Summary
Существующие подходы к созданию хронически имплантируемых периферийных нервных манжетных электродов для использования у мелких грызунов часто требуют специального оборудования и/или высококвалифицированного персонала. В этом протоколе мы демонстрируем простой, недорогой подход к изготовлению хронически имплантируемых манжетных электродов и демонстрируем их эффективность для стимуляции блуждающего нерва (VNS) у крыс.
Abstract
Электроды периферических нервных манжет уже давно используются в неврологии и смежных областях для стимуляции, например, блуждающего или седалищного нерва. Несколько недавних исследований продемонстрировали эффективность хронических VNS в повышении пластичности центральной нервной системы для улучшения двигательной реабилитации, обучения вымиранию и сенсорной дискриминации. Строительство хронически имплантируемых устройств для использования в таких исследованиях является сложной задачей из-за небольшого размера крыс, и типичные протоколы требуют обширной подготовки персонала и трудоемких методов микрофабрикации. Кроме того, коммерчески доступные имплантируемые электроды манжеты могут быть приобретены по значительно более высокой цене. В этом протоколе мы представляем простой, недорогой метод для строительства небольших, хронически имплантируемых периферийных нервных электродов для использования у крыс. Мы проверяем краткосрочную и долгосрочную надежность наших манжетных электродов, демонстрируя, что VNS у кетамина/ксилазина анестезированных крыс производит снижение скорости дыхания в соответствии с активацией рефлекса Херинг-Брейера, как во время имплантации, так и до 10 недель после имплантации устройства. Мы также демонстрируем пригодность электродов манжеты для использования в исследованиях хронической стимуляции путем сопряжения VNS с квалифицированной производительностью пресса рычага, чтобы вызвать пластичность моторной корковой карты.
Introduction
В последнее время спрос на хронически имплантируемые манжеты электродов для стимуляции периферических нервов вырос, так как исследования все чаще демонстрируют доклинную полезность этой методикидля лечения многочисленных воспалительных заболеваний 1,,2,,3 и неврологических расстройств4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15. Хронический VNS, например, было показано, для повышения неокортической пластичности в различных контекстах обучения,улучшение мотор реабилитации 4,,5,6,,,7,,8,вымирание обучения 10,11,12,13,14,и сенсорнойдискриминации 15. Коммерчески доступные периферийные нервные манжеты электродов часто ассоциируются с увеличенными сроками выполнения заказа и относительно высокими затратами, что может ограничить их доступность. Кроме того, протоколы для "внутреннего" изготовления хронически имплантируемых электродов манжеты остаются ограниченными, и анатомия грызунов представляет особые проблемы из-за их небольшого размера. Текущие протоколы строительства манжетных электродов для экспериментов с хроническими грызунами часто требуют использования сложного оборудования и техники, а также тщательного обучения персонала. В этом протоколе мы демонстрируем упрощенный подход к изготовлению манжеты электрода на основе ранее опубликованных ишироко используемых методов 16,17. Мы проверяем функциональность наших хронически имплантированных электродов у крыс, демонстрируя, что во время имплантации манжеты вокруг левого блуждающего нерва шейки матки стимуляция, применяемая к электродам манжеты, успешно производила прекращение дыхания и падение SpO2. Стимуляция афферентных легочных рецепторов вагальных волокон, как известно, заниматься Hering-Breuer рефлекс, в котором ингибирование нескольких дыхательных ядер в стволе мозга приводит к подавлению вдохновения18. Таким образом, прекращение дыхания в соответствии с рефлексом Херинг-Брейер, и в результате падения SpO2, обеспечивают простой тест на надлежащее имплантации электродов и манжеты функции у анестезированых крыс. Для проверки долгосрочной функциональности хронически имплантированных электродов манжеты, рефлекторные реакции измерялись во время имплантации и сравнивались с ответами, полученными у тех же животных через шесть недель после имплантации. Вторая группа крыс была имплантирована с электродами манжеты VNS после поведенческой тренировки на задаче нажатия рычага. У этих крыс, VNS в паре с правильной производительности задачи производится реорганизация корковой моторной карты, в соответствии сранее опубликованными исследованиями 19,20,21,22. Во время моторного коркового картирования под наркозом, которое произошло через 5-10 недель после имплантации устройства, мы дополнительно подтвердили функцию манжеты у обработанных VNS животных, подтвердив, что VNS успешно индуцировал прекращение дыхания и более чем на 5% падение SpO2.
Недавно опубликованные протоколы от Чайлдси др. 17 и Риоси др. 16 обеспечивают хорошо проверенную отправную точку для упрощенного подхода изготовления электродов манжеты, так как этот популярный метод был использован несколькими лабораториями, проводящими хронические исследования VNSу грызунов 1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. Оригинальный метод включает в себя несколько высокоточных шагов для манипулирования тонкой микропроводов, так что изготовление манжет электродов занимает более часа, и обширная подготовка для выполнения надежно. Упрощенный подход, описанный здесь, требует значительно меньше материалов и инструментов и может быть завершен менее чем за один час минимально подготовленным персоналом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные в этом протоколе, осуществляются в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Техасского университета в Далласе.
1. Стимулирование изготовления электродов манжеты
- Подготовьте манжеты трубки.
- Используя лезвие бритвы, вырежьте кусок полимерной трубки длиной 2,5 мм. Вставьте типсы советы или замыкание через трубы и использовать лезвие, чтобы сделать щель вдоль через стену труб с одной стороны манжеты.
- Снимите типсы с трубки и вставьте большую швейную иглу через середину манжеты, перпендикулярно длинной оси. Вставьте иглу через щель (вверху) и в центр трубки напротив (внизу). Поместите иглу в пенную доску, чтобы закрепить манжету на месте во время остальных этапов сборки.
- Поместите шов для обеспечения закрытия манжеты во время имплантации.
- Вставьте небольшую швейную иглу через стену манжеты, на средней линии, примерно 0,5 мм от верхней щели с одной стороны. Вставьте иглу от интерьера к внешней, чтобы избежать повреждения манжеты трубки. Вставьте 2 см длиной 6/0 шва через глаз иглы и потяните иглу через стену трубки, чтобы нить шва в манжету.
- Оставив нить на месте, снимите иглу и проколите второе отверстие через трубчатую стену примерно на 0,5 мм ниже первого отверстия, вдоль средней линии манжеты. Вставьте шов через глаз иглы и потяните иглу через трубную стену, чтобы снова пронизать шов через манжету.
- Оба конца шва нить теперь должна быть на внешней стороне манжеты. Отрегулируйте шов так, чтобы 1,5 см простирается от верхнего отверстия, а 0,5 мм простирается от нижнего отверстия.
- Нанесите небольшое количество клея УФ-лечения на короткий конец шва, простирающийся от нижнего отверстия, и потяните более длинный конец шва до тех пор, пока нижний хвост почти не заподлицо с внешней стенкой труб. Используйте УФ-палочку, чтобы вылечить клей и держать шов твердо на месте.
- Повторите шаги 1.2.1 через 1.2.3 на противоположной стороне манжеты.
- Поместите platinum:Iridium (Pt:Ir) провода приводит.
- Используйте небольшую швейную иглу, чтобы сделать 4 отверстия в манжете стены. Каждая пара отверстий должна быть помещена примерно на 0,5-0,8 мм от перпендикулярной средней линии, с отверстием примерно 0,5-0,8 мм от верхней щели по обе стороны манжеты.
ВНИМАНИЕ: Для наиболее последовательного и точного размещения приводит, вставьте иглу из интерьера в внешний вид, чтобы сделать все отверстия, используя шов размещения в качестве руководства. - Вставьте швейную иглу снова, на этот раз работает от экстерьера к интерьеру, через свинцовое отверстие 1. Вставьте около 0,5 см 7,5 см длиной Pt:Ir провода через глаз иглы и тянуть иглу через трубы, чтобы нить провода привести через манжету стены. Отрегулируйте проволоку так, чтобы 4,5 см простираются на внешней стороне манжеты(рисунок 1A).
- Вставьте иглу через свинцовое отверстие 1 снова, снова работает снаружи в интерьер, и дополнительно вставить иглу через свинцовое отверстие 2 непосредственно напротив свинцового отверстия 1. Вставьте 0,5 см более короткого (внутреннего) конца проволоки Pt:Ir через глаз иглы и потяните иглу через трубу, чтобы пронизать проволоку свинцом через стенки манжеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба конца провода Pt:Ir теперь должны быть на внешней стороне манжеты, и проволочная петля образуется вокруг края щели и через свинцовое отверстие 1 (Рисунок 1B). - Повторите шаги 1.3.1 через 1.3.3 для того чтобы поместить провод Pt:Ir через отверстия провода 3 и 4.
- Используя бутановую зажигалку, аккуратно снимите изоляцию с длины 5-6 мм в конце проводов Pt:Ir, простирающихся от свинцового отверстия 2 и свинцового отверстия 4.
ВНИМАНИЕ: Изолировать концы приводит от остальной части манжеты сборки тщательно, чтобы избежать повреждения манжеты. Используйте инструменты, чтобы держать провода, чтобы избежать травм. - Выровнять голый провод внутри манжеты, чтобы разместить приводит в их конечных местах. Для этого аккуратно потяните на конец провода Pt:Ir, простирающийся от отверстия 1 до тех пор, пока не будет промыта неинсулированная часть провода отверстием 1. Повторите с другим свинцом, чтобы выровнять неинсулированный конец провода резьбой через свинцовые отверстия 3 и 4.
- Нанесите небольшое количество клея УФ-лечения на проволочные петли на внешней стороне манжеты при свинцовом отверстии 1 и 3. Используйте УФ палочку для лечения клея и обеспечить приводит на месте.
- Используйте небольшой наконечник пипетки, чтобы подтолкнуть неинсулированный Pt:Ir провода ведет к внутренней стене манжеты. После того, как провода на месте, сократить концы проводов, простирающихся от свинца отверстия 2 и 4, так что примерно 1 мм провода простирается за пределы внешней стороны манжеты стены.
- Сложите 1 мм хвосты проволоки плашмя против внешней поверхности манжеты, заботясь, чтобы не замыкать их вместе. Нанесите небольшое количество клея УФ-лечения, чтобы просто покрыть два хвоста и вылечить клей, чтобы обеспечить размещение свинца и обеспечить электрическую изоляцию.
ВНИМАНИЕ: Важно, чтобы полностью покрыть внешне подвергаются Pt:Ir поверхностей с клеем, чтобы изолировать провода и избежать вне цели стимуляции.
- Используйте небольшую швейную иглу, чтобы сделать 4 отверстия в манжете стены. Каждая пара отверстий должна быть помещена примерно на 0,5-0,8 мм от перпендикулярной средней линии, с отверстием примерно 0,5-0,8 мм от верхней щели по обе стороны манжеты.
- Безопасные Pt:Ir провода приводит на место с шовной защиты.
- Снимите большую иглу с манжеты сборки из пены борту. Вставьте 3 см длиной 6/0 шва через глаз иглы и потяните иглу через трубы, чтобы нить шва через дно манжеты в середине.
- Переключитесь на небольшую швейную иглу, чтобы завершить шов резьбы для Pt:Ir свинца обеспечения. Вставьте иглу через то же отверстие средней линии, работая снова от интерьера к внешней, чтобы избежать деформации труб и провода приводит. Вставьте внешний хвост шва через глаз иглы и потяните иглу через манжету стены, чтобы создать петлю шва по краю манжеты (Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте типсы и работать под микроскопом, чтобы обеспечить шв ориентирован вдоль длинной оси манжеты и лежит плашмя против труб. Этот шаг гарантирует, что провода остаются разделенными на внутренней стороне манжеты и проводятся на месте боковой к манжете средней линии. - Создайте вторую петлю вокруг противоположного конца манжеты, связав концы шва в половину узла, на внешней стороне манжеты. Убедитесь, что шов проходит вдоль длинной оси манжеты и лежит плашмя против труб. Удерживая узел плотно, чтобы он лежит плашмя против труб, применить небольшое количество УФ-лечения клей на половину узла и вылечить провести на месте.
- Аккуратно разрежьте концы швовой нити как можно ближе к узлу. При необходимости используйте небольшое количество дополнительного клея УФ-лечения, чтобы приклеить короткие концы шва, чтобы они лежали плашмя противтруб (рисунок 1D).
- Соллер разъем булавки для Pt:Ir провода приводит.
- Используя зажигалку бутана, удалите изоляцию с 3 мм в конце каждого из проводов Pt:Ir. Solder сторона чашки золотой штырь (см. Таблица материалов) к uninsulated концу каждого свинца.
- Проверьте наглость собранного устройства.
- Подключите золотые булавки к входным данным модуля проверки LCR или электрода и установите частоту испытаний до 1 кГц. Погрузите манжеты трубки (и Pt:Ir стимуляции контактов интерьера к манжете) в небольшой стакан заполнен солевым раствором, заботясь, чтобы сохранить золото свинца булавки и зонд разъемы сухой. Убедитесь, что собранная манжета имеет impedance на 1 кГц менее 2 кЗ, прежде чем приступить к имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая неуступчивости часто указывает на неадекватные Pt:Ir поверхности подвергаются, которые могут возникнуть из-за таких факторов, как недостаточное удаление изоляции, случайное применение клея в манжете интерьера, сломанной проволоки нити и т.д. Манжеты также должны быть проверены на сломанные или плохо расположенные нити проволоки, которые могут привести к коротким контактам с долгосрочным использованием.
- Подключите золотые булавки к входным данным модуля проверки LCR или электрода и установите частоту испытаний до 1 кГц. Погрузите манжеты трубки (и Pt:Ir стимуляции контактов интерьера к манжете) в небольшой стакан заполнен солевым раствором, заботясь, чтобы сохранить золото свинца булавки и зонд разъемы сухой. Убедитесь, что собранная манжета имеет impedance на 1 кГц менее 2 кЗ, прежде чем приступить к имплантации.
2. Конструкция головной крышки
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры сборки Headcap аналогичны тем, которые были опубликованы ранее (Childs et al.17), и суммируются здесь для удобства.
-
Соберите головной колпак17
- Вырезать два небольших кусочка 30 AWG проволоки обернуть, один 13 мм в длину и один 10 мм в длину. Смойте изоляцию на 1,5 мм с каждого конца обоих проводов. Solder контактный бок золотой булавки на один конец каждого провода, как можно ближе к чашке, как это возможно. Используйте проволочные резаки, чтобы отрезать избыточную длину булавки за припой сустава.
- Solder другие концы проводов AWG к двум центральным припой чашки 4-контактный разъем микрострип.
- Согните проволочную головку, которая ведет к разъему, и поместите золотые булавки плашмя против разъема, параллельно друг другу, как показано на рисунке 2A. Штифт, подключенный к более короткой проволоке, должен быть помещен под штифт, подключенный к более длинной проволоке. Используйте акрил ногтя, зубной цемент, или уф-лекарство клей для обеспечения головной колпак приводит на месте.
3. Использование устройства
- Имплантация манжеты электродов для хронической стимуляции блуждающего нерва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры должны проводиться с использованием стерильной или асептической техники под надлежащей анестезией, в соответствии с Руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и с одобрения местного МАКУК. Следующие процедуры призваны проиллюстрировать репрезентативное использование устройства и не предназначены для всеобъемлющего использования.- Поместите крысу в стереотаксисную раму и сделайте сагитальный разрез над теменной и затылочной костями, чтобы выявить поверхность черепа для имплантации головного мозга/разъема. Тщательно просверлите 4 отверстия в черепе и поместите ювелирные винты. Используйте зубной акрил для обеспечения головной колпак к черепу и винты.
- Снимите крысу со стереотаксиаической рамы и положите на правую сторону. Сделайте вертикальный разрез кожи на левой стороне шеи и тщательно рассекйте левый блуждающий нерв из сонной артерии, расположенный между стерномастроидными и стернохиоидными мышцами и под омохиоидной мышцей.
- Туннель манжеты ведет подкожно к черепу. Подключите провода к головной чаше с помощью золотых булавок.
- Поместите блуждающий нерв внутри манжеты и закрелите устройство закрытым, завязав двойной узел в швах манжеты. Будьте осторожны, чтобы избежать повреждения нерва во время имплантации, манипулируя нерва с тупыми, непроводящих крючков или захвата соединительной ткани, окружающей нерв.
- Проверьте имплантат, применив стимуляцию к устройству (10 с поездом 0,8 мА, 30 Гц, 100 бифазных импульсов). Правильная имплантация приведет к прекращению дыхания и падению SpO2 из 5% и более.
- Обложка золотые булавки и подвергаются приводит с зубным акрилом, закрыть раны с швами, и очистить разрез сайтов с солевым раствором, алкоголем и повиденым йодом.
- Обеспечить замену жидкостей, анальгетиков и послеоперационного ухода в соответствии с руководящими принципами NIH и одобрением МАКУК.
- Стимулировать блуждающий нерв во время бодрствования поведения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доставка VNS, как животные выполняют конкретные задачи двигателя ранее было показано, расширить представление моторной карты задачи соответствующих мускулатуры. Мы используем эту проверенную парадигму, чтобы обеспечить репрезентативный пример использования устройства, но многие другие поведенческие парадигмы и/или параметры стимуляции могут иметь отношение к альтернативным приложениям. Крысы были обучены навыкам на рычаге нажмите задачу, используемую здесь до имплантации устройства. После операции, хорошая производительность была вновь проверена до доставки VNS: крысы выполнили по крайней мере 100 успешных испытаний в двух 30 мин учебных занятий в день. VNS был в паре с правильными давлениями рычага во время 10 последующих тренировок в течение 5 дней.- Подключите крысу к генератору стимулов с помощью имплантированного головного колпачка и приспособиться к соответствующим настройкам стимуляции. Для реорганизации моторной корковой карты, вызванной VNS, соедините каждый правильный рычаг с одним поездом из 15 бифазных импульсов, каждый с шириной 100 и амплитудой 800 ЗА, поставляемых с частотой 30 Гц.
- Стимуляционный поезд доставляется сразу после обнаружения каждого успешного давления рычага в течение десяти 30 минут тренировок. Во время VNS-доставки используйте осциллоскоп для мониторинга успешной доставки текущей стимуляции.
- Проверка хронически имплантированных функций манжеты.
- В течение 24 ч последней тренировки в паре СНС используйте внутричерепную микростимуляцию (ICMS) для количественной оценки функциональной соматотопической картыв моторной коре 19,,20,,21,,22.
- После индукции анестезии для ICMS отображение моторной коры, проверить функцию манжеты снова, применяя 10 с поездом 30 Гц, 0,8 мА текущей стимуляции (100 бифазных импульсов), что должно привести к прекращению дыхания и снижение уровня SpO2, по крайней мере 5%, в соответствии с hering-Breuer рефлекс.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от применения функция манжеты может считаться приемлемой,если наблюдается надежное падение SpO 2 менее чем на 5%, или если более высокие амплитуды тока (до 1,6 мА) надежно производят по крайней мере 5% снижение SpO2. Несоблюдение прекращения дыхания и/или надежного снижения SpO2 свидетельствует о отказе имплантата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вагус нерва манжеты электроды и головные клетки были хронически имплантированы в крыс в соответствии сранее опубликованными хирургическими процедурами 17,19,20,21,22. До имплантации, impedance на 1 кГц был измерен через манжеты приводит с манжеты трубки погружены в солевой раствор (импеданность 1,2 х 0,17 кЗ (средний) N No 9). Были имплантированы только манжеты с отклонениями менее 2 кЗ в солевой раствор; все манжеты соответствовали этому критерию (0/9 манжеты исключены). Во время операций по имплантации функциональная проверка всех манжет была проведена путем тестирования на стимуляцию индуцированного краткого прекращения дыхания и последующего падения насыщения крови кислородом, приписываемого рефлексу Херинга-Брейера. Чтобы вызвать этот ответ, 10 с поездом 30 Гц, 0,8 мА текущей стимуляции (100 бифазных импульсов) был доставлен через манжеты приводит. Для 9/9 имплантированных манжет, мы наблюдали VNS-индуцированного прекращения дыхания в течение 10 сек стимуляции, которая сопровождалась падением в SpO2, по крайней мере 5% (% изменение в SpO2 - -10,3 и 3,2%, среднее - std; диапазон -5,7 до -14,5%), подтверждающие функцию манжеты и надлежащей имплантации. Во время первоначальной имплантации мы обнаружили значительную корреляцию между первоначальными показаниями SpO2 и процентным изменением SpO2, вызванным VNS(рисунок 2B; R2 0,60, р 0,0083, линейная корреляция Пирсона), в соответствии с опубликованной литературой, демонстрирующей, что глубина анестезии влияет на величину рефлекса Херинга-Брейера23,24. Чтобы проверить долгосрочную функциональность хронически имплантированных манжет, крысы были анестезированы снова 6 недель после имплантации устройства и VNS был применен, чтобы вызвать Hering-Breuer рефлекторной реакции. Для 7 из 9 устройств, мы наблюдали более чем на 5% падение SpO2 с использованием 10 с поездов 0,8 мА, 30 Гц стимуляции(рисунок 2C). В этих устройствах, величина стимуляции вызванных изменения в SpO2 не отличается от того, что наблюдается при первоначальной имплантации, предполагая отличную постоянную производительность хронически имплантированных устройств (начальное изменение % в SpO2 - -9,7 и 3,4%, окончательное % изменение в SpO2 - -15,8 и 6,5%, средний й std; p 0,08, пара тест т-тест). В остальных 2 устройствах, увеличение амплитуды стимуляции до 1,6 мА было достаточно, чтобы вызвать надежное снижение SpO2, по крайней мере 5%, предполагая, что эти устройства продолжали функционировать, но что изменения в impedance, повреждение нерва, или манжеты ориентации с течением времени, возможно, привело к снижению производительности.
Для дальнейшего тестирования долгосрочной функциональности наших хронически имплантированных стимулирующих электродов, вторая группа крыс была обучена по упрощенной версии квалифицированного достижения рычага давления задача, разработанная Hays et al. для количественной оценки производительности двигателя forelimb25. Многочисленные исследования показали, что сопряжение VNS с правильной производительностью двигателя на этой задаче приводит к расширению проксимального представления forelimb в первичноймоторной коре 19,20,21,22. В нашем упрощенном варианте задачи, крысы должны были достичь 2 см за пределами тренировочной кабины, чтобы полностью угнетать рычаг, а затем освободить его в течение 2 с, чтобы получить награду пищи(рисунок 2D). Звери получали две 30-минутные тренировки в день, пока они не достигли стабильного уровня знаний по этой задаче (на 65% правильно, 100 проб/сессий, по крайней мере 8/10 последовательных сеансов). Крысы затем перенесли операцию по имплантации стимулирующей манжеты электрода вокруг их левого блуждающего нерва. После восстановления после операции, акклиматизации к стимулирующим кабелям и возвращения к опытным поведенческим показателям крысы получили дополнительные 10 тренировок, в которых VNS (0,5 с поездом 0,8 мА, 30 Гц импульсов; 100 бифазной ширины пульса), или фиктивная стимуляция (без стимуляции), была доставлена во время правильного высвобождения рычага. В течение 24 ч после последней тренировки в паре с VNS крысы были обезболены кетамином/ксилазином (80/10 мг/кг, то есть), была протестирована функция электрода манжеты, а картирование корковых двигателей проводилось в соответствии с опубликованнымипроцедурами 22. В соответствии с предыдущими исследованиями, демонстрирующими, что VNS диски расширения задачи соответствующих представлений моторной карты, VNS обработанных крыс (N No 3) выставлены значительно больше проксимальных forelimb (PFL) представлений, чем фиктивные обработанные крысы (N No 4) в нашем исследовании (Рисунок 2D; ПФЛ % от общей площади карты, средняя - SEM: фиктивная - 15,6 - 6,7%, VNS - 38,3 - 1,0%; р 0,035, 2-образный т-тест, тестовая мощность 0,8). Во всех животных, обработанных VNS, функция манжеты была проверена после индукции анестезии во время картирования, 5-10 недель после имплантации, подтвердив более 5% изменения в SpO2 произошло в ответ на VNS (10 с поездом 0,8 мА, 30 Гц импульсов; 100 бифазной ширины импульса).
Рисунок 1: Сборка стимулирующих электродов манжеты. (A) После обеспечения швов по обе стороны от манжеты, Pt:Ir проволоки могут быть резьбой через манжеты стены на отверстие #1 (белая наконечник стрелы) с помощью швейной иглы. (B) Pt: Ir проволоки правильно резьбовые и готовы к деизоляции после создания проволоки петли вокруг края манжеты и резьбы провода снова через отверстие #1 (белая наконечник стрелы) и через манжету через отверстие #2 (желтая наконечник стрелы). (C) После того, как оба приводит на месте, обеспечить первый свинца путем резьбы шва через отверстие средней линии и вокруг края манжеты (желтая наконечник стрелы). (D) Закройте петлю вокруг второго свинца с половиной узла и клея на месте для завершения сборки манжеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Использование устройства для хронической стимуляции блуждающего нерва в бодрствующий ведет себя крыс. (A)Сборка головного колпачка. (B)Во время имплантации устройства, VNS-вызванные сокращения в SpO2 были коррелированы с первоначальными показаниями SpO2 (R2 и 0.602, p 0.008, линейная корреляция Пирсона). (C) Сравнение VNS-вызванных SpO2 капель, полученных при имплантации устройства по сравнению с прекращением экспериментов стимуляции 6 недель спустя. Линии указывают на пары измерений для отдельных крыс. Стимуляция в панелях B и C состояла из одного 10-процентного поезда из 100 бифазных импульсов, доставленных на 0,8 мА и 30Гц.( D ) Крыса с хронически имплантированными электродами VNS манжеты выполнения задачи рычага давления. (E) VNS (0,5 с поездом 0,8 мА, 30 Гц, 100 бифазных импульсов) в паре с правильной производительностью рычага-пресса расширили представление карты соответствующей задачи мускулатуры в моторной коре. Крысы, получившие VNS в паре с правильной производительностью пресса рычага (N No 3), продемонстрировали значительно больший процент площади моторной карты, посвященной проксимальной переделе (PFL) по сравнению с крысами, которые получили стимуляцию Sham (N No 4). Точки показывают представления ПФЛ для отдельных субъектов; Бары ошибок указывают на то, что лечение SEM. VNS с последующим моторным корковым картированием проводилось через 5-10 недель после имплантации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем простой, недорогой подход к сборке хронически имплантируемых стимулирующих электродов манжеты для использования у грызунов, облегчая доклинические исследования этой формирующейся терапии. Этот упрощенный метод не требует специальной подготовки или оборудования, и использует небольшое количество инструментов и принадлежностей, которые легко доступны для большинства исследовательских лабораторий, снижение денежных и трудовых затрат на изготовление устройств посравнению с другими подходами 16,26,27,28. Уход требуется на протяжении всей сборки, чтобы избежать чрезмерного применения клея УФ-лечения, обеспечивая при этом адекватную механическую стабильность швов и Pt:Ir приводит к долгосрочной функции манжеты. Чрезмерное клей усложняет имплантацию устройства и может раздражать окружающие ткани после операции, в то время как недостаточное клей увеличивает вероятность того, что с течением времени приводит не может поддерживать хороший контакт с нервом, в результате снижения производительности устройства или отказа. Последовательное размещение де-изолированных pt:Ir проводов внутри манжеты люмена также имеет решающее значение для достижения низких impedances и хорошую производительность устройства. Следует позаботиться о том, чтобы должным образом выровнять деизоляционный провод таким образом, чтобы максимально возможная поверхность открытой проволоки сидела внутри манжеты, в то время как никакой открытый провод не существует внешне.
Мы подтвердили, что наш подход производит манжеты такого же размера и надежности, как те, которые в настоящее время в общем использовании несколькими лабораториями для хронической доставки VNS укрыс 4,,,5,6,6, 7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,19,,20,,21,,22. Недавние исследования показывают, что периферические нервные волокна также набираются с использованием широкого спектра размеров контакта электродови ориентаций 16,29, предполагая, что этот протокол может быть адаптирован для многих экспериментов, требующих стимуляции периферического нерва, и что небольшие изменения в интервалах между свинцом или поверхности области, которые возникают в результате сборки манжет вручную не будет критически влиять на большинство экспериментальных результатов. Во время каждого сеанса стимуляции, мы отслеживали напряжение через манжеты приводит с помощью осциллоскопа, чтобы убедиться, что приводит не были короткие или сломанной, но мы не отслеживать изменения в impedance для конкретных имплантированных устройств в течение 5-10 недель после имплантата. В одном исследовании аналогичного имплантированного устройства сообщалось, что в течение первых 4 недель после хирургической имплантации, предположительно, в то время как острая травмастабилизируется на 30. В этом исследовании, однако, изменения в аппарате impedance не коррелировали с производительностью устройства в течение 8 недель хронической имплантации: авторы сообщили о никаких существенных изменений в взаимосвязи между интенсивностью VNS и комплекс действий потенциальной амплитуды в течение нескольких недель после имплантации. Здесь мы также смогли функционально проверить производительность манжеты после 5-10 недель имплантации (i) проверка того, что VNS все еще может вызвать прекращение дыхания и падение SpO2 в соответствии с рефлексом Херинг-Брейер, и (ii) репликации предыдущей работы, демонстрирующей VNS-индуцированной реорганизации моторной карты. В нашей собственной работе, мы нашли индукции Hering-Breuer рефлекс, чтобы быть наиболее надежным способом проверки долгосрочной функциональности имплантированных манжет VNS, которые могут проявлять снижение производительности устройства или отказ из-за ряда факторов, не связанных с манжетами сборки; к ним относятся хирургические осложнения, повреждение нерва и/или механическое повреждение манжеты или головного мозга. Отличная хирургическая техника и применение-специфической проверки функциональности устройства имеет решающее значение для стабильного и успешного использования хронически имплантированных стимулирующих электродов манжеты.
Мы описали простой, недорогой подход к сборке электроодов периферических нервных манжет для хронической имплантации у мелких животных и продемонстрировали его полезность для доставки VNS во время поведенческих экспериментов крыс. VNS все чаще расследуется для широкого спектра клинических показаний, в том числе воспалительных заболеваний,таких как ревматоидный артрит 1,2 и болезньКрона, 31, а также неврологические расстройства, такие как инсульт5,6,7,8 и ПТСР 10,11. Этот доступный метод для создания стимулирующих электродов манжеты должен облегчить использование доклинических моделей грызунов в различных трансляционных исследованиях механизмов и эффективности VNS. Протокол легко адаптируется, что еще больше увеличивает универсальность подхода. Например, диаметр и/или длина полиуретановых труб могут быть изменены для размещения экспериментов с хронической стимуляцией у других видов или в других участках периферических нервов (например, седалищных, френических или сакральных нервов). Кроме того, конфигурации с дополнительными приводит может позволить стимуляции на нескольких участках вдоль нерва, или может вместить одновременное запись стимуляции вызванных комплексом потенциал действия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Техасским университетом в Далласе и Советом регентов UT. Мы благодарим Соломона Голдинга, Билаала Хасана, Марги Джани и Чинг-цзы Цзэна за техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
References
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson's disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F.
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
