Summary
Abordagens existentes para a construção de eletrodos de manguito nervoso periférico cronicamente implantáveis para uso em pequenos roedores muitas vezes requerem equipamentos especializados e/ou pessoal altamente treinado. Neste protocolo, demonstramos uma abordagem simples e de baixo custo para a fabricação de eletrodos de manguitos cronicamente implantáveis, e demonstramos sua eficácia para a estimulação do nervo vago (VNS) em ratos.
Abstract
Eletrodos de manguito nervoso periférico têm sido usados há muito tempo nas neurociências e campos relacionados para estimulação de, por exemplo, vagus ou nervos ciáticos. Vários estudos recentes demonstraram a eficácia do VNS crônico no aumento da plasticidade do sistema nervoso central para melhorar a reabilitação motora, a aprendizagem da extinção e a discriminação sensorial. A construção de dispositivos cronicamente implantáveis para uso em tais estudos é desafiadora devido ao pequeno tamanho dos ratos, e protocolos típicos exigem treinamento extensivo de pessoal e métodos de microfabricação demorados. Alternativamente, eletrodos de punho implantáveis disponíveis comercialmente podem ser comprados a um custo significativamente maior. Neste protocolo, apresentamos um método simples e de baixo custo para a construção de eletrodos de punho nervoso periférico pequenos e cronicamente implantáveis para uso em ratos. Validamos a confiabilidade a curto e longo prazo de nossos eletrodos de punho, demonstrando que vns em ratos anestesizados cetamina/xilazina produz reduções na taxa de respiração consistente com a ativação do reflexo Hering-Breuer, tanto no momento da implantação quanto até 10 semanas após a implantação do dispositivo. Demonstramos ainda a adequação dos eletrodos de punho para uso em estudos de estimulação crônica, emparelhando VNS com desempenho de prensa de alavanca qualificada para induzir plasticidade do mapa cortical motor.
Introduction
Recentemente, cresceu a demanda por eletrodos de manguitos cronicamente implantáveis para estimulação de nervos periféricos, pois estudos demonstram cada vez mais a utilidade pré-clínica dessa técnica para o tratamento de inúmeras doenças inflamatórias1,,2,3 e distúrbios neurológicos4,,5,,6,,7,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15. O VNS crônico, por exemplo, tem se mostrado para melhorar a plasticidade neocortical em uma variedade de contextos de aprendizagem, melhorando a reabilitação motora4,5,,6,,7,8, aprendizagem de extinção10,,11,,12,,13,,14, e discriminação sensorial15. Eletrodos de manguito nervoso periférico comercialmente disponíveis são frequentemente associados a tempos prolongados para cumprimento do pedido e custos relativamente altos, o que pode limitar sua acessibilidade. Alternativamente, os protocolos para fabricação "interna" de eletrodos de manguitos cronicamente implantáveis permanecem limitados, e a anatomia dos roedores apresenta desafios particulares devido ao seu pequeno tamanho. Os protocolos atuais para a construção de eletrodos de punho para experimentos crônicos de roedores muitas vezes requerem o uso de equipamentos e técnicas complexas, bem como pessoal extensivamente treinado. Neste protocolo, demonstramos uma abordagem simplificada para a fabricação de eletrodos de manguito com base nos métodos publicados e amplamente utilizados16,17. Validamos a funcionalidade de nossos eletrodos cronicamente implantados em ratos, demonstrando que, no momento da implantação da braçadeira ao redor do nervo vago cervical esquerdo, a estimulação aplicada aos eletrodos do punho produziu com sucesso uma cessação da respiração e queda em SpO2. A estimulação de fibras vagal do receptor pulmonar aferentes é conhecida por engajar o reflexo hering-breuer, no qual a inibição de vários núcleos respiratórios no tronco cerebral resulta na inspiração de supressão18. Assim, a cessação da respiração consistente com o reflexo hering-breuer, e a queda resultante em SpO2, fornecem um teste simples para implantação adequada de eletrodos e função de manguito em ratos anestesiados. Para validar a funcionalidade de longo prazo dos eletrodos de manguitos cronicamente implantados, as respostas reflexas foram medidas no momento da implantação e comparadas às respostas obtidas nos mesmos animais seis semanas após a implantação. Um segundo grupo de ratos foi implantado com eletrodos de manguito VNS após treinamento comportamental em uma tarefa de prensagem de alavanca. Nestes ratos, o VNS emparelhado com o desempenho correto da tarefa produziu reorganização do mapa motor cortical, consistente com estudos publicados anteriormente19,,20,,21,22. No momento do mapeamento cortical motor sob anestesia, que ocorreu de 5 a 10 semanas após a implantação do dispositivo, validamos ainda mais a função de manguito em animais tratados com VNS, confirmando que o VNS induziu com sucesso uma cessação da respiração e uma queda superior a 5% no SpO2.
Os protocolos recém-publicados de Childs et al.17 e Rios et al.16 fornecem um ponto de partida bem validado para uma abordagem simplificada de fabricação de eletrodos de manguito, uma vez que este método popular tem sido utilizado por vários laboratórios que realizam estudos crônicos de VNS em roedores1,,2,3,,4,,5,6,,7,,8,,9,,10,,11. O método original envolve várias etapas de alta precisão para manipular os microfios finos, de modo que a fabricação de eletrodos de punho leva mais de uma hora para ser concluída, e treinamento extensivo para executar de forma confiável. A abordagem simplificada descrita aqui requer significativamente menos materiais e ferramentas e pode ser concluída em menos de uma hora por pessoal minimamente treinado.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizados de acordo com o Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em Dallas.
1. Estimulando a fabricação de eletrodos de manguito
- Prepare a tubulação de algemas.
- Usando uma lâmina de barbear, corte um pedaço de tubo de polímero de 2,5 mm de comprimento. Insira pontas de fórceps ou um clipe de papel através da tubulação e use a lâmina para fazer uma fenda longitudinalmente através da parede do tubo de um lado da braçadeira.
- Remova as fórceps da tubulação e insira uma agulha de costura grande através da linha média do manguito, perpendicular ao eixo longo. Insira a agulha através da fenda (superior) e no centro da tubulação em frente (inferior). Coloque a agulha na placa de espuma para fixar a braçadeira no lugar durante as etapas restantes de montagem.
- Coloque a sutura para fixar o fecho da braçadeira durante a implantação.
- Insira a pequena agulha de costura através da parede da braçadeira, na linha média, aproximadamente 0,5 mm da fenda superior de um lado. Insira a agulha de interior para exterior para evitar danificar a tubulação de punho. Insira uma sutura de 2 cm de 6/0 através do olho da agulha e puxe a agulha através da parede da tubulação para enfiar a sutura na braçadeira.
- Deixando a linha no lugar, retire a agulha e perfure um segundo orifício através da parede de tubulação aproximadamente 0,5 mm abaixo do primeiro orifício, ao longo da linha média da braçadeira. Insira a sutura através do olho da agulha e puxe a agulha através da parede de tubos para novamente enfiar a sutura através da braçadeira.
- Ambas as extremidades do fio de sutura devem agora estar no lado externo da braçadeira. Ajuste a sutura para que ~1,5 cm se estenda do orifício superior, e ~0,5 mm se estenda do orifício inferior.
- Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV na extremidade curta da sutura que se estende do orifício inferior e puxe a extremidade mais longa da sutura até que a cauda inferior esteja quase alinhada com a parede externa do tubo. Use a varinha UV para curar o adesivo e mantenha a sutura firmemente no lugar.
- Repita as etapas 1.2.1 a 1.2.3 no lado oposto da braçadeira.
- Coloque os fios platinum:Iridium (Pt:Ir).
- Use a pequena agulha de costura para fazer 4 furos na parede do punho. Cada par de orifícios deve ser colocado aproximadamente 0,5-0,8 mm da linha média perpendicular, com um orifício de aproximadamente 0,5-0,8 mm da fenda superior em ambos os lados da braçadeira.
ATENÇÃO: Para a colocação mais consistente e precisa dos cabos, insira a agulha de interior para exterior para fazer todos os orifícios, usando a colocação da sutura como guia. - Insira novamente a agulha de costura, desta vez trabalhando de exterior para interior, através do orifício de chumbo 1. Insira aproximadamente 0,5 cm de um fio de 7,5 cm de fio pt:Ir através do olho da agulha e puxe a agulha através da tubulação para enfiar o fio de chumbo através da parede da braçadeira. Ajuste o fio para que ~4,5 cm se estenda no lado externo da braçadeira(Figura 1A).
- Insira a agulha através do orifício de chumbo 1 novamente, novamente trabalhando exterior-para-interior, e além disso insira a agulha através do orifício de chumbo 2 diretamente em frente ao orifício de chumbo 1. Insira ~0,5 cm da extremidade (interior) mais curta do fio Pt:Ir através do olho da agulha e puxe a agulha através da tubulação para enfiar o fio de chumbo através das paredes do punho.
NOTA: Ambas as extremidades do fio Pt:Ir devem agora estar no lado externo da braçadeira, e uma alça de arame é formada ao redor da borda da fenda e através do orifício de chumbo 1 (Figura 1B). - Repita as etapas 1.3.1 até 1.3.3 para colocar o fio Pt:Ir através dos orifícios de chumbo 3 e 4.
- Usando um isqueiro butano, remova cuidadosamente o isolamento de um comprimento de 5-6 mm no final dos fios Pt:Ir que se estendem do orifício de chumbo 2 e do orifício de chumbo 4.
ATENÇÃO: Isole as extremidades das pontas do resto do conjunto da braçadeira cuidadosamente para evitar danos à braçadeira. Use ferramentas para segurar os fios para evitar ferimentos. - Alinhe o fio nu dentro da braçadeira para colocar os cabos em seus locais finais. Para isso, puxe suavemente a extremidade do fio Pt:Ir estendendo-se do orifício 1 até que a porção não utilizada do fio esteja alinhada com o orifício 1. Repita com a outra ponta para alinhar a extremidade não ensulada do fio roscada através dos orifícios de chumbo 3 e 4.
- Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV nos laços de arame no lado externo da braçadeira nos orifícios de chumbo 1 e 3. Use a varinha UV para curar o adesivo e fixar os cabos no lugar.
- Use uma pequena ponta de pipeta para empurrar os fios não-ensuladas pt:ir contra a parede interna da braçadeira. Uma vez que os cabos estejam no lugar, corte as extremidades dos fios que se estendem dos orifícios de chumbo 2 e 4 para que aproximadamente 1 mm de fio se estenda além do exterior da parede da braçadeira.
- Dobre as caudas de 1 mm do fio planas contra a superfície externa da braçadeira, tomando cuidado para não baixá-las juntas. Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV para cobrir apenas as duas caudas e curar o adesivo para garantir a colocação do chumbo e fornecer isolamento elétrico.
ATENÇÃO: É importante cobrir totalmente as superfícies de Pt:Ir externamente expostas com adesivo para isolar os fios e evitar a estimulação fora do alvo.
- Use a pequena agulha de costura para fazer 4 furos na parede do punho. Cada par de orifícios deve ser colocado aproximadamente 0,5-0,8 mm da linha média perpendicular, com um orifício de aproximadamente 0,5-0,8 mm da fenda superior em ambos os lados da braçadeira.
- Fixar os cabos de fio Pt:Ir no lugar com segurança de sutura.
- Retire a agulha grande com o conjunto de punhos da placa de espuma. Insira uma sutura de 3 cm de 6/0 através do olho da agulha e puxe a agulha através da tubulação para enfiar a sutura através da parte inferior da braçadeira no ponto médio.
- Mude para a pequena agulha de costura para completar a rosca de sutura para a fixação de chumbo Pt:Ir. Insira a agulha através do mesmo orifício intermediário, trabalhando novamente de interior para exterior para evitar a deformação da tubulação e dos fios. Insira a cauda externa da sutura através do olho da agulha e puxe a agulha através da parede da braçadeira para criar um laço de sutura ao redor da borda da braçadeira(Figura 1C).
NOTA: Use fórceps e trabalhe sob o microscópio para garantir que a sutura seja orientada ao longo do longo eixo da braçadeira e deita-se plana contra a tubulação. Esta etapa garante que os cabos permaneçam separados no lado interno da braçadeira e sejam mantidos no lugar lateral para a linha do manguito. - Crie um segundo laço em torno da extremidade oposta da braçadeira amarrando as extremidades da sutura em meio nó, no lado externo da braçadeira. Certifique-se de que a sutura corre ao longo do longo eixo da braçadeira e fica plana contra a tubulação. Enquanto segura o nó apertado para que ele fique liso contra a tubulação, aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV ao meio nó e cure para manter no lugar.
- Corte cuidadosamente as extremidades da rosca de sutura o mais perto possível do nó. Se necessário, use uma pequena quantidade de adesivo adicional de cura UV para colar as extremidades curtas da sutura para que elas se coloquem planas contra a tubulação(Figura 1D).
- Pinos do conector da solda para os cabos do fio Pt:Ir.
- Usando um isqueiro butano, remova o isolamento de ~3 mm na extremidade de cada um dos fios Pt:Ir. Solde o lado da xícara de um pino de ouro (ver Tabela de Materiais) até a extremidade não anulada de cada chumbo.
- Teste a impedância do dispositivo montado.
- Conecte os pinos de ouro às entradas de um medidor LCR ou módulo de verificação de impedância de eletrodos e defina a frequência de teste para 1 kHz. Submergir a tubulação de punho (e a estimulação pt:Ir entra em contato com o interior da braçadeira) em um pequeno béquer cheio de soro fisiológico, tomando o cuidado de manter os pinos de chumbo de ouro e os conectores da sonda secos. Verifique se a braçadeira montada tem uma impedância de 1 kHz de menos de 2 kΩ antes de prosseguir com a implantação.
NOTA: A alta impedância muitas vezes indica área de superfície inadequada pt:ir exposta, que pode surgir devido a fatores como remoção insuficiente do isolamento, aplicação acidental de adesivo no interior do manguito, fios de arame quebrados, etc. As algemas também devem ser inspecionadas para fios de arame quebrados ou mal colocados que possam resultar em contatos curtos com o uso a longo prazo.
- Conecte os pinos de ouro às entradas de um medidor LCR ou módulo de verificação de impedância de eletrodos e defina a frequência de teste para 1 kHz. Submergir a tubulação de punho (e a estimulação pt:Ir entra em contato com o interior da braçadeira) em um pequeno béquer cheio de soro fisiológico, tomando o cuidado de manter os pinos de chumbo de ouro e os conectores da sonda secos. Verifique se a braçadeira montada tem uma impedância de 1 kHz de menos de 2 kΩ antes de prosseguir com a implantação.
2. Construção de tampa de cabeça
NOTA: Os procedimentos de montagem da headcap são semelhantes aos publicados anteriormente (Childs et al.17), e são resumidos aqui por conveniência.
-
Monte a tampa da cabeça17
- Corte dois pequenos pedaços de envoltório de fio AWG de 30, um ~13 mm de comprimento e um ~10 mm de comprimento. Retire os ~1,5 mm de isolamento de cada extremidade de ambos os fios. Solde o lado do pino de um pino de ouro para uma extremidade de cada fio, o mais perto possível do copo. Use cortadores de arame para cortar o excesso de comprimento do pino além da junta da solda.
- Solde as outras extremidades dos fios AWG para os dois copos de solda central de um conector de microstrip de 4 pinos.
- Dobre as tampas da cabeça do fio até o conector e coloque os pinos de ouro planos contra o conector, paralelos uns aos outros, como mostrado na Figura 2A. O pino conectado ao fio mais curto deve ser colocado abaixo do pino conectado ao fio mais longo. Use acrílico de unha, cimento dental ou adesivo de cura UV para fixar os fios da tampa da cabeça no lugar.
3. Uso de dispositivos
- Implante os eletrodos de punho para estimulação crônica do nervo vago.
NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados utilizando técnica estéril ou asséptica sob anestesia adequada, de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e com aprovação local da IACUC. Os seguintes procedimentos destinam-se a ilustrar um uso representativo do dispositivo e não se destinam a ser abrangentes.- Coloque o rato em uma estrutura estereotaxa e faça uma incisão sagital sobre os ossos parietal e occipital para revelar a superfície do crânio para implantação da cabeceira/conector. Faça cuidadosamente 4 furos no crânio e coloque os parafusos do joalheiro. Use acrílico dentário para fixar a tampa da cabeça no crânio e parafusos.
- Remova o rato da estrutura estereotaxica e coloque no lado direito. Faça uma incisão vertical na pele no lado esquerdo do pescoço, e disseca cuidadosamente o nervo vago esquerdo da artéria carótida, localizada entre os músculos esternostoide e esternoide e sob o músculo omohiide.
- Túnel a braçadeira leva subcutânea em direção ao crânio. Conecte os cabos à tampa da cabeça usando os pinos de ouro.
- Coloque o nervo vago dentro da braçadeira e fixe o dispositivo fechado amarrando um nó duplo nas suturas de punho. Tenha cuidado para evitar danificar o nervo durante a implantação, manipulando o nervo com ganchos sem corte, não condutores ou agarrando tecido conjuntivo ao redor do nervo.
- Teste o implante aplicando estimulação ao dispositivo (trem de 10 s de 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs pulsos bifásicos). A implantação adequada resultará em cessação da respiração e queda na SpO2 de 5% ou mais.
- Cubra os pinos dourados e os fios expostos com acrílico dental, feche feridas com suturas e limpe os locais de incisão com solução salina, álcool e iodo povidone.
- Fornecer fluidos de substituição, analgésicos e cuidados pós-operatórios de acordo com as diretrizes do NIH e a aprovação da IACUC.
- Estimule o nervo vago durante o comportamento acordado.
NOTA: A entrega de VNS à medida que os animais realizam tarefas motoras específicas foi previamente demonstrada para expandir a representação do mapa motor da musculatura relevante para tarefas. Usamos esse paradigma validado para fornecer um exemplo representativo de uso de dispositivos, mas muitos outros paradigmas comportamentais e/ou parâmetros de estimulação podem ser relevantes para aplicações alternativas. Os ratos foram treinados para proficiência na tarefa de prensa da alavanca usada aqui antes da implantação do dispositivo. Após a cirurgia, o bom desempenho foi novamente verificado antes da entrega do VNS: os ratos realizaram pelo menos 100 ensaios bem sucedidos em duas sessões de treinamento de 30 minutos por dia. O VNS foi emparelhado com prensas de alavanca corretas durante 10 sessões de treinamento subsequentes ao longo de 5 dias.- Conecte o rato a um gerador de estímulo através da tampa da cabeça implantada e ajuste-se às configurações de estimulação apropriadas. Para reorganização induzida por VNS do mapa cortical do motor, pare cada prensa de alavanca correta com um único trem de 15 pulsos bifásicos, cada um com uma largura de 100 μs e amplitude de 800 μA, entregue em uma frequência de 30 Hz.
- Um trem de estimulação é entregue imediatamente após a detecção de cada pressão de alavanca bem sucedida ao longo de dez sessões de treinamento de 30 minutos. Durante a entrega de VNS, use um osciloscópio para monitorar a entrega bem-sucedida da estimulação atual.
- Validar a função do punho cronicamente implantada.
- Dentro de 24 horas da última sessão de treinamento emparelhada com VNS, use microestimulação intracraniana (ICMS) para quantificar o mapa somatotópico funcional no córtex motor19,,20,,21,,22.
- Após a indução da anestesia para mapeamento do ICMS do córtex motor, valide novamente a função de manguito aplicando um trem de 10 s de 30 Hz, estimulação de corrente de 0,8 mA (pulsos bifásicos de 100 μs), o que deve resultar em uma cessação da respiração e redução nos níveis de SpO2 de pelo menos 5%, consistente com o reflexo de Hering-Breuer.
NOTA: Dependendo da aplicação, a função do manguito pode ser considerada aceitável se uma queda confiável de SpO2 de menos de 5% for observada, ou se maiores amplitudes de corrente (até 1,6 mA) produzirem de forma confiável pelo menos uma redução de 5% no SpO2. A não observação de uma cessação da respiração e/ou uma diminuição confiável na SpO2 é indicativo de falha do implante.
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Representative Results
Eletrodos de punho e tampas de cabeça foram cronicamente implantados em ratos de acordo com procedimentos cirúrgicos publicados anteriormente17,19,20,21,22. Antes da implantação, a impedância de 1 kHz foi medida através dos condutores de punho com o tubo de punho submerso em soro fisiológico (impedância = 1,2 ± 0,17 kΩ [média ± dst]; N = 9). Apenas algemas com impedâncias inferiores a 2 kΩ em soro fisiológico foram implantadas; todas as algemas atenderam a esse critério (0/9 algemas excluídas). Durante as cirurgias de implantação, a validação funcional de todas as algemas foi realizada por meio de testes para uma breve cessação induzida por estimulação da respiração e subsequente queda na saturação de oxigênio no sangue atribuída ao reflexo de Hering-Breuer. Para evocar essa resposta, um trem de 10 s de 30 Hz, 0,8 mA estimulação de corrente (pulsos bifásicos de 100 μs) foi entregue através dos cabos de punho. Para as algemas implantadas de 9/9, observou-se uma cessação induzida por VNS de respiração durante a duração da estimulação de 10 segundos, que foi acompanhada por uma queda na SpO2 de pelo menos 5% (variação percentual na SpO2 = -10,3 ± 3,2%, média ± std; variação = -5,7 a -14,5%), confirmando função de punho e implantação adequada. Durante a implantação inicial, encontramos uma correlação significativa entre as leituras iniciais de SpO2 e a variação percentual no SpO2 evocado por VNS (Figura 2B; R2 = 0,60, p = 0,0083, correlação linear de Pearson), consistente com a literatura publicada demonstrando que a profundidade da anestesia impacta a magnitude do reflexo hering-breuer23,24. Para testar a funcionalidade de longo prazo das algemas cronicamente implantadas, os ratos foram anestesiados novamente 6 semanas após a implantação do dispositivo e o VNS foi aplicado para evocar a resposta reflexa hering-breuer. Para 7 dos 9 dispositivos, observou-se uma queda superior a 5% no SpO2 utilizando trens de 10 s de 0,8 mA, estimulação de 30 Hz(Figura 2C). Nesses dispositivos, a magnitude da mudança evocada por estimulação na SpO2 não difere da observada na implantação inicial, sugerindo excelente desempenho contínuo dos dispositivos cronicamente implantados (variação percentual inicial na SpO2 = -9,7 ± 3,4%, variação final em SpO2 = -15,8 ± 6,5%, média ± std; p = 0,08, t-test. Nos 2 dispositivos restantes, o aumento da amplitude de estimulação para 1,6 mA foi suficiente para evocar uma redução confiável na SpO2 de pelo menos 5%, sugerindo que esses dispositivos continuaram a funcionar, mas que mudanças na impedância, dano nervoso ou orientação do punho ao longo do tempo podem ter resultado em redução do desempenho.
Para testar ainda mais a funcionalidade de longo prazo de nossos eletrodos estimulantes cronicamente implantados, um segundo grupo de ratos foi treinado em uma versão simplificada de uma tarefa de pressão de alavanca de alcance qualificada desenvolvida pela Hays et al. para avaliar quantitativamente o desempenho do motor de forelimb25. Vários estudos demonstraram que a combinação de VNS com o desempenho correto do motor nesta tarefa resulta na expansão da representação proximal de membros dianteiros no córtex motor primário19,,20,21,22. Em nossa versão simplificada da tarefa, os ratos eram obrigados a chegar a 2 cm fora da cabine de treinamento para deprimir totalmente uma alavanca e, em seguida, liberá-la dentro de 2 s, a fim de receber uma recompensa alimentar(Figura 2D). Os animais receberam duas sessões de treinamento de 30 minutos por dia até conseguirem proficiência estável na tarefa (>65% correto, >100 ensaios/sessão, por pelo menos 8/10 sessões consecutivas). Os ratos então foram submetidos a uma cirurgia para implantar um eletrodo de punho estimulante em torno de seu nervo vago esquerdo. Após a recuperação da cirurgia, aclimatação aos cabos estimulantes e retorno ao desempenho comportamental proficiente, os ratos receberam mais 10 sessões de treinamento nas quais o VNS (trem de 0,5 s de 0,8 mA, pulsos de 30 Hz; 100 μs de largura de pulso bifásico) ou estimulação falsa (sem estimulação), foi entregue no momento da liberação correta da alavanca. Dentro de 24 horas após a última sessão de treinamento emparelhada com VNS, os ratos foram anestesiados com cetamina/xilazina (80/10 mg/kg, i.p.), a função de eletrodo de manguito foi testada, e o mapeamento do motor cortical foi realizado de acordo com os procedimentos publicados22. Consistente com estudos anteriores que demonstram que o VNS impulsiona a expansão de representações relevantes do mapa motor, os ratos tratados com VNS (N = 3) apresentaram representações proximais (PFL) significativamente maiores do que ratos tratados com farsa (N = 4) em nosso estudo (Figura 2D; PFL % da área total do mapa, média + SEM: farsa = 15,6 ± 6,7%, VNS = 38,3 ± 1,0%; p = 0,035, teste t de 2 amostras, potência de teste = 0,8). Em todos os animais tratados com VNS, a função de manguito foi validada após a indução da anestesia no momento do mapeamento, 5-10 semanas após o implante, confirmando uma variação superior a 5% no SpO2 ocorreu em resposta ao VNS (trem de 10 s de 0,8 mA, pulsos de 30 Hz; 100 μs de largura de pulso bifásico).
Figura 1: Montagem dos eletrodos estimulantes da braçadeira. (A) Depois de fixar as suturas em ambos os lados da braçadeira, o fio Pt:Ir pode ser enfiado através da parede do punho no orifício #1 (ponta de flecha branca) usando uma agulha de costura. (B) O fio de ir está devidamente roscado e pronto para o isolamento após criar um laço de arame ao redor da borda do punho e roscar o fio novamente através do orifício #1 (ponta de flecha branca) e através da braçadeira através do orifício #2 (ponta de flecha amarela). (C) Uma vez que ambos os leads estejam no lugar, fixe a primeira pista roscando através do orifício da linha média e ao redor da borda do punho (ponta de flecha amarela). (D) Feche o laço em torno da segunda pista com um meio nó e cola no lugar para completar o conjunto de punhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uso de dispositivo para estimulação crônica do nervo vago em ratos de comportamento acordados. (A) Montagem headcap. (B) Durante a implantação do dispositivo, as reduções evocadas por VNS em SpO2 foram correlacionadas com as leituras iniciais de SpO2 (R2 = 0,602, p = 0,008, correlação linear de Pearson). (C) Comparação das gotas de SpO2 evocadas por VNS obtidas na implantação do dispositivo versus no término dos experimentos de estimulação 6 semanas depois. As linhas indicam pares de medidas para ratos individuais. A estimulação nos painéis B e C consistiu em um único trem de 10 s de pulsos bifásicos de 100 μs entregues a 0,8 mA e 30 Hz. (D) Rato com eletrodos de punho VNS cronicamente implantados realizando a tarefa de pressão de alavanca. (E) VNS (trem de 0,5 s de 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs bifásicas) emparelhado com o desempenho correto da alavanca-prensa expandiu a representação do mapa da musculatura relevante para tarefas no córtex motor. Os ratos que receberam VNS emparelhados com o desempenho correto da prensa da alavanca (N = 3) apresentaram uma porcentagem significativamente maior da área do mapa motor dedicado à representação do membro dianteiro proximal (PFL) em comparação com ratos que receberam estimulação sham (N = 4). Os pontos mostram representações pfl para sujeitos individuais; as barras de erro indicam que o tratamento SEM. VNS seguido de mapeamento cortical motor foi realizado de 5 a 10 semanas após a implantação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos uma abordagem simples e de baixo custo para a montagem de eletrodos de punho estimulantes cronicamente implantáveis para uso em roedores, facilitando investigações pré-clínicas desta terapia emergente. Este método simplificado não requer treinamento ou equipamento especializado, e utiliza um pequeno número de ferramentas e suprimentos que são facilmente acessíveis à maioria dos laboratórios de pesquisa, reduzindo tanto os custos monetários quanto trabalhistas da fabricação de dispositivos em comparação com outras abordagens16,,26,,27,28. O cuidado é necessário durante toda a montagem para evitar a aplicação excessiva do adesivo de cura UV, ao mesmo tempo em que garante a estabilidade mecânica adequada das suturas e os condutores de Pt:Ir para a função de manguito de longo prazo. O adesivo excessivo complica a implantação do dispositivo e pode irritar o tecido circundante após a cirurgia, enquanto o adesivo insuficiente aumenta a probabilidade de que, com o tempo, os cabos possam não manter um bom contato com o nervo, resultando em diminuição do desempenho ou falha do dispositivo. A colocação consistente dos fios de Pt:Ir isolados dentro do lúmen de punho também é fundamental para alcançar baixas impedâncias e bom desempenho do dispositivo. Deve-se tomar cuidado para alinhar adequadamente o fio desocupado de forma que a superfície máxima possível de fio exposto esteja dentro da braçadeira, enquanto nenhum fio exposto existe externamente.
Validamos que nossa abordagem produz algemas de tamanho e confiabilidade semelhantes às atualmente em uso comum por diversos laboratórios para entrega crônica de VNS em ratos4,,5,6,,7,,8,,9,,10,,11,12,13,14,15,19,,20,,21,,22. Estudos recentes indicam que as fibras nervosas periféricas são recrutadas da mesma forma usando uma grande variedade de tamanhos e orientações de contato de eletrodos16,29, sugerindo que este protocolo pode ser adaptado para muitos experimentos que requerem estimulação nervosa periférica, e que pequenas variações no espaçamento de chumbo ou área de superfície que surgem da montagem de algemas à mão não afetarão criticamente a maioria dos resultados experimentais. Durante cada sessão de estimulação, monitoramos a tensão através dos condutores de manguito usando um osciloscópio para garantir que os cabos não fossem curtos ou quebrados, mas não rastreamos mudanças na impedância de dispositivos implantados específicos durante a duração das 5-10 semanas pós-implante. Um estudo de um dispositivo implantado semelhante relatou que a impedância aumenta significativamente durante as primeiras 4 semanas após a implantação cirúrgica, presumivelmente como a lesão aguda estabiliza30. Neste estudo, no entanto, as alterações na impedância do dispositivo não foram correlacionadas com o desempenho do dispositivo ao longo de 8 semanas de implantação crônica: os autores não relataram nenhuma mudança significativa na relação entre intensidade de VNS e amplitude potencial de ação composta ao longo de várias semanas após o implante. Aqui, fomos capazes de validar funcionalmente o desempenho da braçadeira após 5-10 semanas de implantação por (i) verificando que o VNS ainda poderia evocar uma cessação de respiração e queda no SpO2 consistente com o reflexo hering-breuer, e (ii) replicando trabalhos anteriores demonstrando a reorganização do mapa motor induzido pelo VNS. Em nosso próprio trabalho, descobrimos que a indução do reflexo Hering-Breuer é a maneira mais confiável de validar a funcionalidade de longo prazo das manguitos VNS implantados, que podem apresentar desempenho ou falha do dispositivo reduzido devido a uma série de fatores não relacionados à montagem da braçadeira; estes incluem complicações cirúrgicas, danos nos nervos e/ou danos mecânicos na braçadeira ou na tampa da cabeça. Excelente técnica cirúrgica e validação específica da aplicação da funcionalidade do dispositivo é crucial para o uso estável e bem sucedido de eletrodos de punho estimulantes cronicamente implantados.
Descrevemos uma abordagem simples e barata para a montagem de eletrodos de manguito nervoso periférico para implantação crônica em animais de pequeno porte e demonstramos sua utilidade para a entrega de VNS durante experimentos comportamentais com ratos. O VNS está cada vez mais sob investigação para uma ampla gama de indicações clínicas, incluindo doenças inflamatórias como artrite reumatoide1,,2 e doença de Crohn,31, bem como distúrbios neurológicos como acidente vascular cerebral5,,6,,7,,8 e TEPT10,,11. Este método acessível para fazer eletrodos de punho estimulantes deve facilitar o uso de modelos de roedores pré-clínicos em uma variedade de estudos de pesquisa translacional sobre os mecanismos e eficácia do VNS. O protocolo é facilmente adaptável, aumentando ainda mais a versatilidade da abordagem. Por exemplo, o diâmetro e/ou comprimento do tubo de poliuretano pode ser modificado para acomodar experimentos de estimulação crônica em outras espécies ou em outros locais nervosos periféricos (por exemplo, nervos ciáticos, frênicos ou sacrais). Alternativamente, configurações com leads adicionais poderiam permitir a estimulação em vários locais ao longo do nervo, ou poderiam acomodar a gravação simultânea de um potencial de ação composto evocado por estimulação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Universidade do Texas em Dallas e pelo Conselho de Regentes da UT. Agradecemos a Solomon Golding, Bilaal Hassan, Marghi Jani e Ching-Tzu Tseng por assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
References
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson's disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F.
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
