرتز نبضات؛ 100 ميكروغرام عرض النبض ثنائي الطور).
الشكل 1: تجميع أقطاب الكفة المحفزة. (أ) بعد تأمين الغرز على جانبي الكفة ، يمكن أن يكون Pt:Ir سلك خيوط من خلال جدار الكفة في حفرة #1 (رأس السهم الأبيض) باستخدام إبرة الخياطة. (B) Pt: Ir سلك هو مترابطة بشكل صحيح وجاهزة للفك العزل بعد إنشاء حلقة سلك حول حافة الكفة والخيوط السلك مرة أخرى من خلال ثقب #1 (رأس السهم الأبيض) وعبر الكفة من خلال ثقب #2 (رأس السهم الأصفر). (C) مرة واحدة على حد سواء يؤدي في مكان، وتأمين الرصاص الأول عن طريق خيوط خيوط من خلال ثقب خط الوسط وحول حافة الكفة (رأس السهم الأصفر). (D) إغلاق حلقة حول يؤدي الثاني مع نصف عقدة والغراء في مكان لاستكمال الجمعية الكفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استخدام الجهاز لتحفيز العصب المبهم المزمن في الفئران المستيقظة. (A) رأس الجمعية. (B) أثناء زرع الجهاز، كانت التخفيضات التي أثارتها VNS في SpO2 مرتبطة بقراءات SpO2 الأولية (R2 = 0.602، p = 0.008، الارتباط الخطي لبيرسون). (C)مقارنة بين VNS-استحضار SpO2 قطرات التي تم الحصول عليها في زرع الجهاز مقابل عند إنهاء تجارب التحفيز 6 أسابيع في وقت لاحق. تشير الخطوط إلى أزواج من القياسات لفئران فردية. ويتكون التحفيز في الألواح B و C من قطار واحد 10 s من 100 ميكروغرام نبضات ثنائي الطور تسليمها في 0.8 mA و 30 هرتز (D) الفئران مع زرع مزمن VNS أقطاب الكفة أداء مهمة رافعة الصحافة. (E) VNS (0.5 s القطار من 0.8 mA، 30 هرتز، 100 ميكروغرام البقول ثنائي الطور) يقترن الأداء الصحيح رافعة الصحافة توسيع تمثيل خريطة من العضلات ذات الصلة المهمة في القشرة الحركية. الفئران التي تلقت VNS يقترن الأداء الصحافة رافعة الصحيح (N = 3) عرضت نسبة أكبر بكثير من منطقة خريطة المحرك المخصصة لتمثيل forelimb (PFL) شبه مقابل الفئران التي تلقت التحفيز الشام (N = 4). النقاط تظهر تمثيل PFL لمواضيع فردية; تشير أشرطة الخطأ SEM. تم تنفيذ علاج VNS متبوعًا برسم تخطيط كورتيكال 5-10 أسابيع بعد الزرع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نصف نهج بسيط ومنخفض التكلفة لتجميع أقطاب الكفة المحفزة القابلة للزرع بشكل مزمن لاستخدامها في القوارض ، مما يسهل التحقيقات قبل الإكلينيكية لهذا العلاج الناشئ. هذه الطريقة المبسطة لا تتطلب أي تدريب أو معدات متخصصة، وتستخدم عدداً صغيراً من الأدوات واللوازم التي يسهل على معظم مختبرات الأبحاث الوصول إليها، مما يقلل من كل من التكاليف النقدية وتكاليف العمالة لتصنيع الأجهزة مقارنة بالمناهج الأخرى16و26,,و27و28., مطلوب الرعاية في جميع أنحاء الجمعية لتجنب الاستخدام المفرط للأشعة فوق البنفسجية علاج لاصقة في حين لا تزال تضمن الاستقرار الميكانيكية الكافية من الغرز وPt:Ir يؤدي لوظيفة الكفة على المدى الطويل. يُعقّد الإفراط في اللصق عملية زرع الجهاز وقد تهيج الأنسجة المحيطة بعد الجراحة، في حين يزيد عدم كفاية المواد اللاصقة من احتمال أن لا تحافظ الخيوط مع مرور الوقت على تواصل جيد مع العصب، مما يؤدي إلى انخفاض أداء الجهاز أو فشله. وضع ثابت من Pt de-insulated: Ir الأسلاك داخل التجويف الكفة هو أيضا أمر بالغ الأهمية لتحقيق مقاومة منخفضة وأداء الجهاز الجيد. وينبغي توخي الحذر لمحاذاة الأسلاك المعزولة بشكل صحيح بحيث يقع أقصى سطح ممكن من الأسلاك المكشوفة داخل الكفة، في حين لا يوجد سلك مكشوف خارجيا.
لقد تحققنا من أن نهجنا ينتج الأصفاد ذات الحجم والموثوقية المماثلة لتلك المستخدمة حاليا من قبل عدة مختبرات للتسليم VNS المزمن في الفئران4،5،6،7،8،10،,11،12،13،14،15،19،21,،22.1022 وتشير الدراسات الحديثة إلى أن الألياف العصبية الطرفية يتم تجنيدها بالمثل باستخدام مجموعة واسعة من أحجام الاتصال الكهربائي والتوجهات16،29، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن تكييفه للعديد من التجارب التي تتطلب تحفيز الأعصاب الطرفية ، وأن الاختلافات الصغيرة في تباعد الرصاص أو مساحة السطح التي تنشأ من تجميع الأصفاد باليد لن تؤثر بشكل حاسم على معظم النتائج التجريبية. خلال كل جلسة تحفيز، رصدنا الجهد عبر خيوط الكفة باستخدام منظار للتأكد من أن الخيوط لم يتم اختصارها أو كسرها، لكننا لم نتتبع التغيرات في مقاومة الأجهزة المزروعة المحددة لمدة 5-10 أسابيع بعد الزرع. وأفادت دراسة واحدة لجهاز زرع مماثل أن مقاومة لا تزيد بشكل كبير خلال الأسابيع 4 الأولى بعد زرع العمليات الجراحية, يفترض أن الإصابة الحادة تستقر30. في هذه الدراسة، ومع ذلك، لم تكن مرتبطة التغيرات في مقاومة الجهاز مع أداء الجهاز على مدى 8 أسابيع من زرع مزمن: أبلغ المؤلفون عن أي تغيير كبير في العلاقة بين كثافة VNS و السعة المحتملة العمل المركب على مدى عدة أسابيع بعد زرع. هنا، كنا قادرين على التحقق من صحة وظيفيا أداء الكفة بعد 5-10 أسابيع من زرع من قبل (ط) التحقق من أن VNS لا يزال يمكن أن تثير وقف التنفس وإسقاط في SpO2 بما يتفق مع منعكس هيرينغ بروير، و (2) تكرار العمل السابق مما يدل على إعادة تنظيم خريطة السيارات التي تسببها VNS. في عملنا الخاص، وجدنا أن الحث من رد فعل هيرينغ-بروير أن تكون الطريقة الأكثر موثوقية للتحقق من صحة وظيفة طويلة الأجل من الأصفاد VNS مزروعة، والتي قد تظهر انخفاض أداء الجهاز أو الفشل بسبب عدد من العوامل التي لا علاقة لها بتجميع الكفة. وتشمل هذه المضاعفات الجراحية، وتلف الأعصاب، و / أو الأضرار الميكانيكية في الكفة أو غطاء الرأس. إن التقنية الجراحية الممتازة والتحقق من صحة وظائف الجهاز الخاصة بالتطبيق أمر بالغ الأهمية للاستخدام المستقر والناجح لأقطاب الكفة المحفزة التي تم زرعها بشكل مزمن.
لقد وصفنا نهج بسيط وغير مكلف لتجميع أقطاب الكفة العصبية الطرفية للزرع المزمن في الحيوانات الصغيرة وأظهرنا فائدتها في توصيل VNS أثناء التجارب السلوكية للفئران. VNS هو قيد التحقيق على نحو متزايد لمجموعة واسعة من المؤشرات السريرية، بما في ذلك الأمراض الالتهابية مثل التهاب المفاصل الروماتويدي1،2 ومرض كرون،31 فضلا عن الاضطرابات العصبية مثل السكتة الدماغية5،6،7،8 و PTSD10،11. هذه الطريقة التي يمكن الوصول إليها لصنع أقطاب الكفة المحفزة يجب أن تسهل استخدام نماذج القوارض قبل الكلينيكية في مجموعة متنوعة من الدراسات البحثية الانتقالية في آليات وفعالية VNS. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة، وزيادة براعة النهج. على سبيل المثال، يمكن تعديل قطر و/أو طول أنابيب البولي يوريثين لاستيعاب تجارب التحفيز المزمن في أنواع أخرى أو في مواقع الأعصاب الطرفية الأخرى (على سبيل المثال، العصب الوركي أو الفيني أو الزهني). وبدلاً من ذلك، يمكن أن تمكن التكوينات ذات خيوط إضافية التحفيز في مواقع متعددة على طول العصب، أو يمكن أن تستوعب التسجيل المتزامن لإمكانية عمل مركب يثير التحفيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة تكساس في دالاس ومجلس UT من الحكام. ونشكر سولومون غولدينغ، وبيلال حسن، ومرغي جاني، وتشينغ تزو تزو شينغ على المساعدة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
References
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson's disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F.
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
