Summary
Befintliga tillvägagångssätt för att konstruera kroniskt implanterbara perifera nervmanschettelektroder för användning i små gnagare kräver ofta specialiserad utrustning och / eller högt utbildad personal. I detta protokoll visar vi en enkel, låg kostnad tillvägagångssätt för fabricering kroniskt implanterbara manschettelektroder, och visa deras effektivitet för vagus nerv stimulering (VNS) hos råttor.
Abstract
Perifera nervmanschettelektroder har länge använts inom neurovetenskaperna och relaterade områden för stimulering av till exempel vagus eller sciatic nerver. Flera nyligen genomförda studier har visat effektiviteten av kronisk VNS för att förbättra centrala nervsystemet plasticitet för att förbättra motor rehabilitering, utrotning lärande och sensorisk diskriminering. Konstruktion av kroniskt implanterbara enheter för användning i sådana studier är utmanande på grund av råttors ringa storlek, och typiska protokoll kräver omfattande utbildning av personal och tidskrävande mikrofabrikationsmetoder. Alternativt kan kommersiellt tillgängliga implanterbara manschettelektroder köpas till en betydligt högre kostnad. I detta protokoll presenterar vi en enkel, billig metod för konstruktion av små, kroniskt implanterbara perifera nervmanschettelektroder för användning på råttor. Vi validerar den korta och långsiktiga tillförlitligheten hos våra manschettelektroder genom att visa att VNS i ketamin/xylazin sövda råttor producerar minskar i andningshastighet överensstämmer med aktivering av Hering-Breuer reflex, både vid tidpunkten för implantation och upp till 10 veckor efter enheten implantation. Vi visar ytterligare lämpligheten av manschetten elektroder för användning i kronisk stimulering studier genom att para VNS med skickliga spaken tryck prestanda för att inducera motor när kartan plasticitet.
Introduction
Nyligen har efterfrågan på kroniskt implanterbara manschettelektroder för stimulering av perifera nerver vuxit, eftersom studier allt mer visar den prekliniska nyttan av denna teknik för behandling av ett flertal inflammatoriska sjukdomar1,2,3 och neurologiska sjukdomar4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Kronisk VNS, till exempel, har visat sig förstärka neokortikal plasticitet i en mängd olika lärande sammanhang, förbättra motor rehabilitering4,5,6,7,8, utrotning lärande10,11,12,13,14, och sensorisk diskriminering15.8 Kommersiellt tillgängliga perifera nervmanschettelektroder är ofta förknippade med förlängda tider för orderuppfyllande och relativt höga kostnader, vilket kan begränsa deras tillgänglighet. Alternativt, protokoll för "in-house" tillverkning av kroniskt implanterbara manschetten elektroder förblir begränsad, och gnagare anatomi presenterar särskilda utmaningar på grund av sin ringa storlek. Nuvarande protokoll för att konstruera manschettelektroder för kroniska gnagare experiment kräver ofta användning av komplex utrustning och tekniker, samt omfattande utbildad personal. I detta protokoll visar vi en förenklad strategi för manschetten elektrod fabricering baserad på tidigare publicerade och allmänt använda metoder16,17. Vi validerar funktionaliteten hos våra kroniskt implanterade elektroder hos råttor genom att visa att, vid tidpunkten för manschettimplantation runt den vänstra massundersökning vagusnerven, stimulering tillämpas på manschetten elektroder framgångsrikt fram ett upphörande av andning och släpp i SpO2. Stimulering av afferenta pulmonell receptor vagala fibrer är känt för att engagera Hering-Breuer reflex, där hämningen av flera andningskärnor i hjärnstammen resulterar i dämpning inspiration18. Således, upphörande av andningen överensstämmer med Hering-Breuer reflex, och den resulterande nedgången i SpO2, ger en enkel test för korrekt elektrod implantation och manschetten funktion i sövda råttor. För att validera den långsiktiga funktionaliteten hos kroniskt implanterade manschettelektroder mättes reflexsvar vid tidpunkten för implantationen och jämfördes med de svar som erhölls hos samma djur sex veckor efter implantation. En andra grupp av råttor var implanteras med VNS manschett elektroder efter beteendemässiga utbildning på en hävstång trycka uppgift. Hos dessa råttor, VNS ihopkopplade med korrekt uppgift prestanda produceras omorganisation av den kortikala motor kartan, överensstämmer med tidigare publiceradestudier 19,20,21,22. Vid tidpunkten för motor när kartläggning under anestesi, som inträffade 5–10 veckor efter anordning implantation, vi validerade vidare manschettfunktion i VNS-behandlade djur genom att bekräfta att VNS framgångsrikt inducerade ett upphörande av andningen och en större än 5% nedgång i SpO2.
De nyligen publicerade protokollen från Childs et al.17 och Rios et al.16 ger en väl validerad utgångspunkt för en förenklad manschetten elektrod fabrication strategi, eftersom denna populära metod har utnyttjats av flera laboratorier genomföra kroniskA VNS studier i gnagare1,2,3,4,5,6,7,8,99,10,11. Den ursprungliga metoden innebär flera hög precision steg för att manipulera de fina mikrotrådar så att manschetten elektrod tillverkning tar över en timme att slutföra, och omfattande utbildning för att utföra tillförlitligt. Det förenklade tillvägagångssätt som beskrivs här kräver betydligt färre material och verktyg och kan slutföras på under en timme av minimalt utbildad personal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll utförs i enlighet med NIH Guide för vård och användning av försöksdjur och godkändes av institutionella Djurvård och användning kommittén för University of Texas i Dallas.
1. Stimulerande manschetten elektrod tillverkning
- Förbered manschetten.
- Skär med hjälp av ett rakblad en bit av polymerrör 2,5 mm i längd. Sätt in totippars spetsar eller ett gem genom slangarna och använd bladet för att göra en slits på längden genom slangens vägg på ena sidan manschetten.
- Ta ut trikåerna från slangarna och sätt in en stor synål genom mittlinjen i manschetten, vinkelrätt mot den långa axeln. För in nålen genom slitsen (överst) och in i mitten av slangen mittemot (nederst). Placera nålen i skumkortet för att fästa manschetten på plats under de återstående monteringsstegen.
- Placera sutur för säkring av manschettens stängning under implantation.
- För in den lilla synålen genom manschettens vägg, på mittlinjen, cirka 0,5 mm från den övre slitsen på ena sidan. Stick in nålen från invändigt till yttre för att undvika att skada manschettens slang. För in en 2 cm längd på 6/0 sutur genom nålens öga och dra nålen genom slangens vägg för att trä in suturen i manschetten.
- Lämna tråden på plats, ta bort nålen och punktera ett andra hål genom slangväggen cirka 0,5 mm under det första hålet, längs mittlinjen av manschetten. För in suturen genom nålens öga och dra nålen genom slangväggen för att återigen trä suturen genom manschetten.
- Suturgängans båda ändar ska nu vara på manschettens yttre sida. Justera suturen så att ~1,5 cm sträcker sig från det övre hålet, och ~0,5 mm sträcker sig från bottenhålet.
- Applicera en liten mängd UV-kurlim på den korta änden av suturen som sträcker sig från det nedre hålet och dra den längre suturänden tills den nedre svansen är nästan i jämnhöjd med den yttre väggen på slangen. Använd UV-staven för att bota limmet och håll suturen stadigt på plats.
- Upprepa steg 1.2.1 till och med 1.2.3 på motsatt sida av manschetten.
- Placera trådledningarna platinum:iridium (Pt:Ir).
- Använd den lilla synålen för att göra 4 hål i manschettväggen. Varje hålpar bör placeras cirka 0,5–0,8 mm från den vinkelräta mittlinjen, med ett hål som är ungefär 0,5–0,8 mm från den översta slitsen på vardera sidan av manschetten.
VAR FÖRSIKTIG: För den mest konsekventa och exakta placeringen av ledningarna, för in nålen från invändigt till yttre för att göra alla hål, med hjälp av suturplaceringen som guide. - Sätt in synålen igen, denna gång arbetar från exteriör till interiör, genom bly hål 1. Sätt in ca 0,5 cm av en 7,5 cm längd pt:Ir-tråd genom nålens öga och dra nålen genom slangen för att trä trådens ledning genom manschettväggen. Justera tråden så att ~4,5 cm sträcker sig på manschettens yttersida (Bild 1A).
- Stick in nålen genom bly hål 1 igen, igen arbetar exteriör-till-interiör, och dessutom för in nålen genom bly hål 2 rakt över från bly hål 1. Sätt in ~0,5 cm av pt:ir-ledningens kortare (invändiga) ände genom nålens öga och dra nålen genom slangen för att trä trådens ledning genom manschettväggarna.
OBS: Båda ändarna av Pt:Ir-ledningen ska nu vara på manschettens yttre sida, och en trådslinga bildas runt spaltkanten och genom blyhål 1 (Bild 1B). - Upprepa steg 1.3.1 till och med 1.3.3 för att placera Pt:Ir-tråd genom blyhål 3 och 4.
- Med hjälp av en butantändare tar du försiktigt bort isoleringen från en 5–6 mm längd i slutet av Pt:Ir-trådar som sträcker sig från blyhål 2 och blyhål 4.
VAR FÖRSIKTIG: Isolera ändarna av lederna från resten av manschetten montering försiktigt för att undvika att skada på manschetten. Använd verktyg för att hålla i trådarna för att undvika skador. - Rikta den nakna tråden inuti manschetten för att placera ledningarna på sina slutliga platser. För att göra detta, dra försiktigt i änden av Pt:Ir-ledningen som sträcker sig från hål 1 tills den oisolerade delen av tråd är i jämnhöjd med hål 1. Upprepa med den andra ledningen för att rikta in den oisolerade änden av tråden gängade genom bly hål 3 och 4.
- Applicera en liten mängd UV-kurlim på trådslingorna på yttersidan av manschetten vid blyhål 1 och 3. Använd UV-staven för att bota limmet och säkra lederna på plats.
- Använd en liten pipettspets för att driva de oisolerade Pt:Ir-ledningens ledningar mot innerväggen på manschetten. När ledningarna är på plats, skär ändarna av trådarna som sträcker sig från bly hål 2 och 4 så att cirka 1 mm av tråd sträcker sig bortom utsidan av manschetten väggen.
- Vik 1 mm svansar av tråden platt mot den yttre ytan av manschetten, var noga med att inte korta dem tillsammans. Applicera en liten mängd UV-kurlim för att bara täcka de två svansarna och bota limmet för att säkra blyplacering och ge elektrisk isolering.
VAR FÖRSIKTIG: Det är viktigt att helt täcka de utvändigt exponerade Pt:Ir-ytorna med klister för att isolera trådarna och undvika stimulering utanför målet.
- Använd den lilla synålen för att göra 4 hål i manschettväggen. Varje hålpar bör placeras cirka 0,5–0,8 mm från den vinkelräta mittlinjen, med ett hål som är ungefär 0,5–0,8 mm från den översta slitsen på vardera sidan av manschetten.
- Säkra Pt:Ir-ledningen leder på plats med sutur securement.
- Ta bort den stora nålen med manschettenheten från skumkortet. För in en 3 cm längd på 6/0 sutur genom nålens öga och dra nålen genom slangen för att trä suturen genom manschettens botten vid mittpunkten.
- Byt till den lilla synålen för att slutföra suturgängning för Pt:Ir-ledningssning. Stick in nålen genom samma mittlinjehål, arbeta igen från interiör till exteriör för att undvika deformation av slangen och tråden leder. För in suturens yttre svans genom nålens öga och dra nålen genom manschettväggen för att skapa en slinga av sutur runt kanten på manschetten (Bild 1C).
OBS: Använd forceps och arbeta under mikroskopet för att säkerställa suturen är orienterad längs den långa axeln av manschetten och ligger platt mot slangen. Detta steg säkerställer lederna förbli separerade på innersidan av manschetten och hålls på plats i sidled till manschetten mittlinjen. - Skapa en andra slinga runt den motsatta änden av manschetten genom att binda ändarna av suturen i en halv knut, på den yttre sidan av manschetten. Se till att suturen löper längs manschettens långa axel och ligger platt mot slangen. Medan du håller knuten tätt så det lägger platt mot slangen, tillämpa en liten mängd UV-bota lim på halv-knut och bota för att hålla på plats.
- Skär försiktigt ändarna av suturgängan så nära knuten som möjligt. Om det behövs, använd en liten mängd ytterligare UV-bota lim för att limma de korta ändarna av sutur så att de lägger platt mot slangen (Figur 1D).
- Lödkontaktsstift till pt:ir-trådsladdarna.
- Med hjälp av en butan lättare, ta bort isoleringen från ~ 3 mm i slutet av varje Pt: Ir tråd leder. Löda koppsidan av en guldtapp (se Tabell över material) till den oisolerade änden av varje bly.
- Testa impedansen för den monterade enheten.
- Anslut guldstiften till ingångarna av en LCR-mätare eller elektrodimpedanskontrollmodul och ställ in testfrekvensen på 1 kHz. Dränka manschetten slangar (och Pt: Ir stimulering kontakter interiör till manschetten) i en liten bägare fylld med saltlösning, var noga med att hålla guld bly stift och sond kontakter torr. Kontrollera att den hopmonterade manschetten har en impedans vid 1 kHz på mindre än 2 kΩ innan du fortsätter med implantation.
OBS: Hög impedans indikerar ofta otillräcklig Pt:Ir yta exponeras, som kan uppstå på grund av faktorer som otillräcklig borttagning av isolering, oavsiktlig applicering av lim i manschetten interiör, trasiga tråd strängar, etc. Manschetter bör också inspekteras för trasiga eller dåligt placerade trådsträngar som skulle kunna resultera i kortslutna kontakter med långvarig användning.
- Anslut guldstiften till ingångarna av en LCR-mätare eller elektrodimpedanskontrollmodul och ställ in testfrekvensen på 1 kHz. Dränka manschetten slangar (och Pt: Ir stimulering kontakter interiör till manschetten) i en liten bägare fylld med saltlösning, var noga med att hålla guld bly stift och sond kontakter torr. Kontrollera att den hopmonterade manschetten har en impedans vid 1 kHz på mindre än 2 kΩ innan du fortsätter med implantation.
2. Huvud-cap konstruktion
OBS: Headcap monteringsförfaranden liknar de som publicerats tidigare (Childs et al.17), och sammanfattas här för enkelhetens skull.
-
Montera huvudbond17
- Skär två små bitar av 30 AWG tråd wrap, en ~ 13 mm i längd och en ~ 10 mm i längd. Strippa ~1,5 mm isolering av varje ände av båda trådarna. Löda stiftsidan av en guldstift till ena änden av varje tråd, så nära koppen som möjligt. Använd trådavbitar för att skära av överflödig längd av stift bortom lödfogen.
- Löda de andra ändarna av AWG-trådarna till de två centrala lödkopparna i en 4-stifts microstrip-kontakt.
- Böj trådhuvudkapsla leder uppåt mot kontakten och placera guldstiften platt mot kontakten, parallellt med varandra, som visas i figur 2A. Stiftet som är anslutet till den kortare ledningen ska placeras under stiftet som är anslutet till den längre ledningen. Använd spik akryl, tandcement, eller UV-bota lim för att säkra huvudbonad leder på plats.
3. Användning av enheten
- Implantera manschettelektroderna för kronisk vagusnervstimulering.
OBS: Alla kirurgiska ingrepp bör utföras med steril eller aseptisk teknik under lämplig anestesi, i enlighet med NIH:s riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur och med lokalt IACUC-godkännande. Följande procedurer är tänkta att illustrera en representativ användning av enheten och är inte avsedda att vara heltäckande.- Placera råttan i en stereotaxisk ram och gör ett sagittal snitt över parietalbenen och nackbenen för att avslöja skallytan för implantation av huvudbonad/kontakt. Borra försiktigt 4 hål i skallen och placera juvelerarens skruvar. Använd dental akryl för att säkra huvudskålen till skallen och skruvar.
- Ta bort råttan från stereotaxisk ram och låg på dess högra sida. Gör ett vertikalt snitt i huden på vänster sida av halsen, och försiktigt dissekera vänster vagusnerven från halspulsådern, som ligger mellan sternomastoid och sternohyoid muskler och under omohyoid muskeln.
- Tunnel manschetten leder subkutant mot skallen. Anslut lederna till huvudbond med hjälp av guldstiften.
- Placera vagusnerven inuti manschetten och säkra enheten stängd genom att binda en dubbelknut i manschetten suturer. Var noga med att undvika att skada nerven under implantationen genom att manipulera nerven med trubbiga, nonconductive krokar eller genom att fatta bindväv som omger nerven.
- Testa implantatet genom att applicera stimulering på enheten (10 s tåg på 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs bifasiska pulser). Korrekt implantation kommer att resultera i upphörande av andningen och en nedgång i SpO2 av 5% eller mer.
- Täck guldstiften och exponerade leder med dental akryl, nära sår med suturer, och rengör snittet platser med saltlösning, alkohol, och povidone jod lösning.
- Tillhandahålla ersättningsvätskor, smärtstillande medel och postoperativ vård i linje med NIH:s riktlinjer och IACUC-godkännande.
- Stimulera vagusnerven under vaket beteende.
OBS: Leverans av VNS som djur utför specifika motoriska uppgifter har tidigare visat sig expandera motorkartan representation av uppgiftsrelevant muskulatur. Vi använder detta validerade paradigm för att ge ett representativt exempel på enhetsanvändning, men många andra beteendemässiga paradigm och/eller stimuleringsparametrar kan vara relevanta för alternativa program. Råttor tränades att färdigheter på spaken tryck uppgift som används här före enheten implantation. Efter operationen, god utförande var igen verifierat före VNS leveransen: råtta utfört det vill säga minst 100 framgångsrik försöken i två 30 min bildning samlingen per dag. VNS parades med korrekt spaken pressar under 10 efterföljande träningspass under 5 dagar.- Anslut råttan till en stimulusgenerator via implanterat huvud-lock och justera till lämpliga stimuleringsinställningar. För VNS-inducerad omorganisation av motorkortikalkartan, para ihop varje korrekt spaktryck med ett enda tåg på 15 bifasiska pulser, var och en med en bredd på 100 μs och amplitud på 800 μA, som levereras med en frekvens av 30 Hz.
- Ett stimuleringståg levereras omedelbart efter detektion av varje lyckad spaktryck under tio 30 min träningspass. Under VNS-leverans, använd ett oscilloskop för att övervaka framgångsrik leverans av aktuell stimulering.
- Validera kroniskt implanterad manschettfunktion.
- Inom 24 h av den senaste VNS-parade träningspass, använd intrakraniell mikrostimulering (ICMS) för att kvantifiera den funktionella somatotopic kartan i motor cortex19,20,21,22.
- Efter induktion av anestesi för ICMS-kartläggning av motorbarken, validera manschettfunktionen igen genom att tillämpa ett 10 s-tåg på 30 Hz, 0,8 mA strömstimulering (100 μs bifasiska pulser), vilket bör resultera i ett upphörande av andningen och minskning av SpO2 nivåer på minst 5%, som överensstämmer med Hering-Breuer-reflexen.
OBS: Beroende på applikation kan manschettfunktion anses godtagbar om en tillförlitlig SpO2-nedgång på mindre än 5 % observeras, eller om högre strömamplitud (upp till 1,6 mA) på ett tillförlitligt sätt ger minst en 5% minskning av SpO2. Underlåtenhet att observera ett upphörande av andningen och/eller en tillförlitlig minskning av SpO2 är ett tecken på implantatfel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vagus nervmanschett elektroder och headcaps var kroniskt implanteras i råttor enligt tidigare publicerade kirurgiska ingrepp17,19,20,21,22. Före implantation mättes impedans vid 1 kHz tvärs över manschettens ledningar med manschettens slangar nedsänkta i saltlösning (impedans = 1,2 ± 0,17 kΩ [medelvärde ± std]; N = 9). Endast manschetter med impedanser mindre än 2 kΩ i saltlösning var implanteras; alla manschetter uppfyllde detta kriterium (0/9 manschetter exkluderade). Under implantation operationer utfördes funktionell validering av alla manschetter genom att testa för en stimulering-inducerad kort upphörande av andning och efterföljande droppe i blodet syre mättnad tillskrivs Hering-Breuer reflex. För att framkalla detta svar, levererades ett 10 s tåg på 30 Hz, 0,8 mA ström stimulering (100 μs bifasiska pulser) över manschetten leder. För 9/9 implanterade manschetter, vi observerade ett VNS-inducerat upphörande av andningen under varaktigheten av 10 sek stimulering, som åtföljdes av en nedgång i SpO2 på minst 5% (% förändring i SpO2 = -10,3 ± 3,2%, genomsnittlig ± std; intervall = -5,7 till -14,5%), bekräftar funktion manschetten och korrekt implantation. Under inledande implantation, fann vi en betydande korrelation mellan inledande SpO2 avläsningar och den procentuella förändringen i SpO2 framkallas av VNS (Figur 2B; R2 = 0,60, p = 0,0083, Pearsons linjära korrelation), som överensstämmer med publicerad litteratur som visar att anestesidjup påverkar hering-breuerreflexen23,24. För att testa den långsiktiga funktionaliteten hos de kroniskt implanterade manschetterna, var råttor sövda igen 6 veckor efter enheten implantation och VNS tillämpades för att framkalla Hering-Breuer reflex svar. För 7 av 9 enheter observerade vi en större än 5% nedgång i SpO2 med hjälp av 10 s tåg på 0,8 mA, 30 Hz stimulering (Figur 2C). I dessa enheter är storleken på stimulering-framkallade förändring i SpO2 skilde sig inte från den som observerades vid första implantationen, vilket tyder på utmärkt fortsatt prestanda hos de kroniskt implanterade anordningarna (initial % förändring i SpO2 = -9,7 ± 3,4 %, slutlig % förändring i SpO2 = -15,8 ± 6,5%, medelvärde ± std; p = 0,08, parat t-test). I de återstående 2 enheterna, öka stimulering amplituden till 1,6 mA var tillräcklig för att framkalla en tillförlitlig minskning av SpO2 på minst 5%, vilket tyder på att dessa enheter fortsatte att fungera, men att förändringar i impedans, nervskador, eller manschetten orientering över tiden kan ha resulterat i nedsatt prestanda.
För att ytterligare testa den långsiktiga funktionaliteten hos våra kroniskt implanterade stimulerande elektroder, en andra grupp av råttor utbildades på en förenklad version av en skicklig nå spak-press uppgift som utvecklats av Hays et al. att kvantitativt bedöma forelimb motor prestanda25. Flera studier har visat att para ihop VNS med korrekt motor prestanda på denna uppgift resulterar i utbyggnaden av den proximala framben representation i primära motor cortex19,20,21,22. I vår förenklade version av uppgiften, råttor var skyldiga att nå 2 cm utanför träningsmontern att helt trycka ner en spak, och sedan att släppa den inom 2 s för att få en mat belöning (Figur 2D). Djur fick två 30 min träningspass per dag tills de uppnått stabila kunskaper om uppgiften (>65% korrekt, >100 försök/session, för minst 8/10 på varandra följande sessioner). Råttor genomgick sedan operation för att implantera en stimulerande manschetten elektrod runt sin vänstra vagus nerv. Efter återhämtning från kirurgi, acklimatisering till stimulerande kablar, och återgå till skicklig beteendemässiga prestanda, råttor fick ytterligare 10 träningspass där VNS (0,5 s tåg på 0,8 mA, 30 Hz pulser; 100 μs bifasisk puls bredd), eller simulerad stimulering (ingen stimulering), levererades vid tidpunkten för korrekt spak release. Inom 24 h efter den sista VNS-parade träningspass, råttor var sövda med ketamin/xylazine (80/10 mg/kg, i.p.), manschett elektrod funktion testades, och när motor kartläggning utfördes enligt publicerade förfaranden22. Förenliga med tidigare studier som visar att VNS driver expansion av uppgiftsrelevanta motorkartarepresentationer, VNS behandlade råttor (N = 3) uppvisade betydligt större proximala frambens (PFL) representationer än skenbehandlade råttor (N = 4) i vår studie (Figur 2D; PFL % av den totala kartarean, medelvärde + SEM: sham = 15,6 ± 6,7 %, VNS = 38,3 ± 1,0 %; p = 0,035, 2-prov t-test, testeffekt = 0,8). I alla VNS-behandlade djur validerades manschettfunktionen efter induktion av anestesi vid tidpunkten för mappningen, 5–10 veckor efter implantatet, genom att bekräfta en större än 5% förändring i SpO2 inträffade som svar på VNS (10 s tåg på 0,8 mA, 30 Hz pulser; 100 μs biphasic breddpuls).
Bild 1: Montering av de stimulerande manschettelektroderna. (A) Efter att ha säkrat suturerna på vardera sidan av manschetten kan Pt:Ir-tråden träs genom manschettväggen vid hål #1 (vit pilspets) med hjälp av en synål. (B) Pt:Ir tråd är ordentligt gängad och klar för de-isolering efter att ha skapat en trådslinga runt manschettkanten och trä tråden igen genom hål #1 (vit pilspets) och tvärs över manschetten genom hål #2 (gul pilspets). (C) När båda lederna är på plats, säkra den första ledningen genom att gänga sutur genom mittlinjen hålet och runt manschetten kanten (gul pilspets). (D) Stäng slingan runt den andra ledningen med en halvknut och lim på plats för att slutföra manschettmontering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Apparatanvändning för kronisk vagusnervstimulering i vakna beter råttor. (A) Headcap montering. (B) Under enheten implantation, VNS-framkallade minskningar i SpO2 var korrelerade med inledande SpO2 avläsningar (R2 = 0,602, p = 0,008, Pearsons linjär korrelation). (C) Jämförelse av VNS-framkallade SpO2 droppar som erhållits vid anordning implantation kontra vid avslutandet av stimulering experiment 6 veckor senare. Linjer anger par av mätningar för enskilda råttor. Stimulering i panelerna B och C bestod av ett enda 10 s tåg på 100 μs bifasiska pulser levereras vid 0,8 mA och 30 Hz. (D) Råtta med kroniskt implanterade VNS manschett elektroder utför den spak-press uppgift. (E) VNS (0,5 s tåg på 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs bifasiska pulser) ihopkopplade med korrekt spak-press prestanda expanderat kartan representation av uppgiftsrelevanta muskulatur i motor cortex. Rats som fick VNS parat med korrekt spak pressprestanda (N = 3) uppvisade en betydligt större andel av motor karta område ägnas åt proximala framben (PFL) representation jämfört med råttor som fick Sham stimulering (N = 4). Prickar visar PFL representationer för enskilda ämnen; felstaplar indikerar SEM. VNS-behandling följt av motor när mappning utfördes 5– 10 veckor efter implantation. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en enkel, låg kostnad tillvägagångssätt för montering av kroniskt implanterbara stimulerande manschett elektroder för användning i gnagare, underlätta prekliniska undersökningar av denna framväxande terapi. Denna förenklade metod kräver ingen specialiserad utbildning eller utrustning, och använder ett litet antal verktyg och förnödenheter som är lättillgängliga för de flesta forskningslaboratorier, vilket minskar både de monetära och arbetskostnader för enhetstillverkning jämfört med andra metoder16,26,27,28. Care krävs i hela monteringen för att undvika överdriven applicering av UV-bota lim samtidigt som tillräcklig mekanisk stabilitet av suturerna och Pt:Ir leder för långvarig manschettfunktion. Överdriven lim komplicerar enheten implantation och kan irritera omgivande vävnad efter operationen, medan otillräcklig lim ökar sannolikheten för att med tiden lederna inte kan upprätthålla god kontakt med nerven, vilket resulterar i minskad enhet prestanda eller misslyckande. Konsekvent placering av de-isolerade Pt: Ir ledningar inuti manschetten lumen är också avgörande för att uppnå låga impedanser och bra enhetsprestanda. Försiktighet bör vidtas för att korrekt rikta in den avisolerade tråden så att den maximala möjliga ytan av exponerad tråd sitter inuti manschetten, medan ingen exponerad tråd finns externt.
Vi har validerat att vårt tillvägagångssätt producerar manschetter av liknande storlek och tillförlitlighet som de som för närvarande är i allmänt bruk av flera labb för kronisk VNS leverans i råttor4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,19,20,21,22. Nyligen genomförda studier visar att perifera nervfibrer på liknande sätt rekryteras med hjälp av en mängd olika elektrod kontaktstorlekaroch orienteringar 16,29, vilket tyder på att detta protokoll kan anpassas för många experiment som kräver perifer nerv stimulering, och att små variationer i blyavstånd eller yta som uppstår från montering av manschetter för hand kommer inte kritiskt påverka de flesta experimentella resultat. Under varje stimuleringssession övervakade vi spänningen över manschettens leads med hjälp av ett oscilloskop för att säkerställa att ledningarna inte kortsluts eller bröts, men vi spårade inte förändringar i impedans för specifika implanterade enheter under hela 5–10 veckor efter implantatet. En studie av en liknande implanterad anordning rapporterade att impedansen ökar signifikant under de första 4 veckorna efter kirurgisk implantation, förmodligen som den akuta skadan stabiliseras30. I denna studie, dock, förändringar i enheten impedans var inte korrelerade med enhetens prestanda över 8 veckor av kronisk implantation: författarna rapporterade ingen signifikant förändring i förhållandet mellan VNS intensitet och sammansatta åtgärder potentiella amplitud under flera veckor post-implantat. Här, Vi var på samma sätt kunna funktionellt validera manschetten prestanda efter 5–10 veckor av implantation genom (i) kontrollera att VNS fortfarande kunde framkalla ett upphörande av andning och släpp i SpO2 överensstämmer med Hering-Breuer reflex, och (ii) replikera tidigare arbete som visar VNS-inducerad motor karta omorganisation. I vårt eget arbete har vi funnit induktion av Hering-Breuer reflex vara det mest tillförlitliga sättet att validera långsiktig funktionalitet av implanterade VNS manschetter, som kan uppvisa minskad enhetsprestanda eller fel på grund av ett antal faktorer som inte har samband med manschettmontering; dessa inkluderar kirurgiska komplikationer, nervskador, och/ eller mekaniska skador på manschetten eller huvudbonad. Utmärkt kirurgisk teknik och tillämpningsspecifik validering av enhetens funktionalitet är avgörande för stabil och framgångsrik användning av kroniskt implanterade stimulerande manschettelektroder.
Vi har beskrivit en enkel, billig metod för montering av perifera nervmanschett elektroder för kronisk implantation i små djur och visat dess användbarhet för VNS leverans under råtta beteendemässiga experiment. VNS är alltmer under utredning för ett brett spektrum av kliniska indikationer, inklusive inflammatoriska sjukdomar som reumatoid artrit1,2 och Crohns sjukdom,31 samt neurologiska sjukdomar såsom stroke5,6,7,8 och PTSD10,11. Denna tillgängliga metod för att tillverka stimulerande manschettelektroder bör underlätta användningen av prekliniska gnagarmodeller i en mängd olika translationella forskningsstudier om mekanismerna och effekten av VNS. Protokollet är lätt anpassningsbar, ytterligare öka mångsidigheten i tillvägagångssättet. Till exempel kan diametern och/eller längden på polyuretanslangen modifieras för att rymma kroniska stimuleringsexperiment hos andra arter eller vid andra perifera nervställen (t.ex. ischias-, phrenic- eller sakralnerv). Alternativt, konfigurationer med ytterligare leder kan möjliggöra stimulering på flera platser längs nerven, eller kunde rymma samtidig inspelning av en stimulering-evoked sammansatta åtgärder potential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av University of Texas i Dallas och UT Board of Regents. Vi tackar Solomon Golding, Bilaal Hassan, Marghi Jani och Ching-Tzu Tseng för tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
References
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson's disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F.
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
