Summary
Eksisterende tilnærminger for å konstruere kronisk implanterbare perifere nervemansjetter for bruk hos små gnagere krever ofte spesialisert utstyr og / eller høyt utdannet personell. I denne protokollen demonstrerer vi en enkel, rimelig tilnærming for å fremstille kronisk implanterbare mansjettelektroder, og demonstrere deres effektivitet for vagus nervestimulering (VNS) hos rotter.
Abstract
Perifere nerve cuff elektroder har lenge vært brukt i nevrovitenskap og relaterte felt for stimulering av for eksempel vagus eller isjiasnerver. Flere nyere studier har vist effektiviteten av kronisk VNS i å forbedre sentralnervesystemet plastisitet for å forbedre motorrehabilitering, utryddelseslæring og sensorisk diskriminering. Bygging av kronisk implanterbare enheter for bruk i slike studier er utfordrende på grunn av rotters lille størrelse, og typiske protokoller krever omfattende opplæring av personell og tidkrevende mikrofabrikasjonsmetoder. Alternativt kan kommersielt tilgjengelige implanterbare mansjettelektroder kjøpes til en betydelig høyere pris. I denne protokollen presenterer vi en enkel, rimelig metode for bygging av små, kronisk implanterbare perifere nervemansjettlektroder for bruk hos rotter. Vi validerer den kortsiktige og langsiktige påliteligheten til våre mansjettelektroder ved å demonstrere at VNS i ketamin / xyazine bedøvet rotter produserer reduksjon i pustefrekvens i samsvar med aktivering av Hering-Breuer refleks, både på tidspunktet for implantasjon og opptil 10 uker etter apparatimplantasjon. Vi viser videre egnetheten til mansjettelektrodene for bruk i kroniske stimuleringsstudier ved å pare VNS med dyktig spakpresseytelse for å indusere motorkortikal kartplastisitet.
Introduction
Nylig har etterspørselen etter kronisk implanterbare mansjettelektroder for stimulering av perifere nerver vokst, da studier i økende grad viser den prekliniske nytten av denne teknikken for behandling av mange inflammatoriskesykdommer 1,2,3 og nevrologiskelidelser 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Kronisk VNS, for eksempel, har vist seg å forbedre neokortikale plastisitet i en rekke læringssammenhenger, forbedre motor rehabilitering4,5,6,7,8, utryddelse læring10,11,12,13,14, og sensorisk diskriminering15. Kommersielt tilgjengelige perifere nervemansjetlektroder er ofte forbundet med utvidede tider for ordreoppfyllelse og relativt høye kostnader, noe som kan begrense tilgjengeligheten. Alternativt forblir protokoller for "in-house" fabrikasjon av kronisk implanterbare mansjettelektroder begrenset, og gnageranatomi presenterer spesielle utfordringer på grunn av deres lille størrelse. Nåværende protokoller for å konstruere mansjettelektroder for kroniske gnagereksperimenter krever ofte bruk av komplekst utstyr og teknikker, samt omfattende opplært personell. I denne protokollen demonstrerer vi en forenklet tilnærming til mansjettelektrodefabrikasjon basert på tidligere publiserte og mye bruktemetoder 16,,17. Vi validerer funksjonaliteten til våre kronisk implanterte elektroder hos rotter ved å demonstrere at på tidspunktet for mansjettimplantasjon rundt venstre cervical vagus nerve, stimulering brukt på mansjettelektrodene vellykket produsert en opphør av pust og fall i SpO2. Stimulering av afferent lungereseptor vagalfibre er kjent for å engasjere Hering-Breuer refleks, der hemming av flere respiratoriske kjerner i hjernestammen resulterer i undertrykkelse inspirasjon18. Dermed gir opphør av pusten i samsvar med Hering-Breuer-refleksen, og den resulterende nedgangen i SpO2, en enkel test for riktig elektrodeimplantasjon og mansjettfunksjon hos bedøvede rotter. For å validere den langsiktige funksjonaliteten til kronisk implanterte mansjettelektroder ble refleksresponser målt på implantasjonstiden og sammenlignet med svarene som ble oppnådd hos de samme dyrene seks uker etter implantasjon. En annen gruppe rotter ble implantert med VNS mansjettelektroder etter atferdstrening på en spakpressende oppgave. I disse rotter, VNS sammen med riktig oppgave ytelse produsert omorganisering av kortikale motor kartet, i samsvar med tidligere publiserte studier19,20,21,22. På tidspunktet for motorkortikale kartlegging under anestesi, som skjedde 5-10 uker etter implantasjon av enheten, validerte vi ytterligere mansjettfunksjonen hos VNS-behandlede dyr ved å bekrefte at VNS vellykket induserte en opphør av pusten og en større enn 5% nedgang i SpO2.
De nylig publiserte protokollene fra Childs et al.17 og Rios et al.16 gir et godt validert utgangspunkt for en forenklet mansjettelektrodefabrikasjon tilnærming, da denne populære metoden har blitt benyttet av flere laboratorier som utfører kroniske VNS-studier hos gnagere1,2,3,,4,5,6,7,8,9,10,11. Den opprinnelige metoden innebærer flere høypresisjonstrinn for å manipulere de fine mikroledningene slik at mansjettelektrodefabrikasjon tar over en time å fullføre, og omfattende opplæring for å utføre pålitelig. Den forenklede tilnærmingen som er beskrevet her krever betydelig færre materialer og verktøy og kan fullføres på under en time av minimalt opplært personell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen utføres i samsvar med NIH Guide for care and use of Laboratory Animals og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of The University of Texas i Dallas.
1. Stimulerende mansjett elektrode fabrikasjon
- Forbered mansjetten slange.
- Bruk et barberblad, kutt et stykke polymerrør 2,5 mm i lengde. Sett tangspissene eller en binders gjennom slangen, og bruk bladet til å lage en spalte på langs gjennom veggen på slangen på den ene siden av mansjetten.
- Fjern tangen fra slangen og sett inn en stor synål gjennom midtlinjen på mansjetten, vinkelrett på den lange aksen. Sett nålen gjennom spalten (øverst) og inn i midten av slangen motsatt (bunn). Plasser nålen i skumbrettet for å feste mansjetten på plass under de resterende monteringstrinnene.
- Plasser suturen for å sikre mansjettlukking under implantasjon.
- Sett den lille synålen gjennom mansjettens vegg, på midtlinjen, ca. 0,5 mm fra den øverste spalten på den ene siden. Sett nålen fra innvendig til utvendig for å unngå å skade mansjetten. Sett inn en 2 cm lengde på 6/0 sutur gjennom nåløyets øye og trekk nålen gjennom veggen på slangen for å tre suturen inn i mansjetten.
- La tråden være på plass, fjern nålen og punkter et hull gjennom rørveggen ca. 0,5 mm under det første hullet, langs midtlinjen på mansjetten. Sett suturen gjennom nåløyets øye og trekk nålen gjennom rørveggen for igjen å tre suturen gjennom mansjetten.
- Begge ender av suturtråden skal nå være på utsiden av mansjetten. Juster suturen slik at ~1,5 cm strekker seg fra det øverste hullet, og ~0,5 mm strekker seg fra det nederste hullet.
- Påfør en liten mengde UV-herdelim på den korte enden av suturen som strekker seg fra det nedre hullet og trekk den lengre suturenden til den nedre halen nesten er i flukt med den ytre veggen i slangen. Bruk UV-staven til å kurere limet og hold suturen godt på plass.
- Gjenta trinn 1.2.1 til 1.2.3 på motsatt side av mansjetten.
- Plasser Wireledningene platinum:Iridium (Pt:Ir).
- Bruk den lille synålen til å lage 4 hull i mansjettveggen. Hvert par hull skal plasseres ca. 0,5–0,8 mm fra vinkelrett midtlinje, med et hull ca. 0,5–0,8 mm fra den øverste spalten på hver side av mansjetten.
FORSIKTIG: For den mest konsistente og nøyaktige plasseringen av ledningene, sett nålen fra innvendig til utvendig for å lage alle hull, ved hjelp av suturplasseringen som en guide. - Sett inn synepinnen igjen, denne gangen arbeider fra eksteriør til interiør, gjennom blyhull 1. Sett ca. 0,5 cm av en 7,5 cm lang Pt:Ir-ledning gjennom nålens øye og trekk kanylen gjennom slangen for å tre tråden gjennom mansjettveggen. Juster ledningen slik at ~4,5 cm strekker seg på utsiden av mansjetten (figur 1A).
- Sett nålen gjennom blyhull 1 igjen, igjen arbeider utvendig til interiør, og sett i tillegg nålen gjennom blyhull 2 rett overfor blyhull 1. Sett inn ~ 0,5 cm av den kortere (innvendige) enden av Pt:Ir-ledningen gjennom nålens øye og trekk nålen gjennom slangen for å tre ledningen gjennom mansjettveggene.
MERK: Begge ender av Pt:Ir-ledningen skal nå være på utsiden av mansjetten, og en trådsløyfe dannes rundt spaltekanten og gjennom blyhull 1 (figur 1B). - Gjenta trinn 1.3.1 til og med 1.3.3 for å plassere Pt:Ir-ledningen gjennom blyhull 3 og 4.
- Bruk en butanlighter til å forsiktig fjerne isolasjonen fra en 5–6 mm lengde på slutten av Pt:Ir-ledninger som strekker seg fra blyhull 2 og blyhull 4.
FORSIKTIG: Isoler endene av ledningene fra resten av mansjetten nøye for å unngå å skade mansjetten. Bruk verktøy for å holde ledningene for å unngå skade. - Juster den nakne ledningen inne i mansjetten for å plassere ledningene på deres endelige steder. For å gjøre dette, trekk forsiktig på enden av Pt:Ir-ledningen som strekker seg fra hull 1 til den uisolerte delen av ledningen er i flukt med hull 1. Gjenta med den andre ledningen for å justere den uisolerte enden av ledningen gjenget gjennom blyhull 3 og 4.
- Påfør en liten mengde UV-herdelim på trådløkkene på utsiden av mansjetten ved blyhull 1 og 3. Bruk UV-staven til å kurere limet og feste ledningene på plass.
- Bruk en liten pipettespiss til å skyve de uisolerte Pt:Ir-ledningene mot den indre veggen på mansjetten. Når ledningene er på plass, kutt endene av ledningene som strekker seg fra blyhull 2 og 4, slik at ca. 1 mm ledning strekker seg utover utsiden av mansjetten.
- Brett 1 mm haler av ledningen flatt mot den ytre overflaten av mansjetten, ta vare på ikke å korte dem sammen. Påfør en liten mengde UV-herdelim for å bare dekke de to halene og kurere limet for å sikre blyplassering og gi elektrisk isolasjon.
FORSIKTIG: Det er viktig å dekke de eksternt eksponerte Pt:Ir-overflatene med lim for å isolere ledningene og unngå stimulering utenfor mål.
- Bruk den lille synålen til å lage 4 hull i mansjettveggen. Hvert par hull skal plasseres ca. 0,5–0,8 mm fra vinkelrett midtlinje, med et hull ca. 0,5–0,8 mm fra den øverste spalten på hver side av mansjetten.
- Fest Pt:Ir-ledningene på plass med sutur securement.
- Fjern den store nålen med mansjettenheten fra skumkortet. Sett inn en 3 cm lengde på 6/0 sutur gjennom nåløyets øye og trekk nålen gjennom slangen for å tre suturen gjennom bunnen av mansjetten midtpunktet.
- Bytt til den lille synålen for å fullføre suturtråding for Pt:Ir bly sikkering. Sett nålen gjennom det samme midtlinjehullet, og arbeid igjen fra interiør til eksteriør for å unngå deformasjon av slangen og trådledningene. Sett den ytre halen av suturen gjennom nåløyets øye og trekk nålen gjennom mansjeveggen for å skape en løkke av sutur rundt kanten av mansjetten (figur 1C).
MERK: Bruk tang og arbeid under mikroskopet for å sikre at suturen er orientert langs mansjettens lange akse og ligger flatt mot slangen. Dette trinnet sikrer at ledningene forblir skilt på den indre siden av mansjetten og holdes på plass lateral til mansjetten midtlinjen. - Lag en annen løkke rundt motsatt ende av mansjetten ved å binde endene av suturen i en halv knute, på utsiden av mansjetten. Sørg for at suturen går langs mansjettens lange akse og ligger flatt mot slangen. Mens du holder knuten stramt slik at den ligger flatt mot slangen, påfør en liten mengde UV-herdelim på halvknute og kur for å holde på plass.
- Klipp forsiktig endene av suturtråden så nær knuten som mulig. Bruk eventuelt en liten mengde ekstra UV-herdelim for å lime de korte endene av suturen slik at de ligger flatt mot slangen (figur 1D).
- Loddekontaktpinner til Pt:Ir-ledningene.
- Bruk en butan lighter, fjern isolasjonen fra ~ 3 mm på slutten av hver av Pt: Ir wire ledninger. Loddete koppsiden av en gullpinne (se Materials bord)til den uisolerte enden av hvert kundeemne.
- Test impedansen til den monterte enheten.
- Koble gullpinnene til inngangene til en LCR-måler eller elektrodeimpedanskontrollmodul og sett testfrekvensen til 1 kHz. Senk mansjeslangen (og Pt:Ir stimulering kontakter interiøret til mansjetten) i et lite beger fylt med saltvann, pass på å holde gullblypinnene og sondekontaktene tørre. Kontroller at den monterte mansjetten har en impedans på 1 kHz på mindre enn 2 kΩ før du fortsetter med implantasjon.
MERK: Høy impedans indikerer ofte utilstrekkelig Pt: Ir overflateareal utsatt, noe som kan oppstå på grunn av faktorer som utilstrekkelig fjerning av isolasjon, utilsiktet påføring av lim i mansjetten innvendig, ødelagte trådtråder, etc. Mansjetter bør også inspiseres for ødelagte eller dårlig plasserte trådtråder som kan føre til korte kontakter med langvarig bruk.
- Koble gullpinnene til inngangene til en LCR-måler eller elektrodeimpedanskontrollmodul og sett testfrekvensen til 1 kHz. Senk mansjeslangen (og Pt:Ir stimulering kontakter interiøret til mansjetten) i et lite beger fylt med saltvann, pass på å holde gullblypinnene og sondekontaktene tørre. Kontroller at den monterte mansjetten har en impedans på 1 kHz på mindre enn 2 kΩ før du fortsetter med implantasjon.
2. Head-cap konstruksjon
MERK: Monteringsprosedyrer for hodeskål ligner på de som er publisert tidligere (Childs et al.17),og oppsummeres her for enkelhets skyld.
-
Montere hodeskålen17
- Klipp to små biter av 30 AWG wire wrap, en ~ 13 mm i lengde og en ~ 10 mm i lengde. Strip den ~ 1,5 mm isolasjon av hver ende av begge ledningene. Lodd pin-siden av en gullpinne til den ene enden av hver ledning, så nær koppen som mulig. Bruk wire cutters å kutte av overflødig lengde på pin utover loddeleden.
- Loddete de andre endene av AWG-ledningene til de to sentrale loddekoppene på en 4-pinners mikrostripekontakt.
- Bøy wirehodeskålen opp mot kontakten og plasser gullpinnene flatt mot kontakten, parallelt med hverandre, som vist i figur 2A. Pinnen som er koblet til den kortere ledningen, skal plasseres under pinnen som er koblet til den lengre ledningen. Bruk spiker akryl, tannsement, eller UV kur lim for å sikre headcap fører på plass.
3. Enhetsbruk
- Implanter mansjettelektrodene for kronisk vagusnervestimulering.
MERK: Alle kirurgiske prosedyrer bør utføres ved hjelp av steril eller aseptisk teknikk under egnet anestesi, i samsvar med NIH retningslinjer for pleie og bruk av laboratoriedyr og med lokal IACUC-godkjenning. Følgende prosedyrer er ment å illustrere en representativ bruk av enheten og er ikke ment å være omfattende.- Plasser rotten i en stereotoksisk ramme og lag et sagittalt snitt over parietal og occipital bein for å avsløre skallen overflaten for implantasjon av hodeskålen / kontakten. Bor forsiktig 4 hull i skallen og plasser gullsmedens skruer. Bruk tannakryl for å feste hodeskålen til skallen og skruene.
- Fjern rotten fra stereotoksisk ramme og legg på høyre side. Lag et vertikalt snitt i huden på venstre side av nakken, og nøye dissekere venstre vagusnerve fra halspulsåren, som ligger mellom sternomastoid og sternohyoid muskler og under omohyoidmuskelen.
- Tunnel mansjetten fører subkutant mot skallen. Koble ledningene til hodeskålen ved hjelp av gullpinnene.
- Plasser vagusnerven inne i mansjetten og fest enheten lukket ved å binde en dobbel knute i mansjettens suturer. Vær forsiktig så du unngår å skade nerven under implantasjon ved å manipulere nerven med sløve, ikke-sammenhengende kroker eller ved å gripe bindevevet rundt nerven.
- Test implantatet ved å bruke stimulering på enheten (10 s tog på 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs bifasiske pulser). Riktig implantasjon vil resultere i opphør av pusten og en nedgang i SpO2 på 5% eller mer.
- Dekk gullpinnene og eksponerte ledninger med tannakryl, nære sår med suturer, og rengjør snittstedene med saltvann, alkohol og povidon jodløsning.
- Gi erstatningsvæsker, analgeics og postoperativ behandling i tråd med NIH retningslinjer og IACUC godkjenning.
- Stimulere vagusnerven under våken oppførsel.
MERK: Levering av VNS etter hvert som dyr utfører spesifikke motoriske oppgaver har tidligere vist seg å utvide motorkartrepresentasjonen av oppgaverelevante muskulaturer. Vi bruker dette validerte paradigmet til å gi et representativt eksempel på enhetsbruk, men mange andre atferdsparadigmer og/eller stimuleringsparametere kan være relevante for alternative applikasjoner. Rotter ble opplært til ferdigheter på spaken trykk oppgave som brukes her før enheten implantasjon. Etter operasjonen ble god ytelse igjen verifisert før VNS levering: rotter utførte minst 100 vellykkede studier i to 30 min treningsøkter per dag. VNS ble paret med riktige spakpresser under 10 påfølgende treningsøkter over 5 dager.- Koble rotten til en stimulansgenerator via implantert hodelokk og juster til passende stimuleringsinnstillinger. For VNS-indusert omorganisering av det kortikale kartet må du pare hvert korrekt spakpresse med ett enkelt tog med 15 tofasiske pulser, hver med en bredde på 100 μs og amplitude på 800 μA, levert med en frekvens på 30 Hz.
- Et stimuleringstog leveres umiddelbart etter påvisning av hvert vellykkede spaktrykk gjennom ti 30 min treningsøkter. Under VNS-levering, bruk et oscilloskop for å overvåke vellykket levering av nåværende stimulering.
- Valider kronisk implantert mansjettfunksjon.
- Innen 24 timer etter den siste VNS-parede treningsøkten, bruk intrakraniell mikrostimulering (ICMS) for å kvantifisere det funksjonelle somatotopiske kartet i motorcortex19,,20,,21,,22.
- Etter induksjon av anestesi for ICMS-kartlegging av motorcortex, valider mansjettfunksjonen igjen ved å bruke et 10-s tog på 30 Hz, 0,8 mA strømstimulering (100 μs tofasiske pulser), noe som bør resultere i en opphør av pusting og reduksjon i SpO2 nivåer på minst 5%, i samsvar med Hering-Breuer refleks.
MERK: Avhengig av bruksområdet kan mansjettfunksjonen anses som akseptabel hvis en pålitelig SpO2-dråpe på mindre enn 5 % observeres, eller hvis høyere strøm amplituder (opptil 1,6 mA) pålitelig produserer minst 5 % reduksjon i SpO2. Hvis du ikke observerer en pusteslutt og/eller en pålitelig reduksjon i SpO2, indikerer implantatsvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vagus nerve cuff elektroder og hodeskåler ble kronisk implantert i rotter i henhold til tidligere publiserte kirurgiske prosedyrer17,19,20,21,22. Før implantasjon ble impedans ved 1 kHz målt over mansjettens ledninger med mansjettslangen nedsenket i saltvann (impedans = 1,2 ± 0,17 kΩ [gjennomsnitt ± std]; N = 9). Bare mansjetter med impedanser mindre enn 2 kΩ i saltvann ble implantert; alle mansjetter møtte dette kriteriet (0/9 mansjetter ekskludert). Under implantasjonsoperasjoner ble funksjonell validering av alle mansjetter utført ved å teste for en stimuleringsindusert kort opphør av pusten og påfølgende fall i blod oksygenmetning tilskrives Hering-Breuer refleks. For å fremkalle dette svaret ble et 10 s tog på 30 Hz, 0,8 mA strømstimulering (100 μs bifasiske pulser) levert over mansjettens ledninger. For 9/9 implanterte mansjetter, vi observerte en VNS-indusert opphør av pusten i løpet av 10 sek stimulering, som ble ledsaget av en nedgang i SpO2 på minst 5% (% endring i SpO2 = -10,3 ± 3,2%, gjennomsnitt ± std; rekkevidde = -5,7 til -14,5%), som bekrefter mansjettfunksjon og riktig implantasjon. Under første implantasjon fant vi en signifikant sammenheng mellom innledende SpO2-målinger og prosentvis endring i SpO2 fremkalt av VNS (figur 2B; R2 = 0,60, p = 0,0083, Pearsons lineære korrelasjon), i samsvar med publisert litteratur som viser at anestesidybden påvirker omfanget av Hering-Breuerrefleks 23,24. For å teste den langsiktige funksjonaliteten til kronisk implanterte mansjetter, ble rotter bedøvet igjen 6 uker etter at enheten implantasjon og VNS ble brukt til å fremkalle Hering-Breuer refleks respons. For 7 av 9 enheter observerte vi en større enn 5% nedgang i SpO2 ved hjelp av 10 s tog på 0,8 mA, 30 Hz stimulering (figur 2C). I disse enhetene, størrelsen på stimuleringsfremkallet endring i SpO2 var ikke forskjellig fra det som ble observert ved første implantasjon, noe som tyder på utmerket fortsatt ytelse av kronisk implanterte enheter (første % endring i SpO2 = -9,7 ± 3,4%, endelig % endring i SpO2 = -15,8 ± 6,5%, gjennomsnitt ± std; p = 0,08, paret t-test). I de resterende 2 enhetene var det tilstrekkelig å øke stimuleringsamplituden til 1,6 mA for å fremkalle en pålitelig reduksjon i SpO2 på minst 5 %, noe som tyder på at disse enhetene fortsatte å fungere, men at endringer i impedans, nerveskader eller mansjettorientering over tid kan ha resultert i redusert ytelse.
For ytterligere å teste den langsiktige funksjonaliteten til våre kronisk implanterte stimulerende elektroder, ble en annen gruppe rotter trent på en forenklet versjon av en dyktig nå spakepresseoppgave utviklet av Hays et al. for å kvantitativt vurdere forbenmotorytelse25. Flere studier har vist at sammenkobling av VNS med riktig motorytelse på denne oppgaven resulterer i utvidelse av proksimal forbenrepresentasjon i primær motorcortex19,,20,,21,,22. I vår forenklede versjon av oppgaven ble rotter pålagt å nå 2 cm utenfor treningsbåsen for å trykke helt inn en spak, og deretter å frigjøre den innen 2 s for å motta en matbelønning (figur 2D). Dyr fikk to 30 min treningsøkter per dag til de oppnådde stabile ferdigheter på oppgaven (> 65% riktig, > 100 studier / økt, i minst 8 / 10 påfølgende økter). Rotter gjennomgikk deretter kirurgi for å implantere en stimulerende mansjettelektrode rundt venstre vagusnerve. Etter utvinning fra kirurgi, akklimatisering til stimulerende kabler, og gå tilbake til dyktig atferdsytelse, rotter fikk ytterligere 10 treningsøkter der VNS (0,5 s tog på 0,8 mA, 30 Hz pulser; 100 μs biphasic puls bredde), eller sham stimulering (ingen stimulering), ble levert på tidspunktet for riktig spak utgivelse. Innen 24 timer etter den siste VNS-parede treningsøkten ble rotter bedøvet med ketamin/xylazin (80/10 mg/kg, i.p.), cuff elektrodefunksjon ble testet, og kortikal motorkartlegging ble utført i henhold til publiserte prosedyrer22. I samsvar med tidligere studier som viser at VNS driver utvidelse av oppgaverelevante motorkartrepresentasjoner, viste VNS-behandlede rotter (N = 3) betydelig større proksimale forben (PFL) representasjoner enn sham behandlet rotter (N = 4) i vår studie (Figur 2D; PFL % av totalt kartområde, gjennomsnitt + SEM: sham = 15,6 ± 6,7%, VNS = 38,3 ± 1,0%; p = 0,035, 2-prøve t-test, testeffekt = 0,8). I alle VNS-behandlede dyr ble mansjettfunksjonen validert etter induksjon av anestesi på kartleggingstiden, 5–10 uker etter implantatet, ved å bekrefte en større enn 5 % endring i SpO2 som svar på VNS (10 s tog på 0,8 mA, 30 Hz pulser; 100 μs bifasisk pulsbredde).
Figur 1: Montering av stimulerende mansjettelektroder. (A)Etter å ha festet suturene på hver side av mansjetten, kan Pt:Ir-ledningen gjenges gjennom mansjetten veggen på hull #1 (hvit pilspiss) ved hjelp av en synål. (B)Pt:Ir wire er riktig gjenget og klar for de-isolasjon etter å ha opprettet en trådsløyfe rundt mansjetten kanten og threading ledningen igjen gjennom hull #1 (hvit pilspiss) og over mansjetten gjennom hullet #2 (gul pilhode). (C) Når begge ledningene er på plass, fest den første ledningen ved å tre sutur gjennom midtlinjen hullet og rundt mansjetten kanten (gul pilspiss). (D) Lukk løkken rundt den andre ledningen med en halv knute og lim på plass for å fullføre mansjettenheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Enhetsbruk for kronisk vagusnervestimulering i våkne oppfører rotter. (A) Hodeskål montering. (B)Under implantasjon av enheten var VNS-fremkalte reduksjoner i SpO2 korrelert med innledende SpO2-målinger (R2 = 0,602, p = 0,008, Pearsons lineære korrelasjon). (C) Sammenligning av VNS-fremkalt SpO2 dråper oppnådd ved apparatimplantasjon versus ved avslutning av stimuleringseksperimenter 6 uker senere. Linjer indikerer par målinger for individuelle rotter. Stimulering i panel B og C besto av et enkelt 10 s tog på 100 μs bifasiske pulser levert ved 0,8 mA og 30 Hz. (D) Rotte med kronisk implanterte VNS-mansjettelektroder som utfører spaken-pressoppgaven. (E) VNS (0,5 s tog på 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs bifasiske pulser) kombinert med riktig spak-trykk ytelse utvidet kartet representasjon av oppgave relevant muskulatur i motorcortex. Rotter som fikk VNS sammen med riktig spakpresseytelse (N = 3) viste en betydelig større prosentandel av motorkartområdet viet til proksimal forben (PFL) representasjon sammenlignet med rotter som fikk Sham stimulering (N = 4). Prikker viser PFL-representasjoner for individuelle fag; feilfelt indikerer sem. VNS behandling etterfulgt av motorkortikale kartlegging ble utført 5–10 uker etter implantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en enkel, rimelig tilnærming for montering av kronisk implanterbare stimulerende mansjettelektroder for bruk hos gnagere, noe som letter prekliniske undersøkelser av denne nye terapien. Denne forenklede metoden krever ingen spesialisert opplæring eller utstyr, og bruker et lite antall verktøy og forsyninger som er lett tilgjengelige for de fleste forskningslaboratorier, noe som reduserer både monetære og lønnskostnader for enhetsproduksjon sammenlignet med andre tilnærminger16,,26,,27,,28. Det er nødvendig med forsiktighet gjennom hele monteringen for å unngå overdreven bruk av UV-herskelim samtidig som det sikrer tilstrekkelig mekanisk stabilitet i suturene og Pt:Ir-ledningene for langsiktig mansjettfunksjon. Overdreven lim kompliserer enheten implantasjon og kan irritere omkringliggende vev etter operasjonen, mens utilstrekkelig lim øker sannsynligheten for at over tid ledningene ikke kan opprettholde god kontakt med nerven, noe som resulterer i redusert enhetsytelse eller svikt. Konsistent plassering av deisolerte Pt:Ir-ledningene inne i mansjetten lumen er også avgjørende for å oppnå lave impedanser og god enhetsytelse. Det bør tas hensyn til riktig justering av den deisolerte ledningen slik at den maksimale mulige overflaten av eksponert ledning sitter inne i mansjetten, mens det ikke finnes noen eksponert ledning eksternt.
Vi har bekreftet at vår tilnærming produserer mansjetter av lignende størrelse og pålitelighet som de som for tiden er i vanlig bruk av flere laboratorier for kronisk VNS levering hos rotter4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,19,,20,,21,,22. Nyere studier indikerer at perifere nervefibre på samme måte rekrutteres ved hjelp av et bredt utvalg av elektrodekontaktstørrelserog orienteringer 16,29, noe som tyder på at denne protokollen kan tilpasses for mange eksperimenter som krever perifer nervestimulering, og at små variasjoner i blyavstand eller overflateareal som oppstår fra montering av mansjetter for hånd, ikke vil kritisk påvirke de fleste eksperimentelle resultater. Under hver stimuleringsøkt overvåket vi spenningen over mansjettens ledninger ved hjelp av et oscilloskop for å sikre at ledningene ikke ble kortert eller ødelagt, men vi sporet ikke endringer i impedans for spesifikke implanterte enheter i løpet av 5-10 uker etter implantatet. En studie av en lignende implantert enhet rapporterte at impedans øker betydelig i løpet av de første 4 ukene etter kirurgisk implantasjon, antagelig da den akutte skaden stabiliserer30. I denne studien var imidlertid endringer i enhetsimpedans ikke korrelert med enhetens ytelse over 8 uker med kronisk implantasjon: forfatterne rapporterte ingen signifikant endring i forholdet mellom VNS intensitet og sammensatt virkning potensiell amplitude over flere uker etter implantatet. Her var vi på samme måte i stand til å validere mansjettytelsen etter 5–10 uker med implantasjon ved å (i) bekrefte at VNS fortsatt kunne fremkalle en opphør av pusting og fall i SpO2 i samsvar med Hering-Breuer-refleksen, og (ii) replikere tidligere arbeid som viser VNS-indusert motorkart omorganisering. I vårt eget arbeid har vi funnet induksjon av Hering-Breuer refleks å være den mest pålitelige måten å validere langsiktig funksjonalitet av implanterte VNS mansjetter, som kan vise redusert enhetsytelse eller svikt på grunn av en rekke faktorer som ikke er relatert til mansjett montering; disse inkluderer kirurgiske komplikasjoner, nerveskader og/eller mekanisk skade på mansjetten eller hodeskålen. Utmerket kirurgisk teknikk og applikasjonsspesifikk validering av enhetsfunksjonalitet er avgjørende for stabil og vellykket bruk av kronisk implanterte stimulerende mansjettelektroder.
Vi har beskrevet en enkel, billig tilnærming for montering av perifere nerve cuff elektroder for kronisk implantasjon hos små dyr og demonstrert sin nytte for VNS levering under rotte atferdseksperimenter. VNS er i økende grad under undersøkelse for et bredt spekter av kliniske indikasjoner, inkludert inflammatoriske sykdommer som revmatoid artritt1,,2 og Crohns sykdom,31 samt nevrologiske lidelser som hjerneslag5,,6,,7,,8 og PTSD10,,11. Denne tilgjengelige metoden for å lage stimulerende mansjettelektroder bør lette bruken av prekliniske gnagermodeller i en rekke translasjonelle forskningsstudier på mekanismene og effekten av VNS. Protokollen er lett tilpasningsdyktig, noe som ytterligere øker allsidigheten til tilnærmingen. Diameteren og/eller lengden på polyuretanslangen kan for eksempel endres for å imøtekomme kroniske stimuleringseksperimenter hos andre arter eller på andre perifere nervesteder (f.eks. isjias-, phrenic- eller sakralnerver). Alternativt kan konfigurasjoner med flere ledninger muliggjøre stimulering på flere steder langs nerven, eller kunne romme samtidig registrering av et stimuleringsfremkallet sammensatt handlingspotensial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av University of Texas i Dallas og UT Board of Regents. Vi takker Solomon Golding, Bilaal Hassan, Marghi Jani og Ching-Tzu Tseng for teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
References
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson's disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F.
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
