Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Brug caenorhabditis elegans til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

For at studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaktioner, udfører vi syntetiske interaktion skærme i Caenorhabditis elegans ved hjælp af RNA interferens i kombination med milde mutationer eller over-udtryk for chaperoner og overvåge vævsspecifikke protein dysfunktion på organismeniveau.

Abstract

Korrekt foldning og samling af proteiner og proteinkomplekser er afgørende for cellulær funktion. Celler anvender kvalitetskontrolveje, der korrigerer, afholder eller eliminerer beskadigede proteiner for at opretholde et sundt proteom, hvilket sikrer cellulære proteostase og forhindrer yderligere proteinskader. På grund af overflødige funktioner inden for proteostase netværk, screening for påviselige fænotyper ved hjælp af knockdown eller mutationer i chaperone-kodning gener i multicellulære organisme Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning af mindre eller ingen fænotyper i de fleste tilfælde. Vi har udviklet en målrettet screeningsstrategi for at identificere chaperoner, der kræves til en bestemt funktion og dermed bygge bro mellem fænotype og funktion. Specifikt overvåger vi nye chaperone interaktioner ved hjælp af RNAi syntetiske interaktion skærme, banke-down chaperone udtryk, en anstandsdame ad gangen, i dyr, der bærer en mutation i en anstandsdame-kodning gen eller over-udtrykke en anstandsdame af interesse. Ved at forstyrre to chaperoner, der individuelt præsenterer ingen brutto fænotype, kan vi identificere chaperoner, der forværrer eller udsætter en bestemt fænotype, når begge forstyrres. Vi viser, at denne tilgang kan identificere specifikke sæt chaperoner, der fungerer sammen for at modulere foldningen af et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en given fænotype.

Introduction

Celler klare proteinskader ved at anvende kvalitetskontrol machineries at reparere, binde eller fjerne eventuelle beskadigede proteiner1,2. Foldning og samling af proteinkomplekser understøttes af molekylære chaperoner, en forskelligartet gruppe af meget konserverede proteiner, der kan reparere eller binde beskadigede proteiner3,4,5,6,7. Fjernelsen af beskadigede proteiner medieres af ubiquitin-proteasome-systemet (UPS)8 eller af autophagy-maskinerne9 i samarbejde med chaperoner10,11,12. Protein homøostase (proteostase) vedligeholdes derfor af kvalitetskontrolnetværk, der består af folde- og nedbrydningsmaskiner3,13. Det er imidlertid en stor udfordring at forstå samspillet mellem de forskellige komponenter i proteostasenetværket in vivo. Mens protein-protein interaktion skærme bidrage med vigtige oplysninger om fysiske interaktioner og chaperone komplekser14,15, forståelse af organisation og kompenserende mekanismer inden for vævsspecifikke chaperone netværk in vivo mangler.

Genetiske interaktioner bruges ofte som et kraftfuldt værktøj til at undersøge forholdet mellem par af gener, der er involveret i fælles eller kompenserende biologiske veje16,17,18. Sådanne relationer kan måles ved at kombinere par mutationer og kvantificere virkningen af en mutation i et gen på den fænotypiske sværhedsgrad forårsaget af en mutation i det andet gen16. Mens de fleste sådanne kombinationer ikke viser nogen effekt i form af fænotype, nogle genetiske interaktioner kan enten forværre eller lindre sværhedsgraden af den målte fænotype. Skærpende mutationer observeres, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mere alvorlig end den forventede fænotype set ved at kombinere enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer i parallelle veje, sammen påvirker en given funktion. I modsætning hertil observeres lindre mutationer, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mindre alvorlig end fænotypen set med enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer sammen som et kompleks eller deltage i den samme vej16,18. Derfor er forskellige fænotyper, der kan kvantificeres, herunder brede fænotyper, såsom dødelighed, vækstrater og brødstørrelse, samt specifikke fænotyper, såsom transskriptionelle journalister, blevet brugt til at identificere genetiske interaktioner. For eksempel, Jonikas et al. påberåbt sig en ER stress reporter til at undersøge interaktioner af Saccharomyces cerevisiae ER udfoldet protein respons proteostase netværk ved hjælp af parvis gensletning analyser19.

Genetiske interaktion skærme indebærer systematisk krydser parvis sletning mutationer til at generere et omfattende sæt af dobbelt mutanter20. Men i dyremodeller, og specifikt i C. elegans,er denne store tilgang ikke mulig. I stedet kan mutantstammer testes for deres genetiske interaktionsmønstre ved at nedregulerende genekspression ved hjælp af RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans er et kraftfuldt system til skærme baseret på RNAi22,23. I C. elegansopnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriel fodring, hvilket fører til spredning af dsRNA-molekyler til mange væv. På denne måde påvirker de indførte dsRNA-molekyler dyret via en hurtig og enkel procedure21. En genetisk interaktion skærm ved hjælp af RNAi kan derfor afsløre virkningen af ned-regulering af et sæt af gener eller de fleste C. elegans kodning gener ved hjælp af RNAi biblioteker24. I en sådan skærm, hits, der påvirker adfærd mutant af interesse, men ikke den vilde type stamme er potentielle modifikatorer af fænotypen overvåges25. Her anvender vi en kombination af mutationer og RNAi screening til systematisk at kortlægge vævsspecifikke chaperoneinteraktioner i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af nematode vækst medieplader til RNAi

  1. Til en 1 L flaske, tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar og destilleret vand op til 1 L og autoklave.
  2. Kølig flaske til 55 °C.
  3. Tilsæt 25 mL af 1 M KH2PO4, pH 6,0, 1 mL af 1 M CaCl2,1 mL på 1 M MgSO4og 1 mL kolesterolopløsning (tabel 1) for at lave nematode vækstmedier (NGM).
  4. Der tilsættes 1 mL ampicillin (100 mg/mL) og 0,5 mL 1 M IPTG (tabel 1) for at fremstille NGM-RNAi-opløsning.
    BEMÆRK: Almindeligt anvendte HT115(DE3) E. coli bakterier indeholder en IPTG-inucible T7 DNA polymerase, der anvendes til at udtrykke dsRNA-kodning plasmid. Disse plasmider også kode for ampicillin resistens.
  5. Bland den varme opløsning ved at hvirvle flasken.
  6. Hæld NGM-opløsningen i pladerne eller brug en peristaltisk pumpe i emhætten eller ved hjælp af sterile procedurer. Brug 6-brønd, 12-brønd, 40 mm eller 60 mm plader til denne skærm. Agar skal fylde omkring 2/3 af pladedybden.
  7. Lad pladerne tørre natten over på bænken ved stuetemperatur, og hold pladerne dækket. NGM plader til RNAi kan opbevares ved 4 °C i op til en måned.

2. Dyrkning af RNAi bakterier og såning pladerne

  1. I emhætten eller ved hjælp af sterile procedurer tilsættes 1 mL ampicillin (100 mg/mL) og 2,5 mL tetracyklin (5 mg/mL) (tabel 1) til en præauklavet 1 L LB-opløsning og blanding.
    BEMÆRK: Almindeligt anvendte HT115(DE3) E. coli bakterier er tetracyklinresistente.
  2. I emhætten eller ved hjælp af sterile procedurer tilsættes 600 μL LB-opløsning til hver brønd i 2 mL-dybe 96-brønd sterile plader. Det er bedst at bruge en multikanalpipet til dispensering af medierne.
  3. Ved hjælp af sterile procedurer, pode brønde med HT115 (DE3) E. coli bakterier omdannes med en dsRNA-kodning plasmid målretning et gen af interesse eller en tom plasmid, som en kontrol. Pladerne tildækkes, og inkuberes ved 37 °C natten over. Biblioteker, der består af bakterielle kloner udtrykker dsRNA, svarende til ~ 94% af forudsagtE C. elegans gener blev tidligere konstrueret22,23 og er kommercielt tilgængelige. Chaperone biblioteket bruges her blev bygget af Dr. Richard Morimoto laboratorium26.
  4. Ved hjælp af sterile procedurer, frø 75, 150 eller 250 μL af bakterier på 12-brønd, 40 mm og 6-brønd eller 60 mm NGM RNAi plader, henholdsvis. Tydeligt markere navnet på målet genet på pladen. Bakterier skal dække 30-50% af agaroverfladen og bør ikke røre pladens kanter.
  5. Lad pladerne tørre i mindst 2 dage på bænken ved stuetemperatur, og hold pladerne dækket.
    BEMÆRK: Plader kan inkuberes ved 37 °C natten over. Sørg for, at de indre brønde er tørre, før du bruger eller opbevarer pladerne. Til alle langsigtede formål (dvs. tørring eller opbevaring) skal pladerne holdes i mørke. Tørrede, seedede plader kan opbevares ved 4 °C i op til en måned.

3. Ikke-stressende synkronisering af embryoner

  1. Brug en orm pick til at flytte omkring 100 æg fra en ikkesynkroniseret orm plade til en nyligt seedet NGM plade.
  2. Dyr dyrkes i 5 dage ved 15 °C, 3,5 dage ved 20 °C eller 2,5 dage ved 25 °C. Dyr skal nå den første dag med æglægning.
    BEMÆRK: Orme dyrkes almindeligvis ved 20 °C. Men, forskellige chaperone mutant stammer kan kræve specifikke dyrkning temperaturer. For eksempel dyrkes mange temperaturfølsomme stammer ved 15 °C, men flyttes til 25 °C for at eksponere deres fænotype.
  3. Tilsæt 1 mL M9 buffer (Tabel 1) langsomt og væk fra bakterieplænen. Roter pladen, så bufferen dækker pladen helt. Vip den derefter til den ene side og fjern væsken fra pladen og vask dyrene af pladen.
    BEMÆRK: Når du bruger temperaturfølsomme dyr eller chaperone mutanter, er det bedst at opretholde de buffere, der anvendes i protokollen ved dyrenes dyrkningstemperatur.
  4. Gentag trin 3,3 tre gange, eller indtil alle dyrene er vasket af pladen.
  5. Ved hjælp af en standard plastspids skæres en firkant af agar fra vaskepladen, hvor æggene er koncentreret, og læg agarstykket på en nyligt sået NGM-plade.
    BEMÆRK: ~ 200 æg er forpligtet til at producere nok æglæggende dyr; for mange dyr indtager bakterierne for hurtigt. Lave fødevareniveauer kan påvirke proteostase27.
  6. Dyrene dyrkes i 5 dage ved 15 °C, 3,5 dage ved 20 °C eller 2,5 dage ved 25 °C. På dette tidspunkt skal pladerne dækkes med synkroniserede æg.
    BEMÆRK: Dyr kan flyttes til en ny plade i en kort periode for en strengere synkronisering. Det er dog vigtigt kun at bruge voksne i de tidlige stadier af æglægning, da dyr kan bevare æg i deres livmoder, der påvirker synkroniseringen.
  7. Tilsæt 1 mL M9 buffer langsomt og væk fra bakterieplænen.
  8. Roter pladen, så bufferen dækker pladen helt. Vip den derefter til den ene side og fjern væsken fra pladen og vask dyrene af pladen.
  9. Gentag trin 3,7 tre gange, eller indtil alle dyr vaskes af pladen.
  10. Tilsæt 1 mL M9 buffer og brug en celleskraber til at frigive æggene fra pladen.
  11. Saml M9 bufferen, der indeholder æggene fra pladerne.
  12. Centrifuge M9 buffer indeholder æggene på 3.000 x g i 2 min.
  13. Fjern supernatanten, og tilføj M9-bufferen for at nå en diskenhed på 1 mL.
  14. Genbrug æggene for at forstyrre eventuelle bidder af æg og bakterier.
  15. Gentag den vaskeprocedure, der er beskrevet i trin 3.11-3.13, fem gange. Æggepillen skal fremstå hvid. Hvis den stadig er gul/brun, gentages vasken, indtil en hvid pellet er nået.
    BEMÆRK: Bakterier, der forbliver på æggene, kan forurene de dsRNA-udtrykkende bakterier.
  16. Fjern det meste af supernatanten, så der er ca. 200 μL. Synkroniserede æg kan bruges til RNAi-skærme.

4. Fælles fænotypiske analyser

  1. Dyrkning af dyr under forsøg
    1. Placer en dråbe ~ 30 æg tæt på bakteriel græsplæne i hver RNAi-seedet plade. Til reference skal du også placere ~ 30 æg på plader sået med tomme vektorholdige (L4440) bakterier.
    2. Dyr, der er synkroniseret på NGM RNAi-seedede plader. Forsøgets varighed afhænger af det stadium, hvor dyrene skal overvåges, og dyrkningstemperaturen. Juster dyrkningstemperaturen, når du bruger temperaturfølsomme mutantdyr. Juster dyrkningsvarigheden, når du bruger udviklingshæmmede mutantdyr.
      BEMÆRK: Mens timingen kan variere, når dyrene når voksenalderen, æglægning (og det deraf følgende hurtige fødevareforbrug), samt aldersafhængig proteostsis sammenbrud28, kan påvirke resultaterne. Det anbefales således at score dyr før æglægningens begyndelse (dag 1 i voksenalderen). Vilde dyr når dette stadium efter 4,5 dage ved 15 °C, 3 dage ved 20 °C eller 2 dage ved 25 °C.
    3. Antallet af anvendte gentagelser vil afhænge af størrelsen af det undersøgte gensæt. For chaperone biblioteket (97 gener), gentag eksperimenter mindst fire gange. Befolkningens størrelse afhænger af den anvendte analyse. I de adfærdsmæssige analyser, der diskuteres her, score >15 dyr pr. forsøgstilstand i hver gentagelse. Data og statistiske analyser afhænger også i høj grad af den anvendte analysetype. Data i de analyser, der diskuteres her, kan præsenteres som middel ± SEM.
    4. Sammenlign de RNAi- og tomme vektorkontrolbehandlede dyr som uafhængige populationer. P-værdier kan beregnes ved hjælp af envejs- eller tovejs ANOVA, afhængigt af de undersøgte ændringer, nemlig skærpende eller lindre alene eller begge dele. Ved undersøgelse af en enkelt RNAi behandling vs kontrol, P værdier kan beregnes ved hjælp af envejs eller to-vejs Mann-Whitney rang sum test. Bortset fra statistisk signifikans, overveje en tærskel for hits baseret på graden af indvirkning på fænotypen.
  2. Udviklingsmæssig anholdelse/forsinkelse
    1. Dyr, der er synkroniseret i alderen, dyrkes som i trin 4.1, indtil dyr, der dyrkes på tomme vektorholdige kontrolbakterier, når voksenalderen, men før æglægningen starter.
    2. Overvåg dyr ved hjælp af et stereomikroskop og tælle antallet af larver og voksne for at score procentdelen af udviklingshæmmede dyr. Som reference, sammenlign med mutant dyr dyrket på tomme vektor-holdige kontrolbakterier. hsp-1 eller hsp-90 RNAi behandling resulterer i udviklingsmæssig anholdelse af vilde dyr og kan bruges som en positiv kontrol.
    3. For at score procentdelen af udviklingshæmmede dyr over tid skal du gentage trin 4.2.2.
      BEMÆRK: Hvis der er æglæggende voksne på pladen, overføres de udviklingshæmmede dyr til en ny NGM-RNAi-plade mærket til det samme målgen for at undgå forveksling med afkom.
  3. Sterilitets- eller æglægningsfejl
    1. Dyr, der er synkroniseret i alderen, dyrkes som i trin 4.1, indtil dyr, der dyrkes på tomme vektorkontrolbakterier, begynder at lægge æg.
    2. Overvåg dyr ved hjælp af et stereomikroskop og score procentdelen af dyr uden synlige æg i deres livmoder. Som reference, sammenlign med mutant dyr dyrket på tomme vektor-kontrol bakterier.
    3. Alternativt overvåge dyr ved hjælp af et stereomikroskop og score den procentdel af dyr med en livmoder fuld af æg, defineret som EGg Laying defekt (Egl-d) fænotype29.
  4. Embryonal dødelighed
    1. Dyrisk synkroniseret som i trin 4.1, indtil dyrene begynder at lægge æg.
    2. Overfør ~ 100 æg til en tom plade. Spred æggene i rækker for at forenkle optællingen.
    3. Score procent af unhatched æg på pladen efter 24-48 timer. Til reference sammenlignes med æg af dyr behandlet med tomme vektorkontrolbakterier.
  5. Lammelse assay
    1. For dag 1 voksne, dyrke alderssynkroniseret dyr som i trin 4.1, indtil dyr dyrket på tomme vektor-kontrol bakterier nå voksenalderen, men før æglægning starter.
    2. Tegn en linje på bagsiden af en almindelig NGM agar plade ved hjælp af en fin markør.
    3. Placer 5-10 dyr på den markerede linje.
    4. Indstil en timer og vent i 10 min.
    5. Score den procentdel af dyr, der er tilbage på linjen som lammede orme. Som reference, sammenlign med mutant dyr dyrket på tomme vektor-kontrol bakterier. Vilde dyr behandlet med UNC-45 RNAi viser alvorlig lammelse fænotype og kan bruges som en positiv kontrol.
      BEMÆRK: Denne analyse fremhæver dyr, der viser medium til svær lammelse. Sådanne dyr ligger normalt lige på pladen i stedet for at præsentere den fælles buede form. Desuden er et plaster ryddet af bakterier synlig omkring hovedet af lammede orme.
  6. Prygl assay
    1. Dyr, der er synkroniseret i alderen, som i trin 4.1, indtil dyr, der dyrkes på tomme vektorkontrolbakterier, når voksenalderen, men før æglægningen starter.
    2. Pipet 100 μL M9 buffer ved dyrenes dyrkningstemperatur i en 96-brønds plade.
    3. Placer ~ 15 orme, en pr brønd, i M9 buffer-holdige brønde.
    4. Lad dyrene justere i 5 min.
    5. Undersøg hvert dyr under stereomikroskopet, start en timer, der tæller 15 s ned, og tæl antallet af kropsbøjninger, som hvert dyr udfører i dette tidsrum. De optalte værdier kan normaliseres til kropsbøjninger pr. minut. Som reference, sammenlign med mutant dyr dyrket på tomme vektor-kontrol bakterier.
      BEMÆRK: Denne motilitet assay er meget følsom og kan opdage meget milde forskelle mellem behandlinger. Motilitet i væske og motilitet på agar kan dog variere.

5. Validering af protein knockdown

  1. Placer 250-300 synkroniserede æg på en 60 mm NGM-RNAi plade sået med de relevante dsRNA-udtrykkende eller tomme vektorholdige (L4440) bakterier.
    BEMÆRK: RNAi knockdown kan resultere i afvigende ophobning af embryoner, i mangel på embryoner eller i udviklingsmæssige anholdelse, der kan påvirke genekspression. Dette bør overvejes ved fastsættelsen af alderen på de dyr, der skal undersøges.
  2. For voksne dag 1 dyrkes dyr i 4,5 dage ved 15 °C, 3 dage ved 20 °C eller 2 dage ved 25 °C.
  3. Pluk og overfør i alt 200 voksne unge dyr til hætten på en 1,5 mL tubefyld med 200 μL PBS-T.
    BEMÆRK: Når du bruger temperaturfølsomme dyr eller chaperone mutanter, er det bedst at opretholde de buffere, der anvendes i protokollen ved dyrenes dyrkningstemperatur.
  4. Luk hætten forsigtigt og centrifugen ved 1.000 x g i 1 min.
  5. Der tilsættes 800 μL PBS-T (tabel 1) og centrifuge ved 1.000 x g i 1 min.
  6. Fjern forsigtigt de øverste 900 μL.
  7. Gentag trin 5.4-5.6 tre gange.
  8. Fjern 900 μL, hvilket efterlader 100 μL opløsning, der indeholder de 200 orme.
  9. Der tilsættes 25 μL 5x prøvebuffer (tabel 1).
  10. Prøverne opvarmes i 10 min ved 92 °C, mens de ryster ved 1000 omdrejninger. Prøverne kan derefter fryses og opbevares ved -20 °C.
  11. Læg 20 μL af hver prøve og kør på en SDS-PAGE gel.
  12. Udfør western blot analyse ved hjælp af passende antistoffer til at bestemme den relative stabilitet af proteinet.
  13. Bestem intensiteten af de bånd, der bruger densitometrisk software, f.eks. Normaliser alle værdier til dem, der måles i kontroleksemplet(e).
    BEMÆRK: Formålet med RNAi knockdown i vores skærme er at sænke proteinindholdet i en bestemt chaperone / co-chaperone. Således er den bedste måde at vurdere effektiviteten af RNAi knockdown er ved western blot analyse. Dette kræver specifikke antistoffer. Alternativt kan qPCR bruges til at kvantificere mRNA-niveauer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brug af temperaturfølsomme mutationer i UNC-45 til at screene for at forværre eller lindre interaktioner under henholdsvis eftergivende eller restriktive forhold
Muskel samling og vedligeholdelse tilbyder et effektivt system til at studere vævsspecifikke chaperone interaktioner. Den funktionelle enhed af kontraktile muskler, sarkomen, præsenterer en krystallinsk-lignende arrangement af strukturelle og lovgivningsmæssige proteiner. Stabiliteten af motorprotein myosin og dets indarbejdelse i de tykke filamenter af kontraktile muskelsarkkomer afhænger af samarbejde mellem chaperoner og UPS-komponenter30. Et eksempel på en sådan chaperone er den bevarede og specialiserede myosin chaperone UNC-45, der hovedsageligt udtrykkes i kroppens vægmuskel31,32,33,34,35. Mutationer i UNC-45 har vist sig at fremkalde myosin uorganisering og alvorlige motilitetsfejl i C. elegans31,36. UNC-45 tandem moduler samles i en multi-site docking platform37, der håndhæver samarbejdet mellem UNC-45, HSP-90 og HSP-1 og sandsynligvis andre chaperones og co-chaperones i myosin glødetråd samling25,36,37,38. For at bekræfte kendte UNC-45 interaktioner og identificere nye genetiske interaktioner i muskelproostase, etablerede vi en strategi ved hjælp af C. elegans temperaturfølsomme unc-45 mutationer som en sensibiliseret genetisk baggrund for vævsspecifik chaperoneinteraktionsscreening19,25.

Enkelt aminosyresubstitutioner i C. elegans UNC-45 (L822F og E781K, svarende til henholdsvis e286 og m94 alleler; unc-45(ts)) er ansvarlige for temperaturafhængige motilitetsfejl og myosin-uorganiseringsnnotyper, når berørte dyr dyrkes under restriktive forhold (>22 °C). I modsætning hertil viser disse unc-45(ts) mutanter ingen bevægelse eller myosin organisation fejl ved den eftergivende temperatur (15 °C)31. I den foreslåede fremgangsmåde blev alderssynkroniseret unc-45(e286) dyr i det første larvestadium (L1) udtømt af forskellige molekylære chaperoner af RNAi (97 gener) og derefter overvåget for motilitetsfejl under eftergivende forhold (15 °C) (figur 1). Vi bekræftede den kendte interaktion mellem UNC-45 og HSP-90 proteiner i vores genetiske interaktioner skærm og identificeret tre hsp-90 co-chaperones, sti-1, ahsa-1, og daf-41, som specifikt forårsager en syntetisk bevægelse defekt i unc-45 (ts) mutant dyr, men ikke i vilde dyr25. Vi fortsatte med at undersøge, om sti-1-, ahsa-1- eller daf-41-associeredesyntetiske fænotyper var forårsaget af myosin uorganisering ved at overvåge det subcellulære arrangement af myosin tung kæde A (MYO-3), ved hjælp af etablerede immunfarvningsteknikker39. Mens behandling af vilde dyr med sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi ikke påvirkede myofilament organisation, udtømning af disse gener i unc-45(e286) mutant dyr resulterede i fuldstændig forstyrrelse af sarkomiske strukturer og MYO-3 fejllocalization, selv under eftergivende forhold (15 °C). Denne effekt kunne sammenlignes med det, der blev set med unc-45(e286) enkeltmutanter, der blev dyrket ved den restriktive temperatur (25 °C)25. Disse resultater blev bekræftet ved hjælp af en anden unc-45(ts)-allel, nemlig unc-45(m94) mutant dyr25.

For at identificere chaperoner, der destabiliserer UNC-45, screenede vi næste gang for chaperoner, der forbedrede motiliteten hos unc-45 (286) dyr ved 25 °C, afhængig af gen knockdown af RNAi. Mens unc-45(e286) mutant dyr udviste alvorlige bevægelsesfejl ved 25 °C, blev motiliteten hos dyr, der blev behandlet med RNAi, mod gener, der kodede fire af de 97 chaperoner, der blev screenet, væsentligt forbedret. Også her blev resultaterne bekræftet ved hjælp af unc-45 (m94) mutant dyr. Således giver brugen af temperaturfølsomme mutationer mulighed for at etablere både skærpende og lindre skærme, afhængigt af den temperatur, hvor skærmen udføres.

Brug af vævsspecifikt overudtryk af en anstandsdame til at screene for at forværre interaktioner
Vi næste udnyttet væv-specifikke over-udtryk for en enkelt anstandsdame som en mild forstyrrelse af muskel chaperone netværk til screening formål. Specifikt brugte vi dyr over-udtrykke vilde type dnj-24, kodning af C. elegans homolog af Hsp40 protein DNAJB6 i C. elegans kropsvæg muskel (DNJ-24M). Som ovenfor blev L1 DNJ-24M dyr behandlet med RNAi for forskellige chaperoner og overvåget for motilitetsfejl (20 °C) (figur 1). Mens DNJ-24M dyr viste ingen bemærkelsesværdige motilitet defekter, tre gener (af de 48 chaperone-kodning gener undersøgt, 6%), nemlig hsp-1, rme-8, og dnj-8, specifikt påvirket motilitet DNJ-24M-udtrykkende dyr, men ikke vilde type dyr. Det er bemærket, at test af specificiteten af de hits, der anvendes dyr over-udtrykke en anden chaperone, nemlig HSP-90, i muskel (HSP90M), viste ingen effekt på HSP90M motilitet på hsp-1, rme-8,eller dnj-8 RNAi behandling40. Samlet set resulterede screeningsplatformen, der anvender mild forstyrrelse til chaperonenetværket, såsom ekspression af metastable mutantproteiner eller vævsspecifikt overudtryk, i en meget specifik hitrate (normalt ~ 5%).

Brug af vævsspecifik RNAi til at screene for vævsspecifikke genetiske interaktioner
Vævsspecifikke RNAi-følsomme stammer giver mulighed for vævsspecifik knockdown af gener, mens du stadig bruger bakteriel fodring til dsRNA-levering. Disse stammer er mutant for RDE-1 argonaute protein, en vigtig komponent i RNAi vej kræves for effektiv genhæmning21. Men udtrykke vilde type RDE-1 under kontrol af en vævsspecifik promotor førte til effektiv væv-specifikke gen knockdown41,42. Dette værktøj giver således mulighed for genetiske interaktion skærme uden at bruge vævsspecifikke chaperoner, såsom UNC-45 eller DNAJ-24M. For eksempel resulterede hsp-6 (mortalin) knockdown hos vilde dyr under udvikling i en stærk udviklingsarrest (96±1% af de RNAi-behandlede dyr). Samtidig, hsp-6 knockdown i en stamme, der udtrykker vilde type RDE-1 i muskel ikke forårsage udviklingsmæssige anholdelse, mens udtrykke vilde type RDE-1 i tarmceller resulterede i en stærk udviklingsmæssig anholdelse fænotype (90±3%; Figur 2. Således er HSP-6 funktion i tarmceller nødvendig for normal udvikling. En mutation i hsp-6(mg585), der forårsager en mild vækstforsinkelse, kan derfor bruges til at screene for at forværre eller lindre chaperoneinteraktioner ved at krydse det muterede gen til en tarmspecifik RNAi-stamme og screening af chaperone RNAi-biblioteket.

Overvågning af aldersafhængige ændringer i foldemiljøet ved hjælp af genetiske interaktioner
Dyr viser et aldersafhængigt fald i motilitet, der er forbundet med sarkomisk uorganisering43,44,45. Ændringer i protein folde kapacitet falder sammen med ændret regulering og sammensætning af cellulære proteostase maskiner28, herunder ændrede niveauer af UNC-45, CHN-1, og UFD-2, proteiner i muskel kvalitetskontrol maskiner46. Efter aftale påvirkes myosinfoldning og nedbrydning af ændringer i proteostatisk kapacitet ved overgangen til voksenalderen47. Vi spurgte derfor, om sådanne ændringer kunne påvirke chaperone interaktioner. For eksempel overvågede vi virkningen af sti-1, ahsa-1 og DAF-41 knockdown på motilitet over tid. Vi fandt ud af, at selvom sti-1- ahsa - 1- og daf - 41 -RNAi behandlede dyr viste reduceret motilitet under larveudvikling, faldt motiliteten stærkt i unc-45 (ts) voksne orme. Desuden myo-3 organisation i unc-45 (ts) mutant dyr behandlet med sti-1, ahsa-1 eller DAF-41 RNAi svarede til den af vilde type orme på fjerde larve fase (L4), selv om mutanter udstillet forstyrret sarkomer efter dyrene nåede voksenalderen (Figur 3). I modsætning hertil forblev både unc-45(ts) mutantdyr, der blev behandlet med en tom vektorkontrol og vilde dyr, upåvirket (figur 3). Således kan proteostase dynamik som en funktion af alder eller miljøforhold27,45,46,48,49 kritisk påvirke chaperone interaktioner.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af RNAi syntetiske interaktion skærme ved hjælp af C. elegans transporterer en mutation i et gen kodning en anstandsdame af interesse. (A) Skematisk repræsentation af den grundlæggende opsætning af målrettede chaperoneinteraktionsskærme. (B) Hit validering kræver bekræftelse af den genetiske interaktion ved hjælp af en anden chaperone mutant, samt validere specificering af RNAi knockdown. (C-D) Simple udlæsninger, såsom motilitetsfejl, kan kvantificeres for at bestemme skærpende eller lindre interaktioner, ved hjælp af lammelse eller prygl assays, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Vævsspecifik RNAi af mitokondrie chaperone hsp-6 kan bruges til at undersøge genetiske interaktioner i ét væv. Vilde type tarm- og muskel-specifikke RNAi stammer blev behandlet med hsp-6 RNAi og (A)udviklingsmæssige forsinkelse blev scoret eller (B)billeder blev taget på den første dag i voksenalderen. Data er gennemsnitlige ± SEM, N=6. Skalalinjen er 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Aldersafhængige virkninger af RNAi. (A) Motilitet med alderen. Vilde eller unc-45(e286) embryoner blev placeret på sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi-seedede plader ved 15 °C og scorede for motilitet ved hjælp af en prygl assay på hvert udviklingsstadium, L1-L4, ung voksen og dag 1 af voksenalderen. Data er gennemsnitlige ± SEM, N=15. (B) Confocal billeder af kroppen væg muskel. Dyr blev behandlet som i A og fastgjort på L4, ung voksen og dag 1 i voksenalderen faser og immun-plettet med anti-MYO-3 antistoffer. Skalalinjen er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Opløsning Forberedelsesinstruktioner Oplagring
1 M CaCl2 (1 L) Tilsæt 147,01 g CaCl2·2H2O Butik hos RT
Tilføj dH2O til 1 L
Autoklave eller filter (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6,0 (1 L) Tilføj 136,09 g KH2PO4 Butik hos RT
Tilføj 800 mL dH2O
Bland ved hjælp af magnetisk omrører, indtil den er opløst
Titrere pH ved hjælp af KOH
Tilføj dH2O til 1 L
Autoklave eller filter (0,22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) Tilsættes 248,58 g MgSO4·7H2O Butik hos RT
Tilføj dH2O til 1 L
Autoklave eller filter (0,22 μm)
Kolesterolopløsning (50 mL) Tilføj 250 mg kolesterol til en 50 mL Falcon rør Opbevar ved -20 °C
Opløses helt i 40 mL ethanol
Tilsæt ethanol til 50 mL
1 M IPTG (50 mL) Tilsæt 11,9 g IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) til et 50 mL Falcon rør Opbevar i mørke ved -20 °C
Opløses helt i 40 mL dH2O
Tilføj dH2O til 50 mL
Filter (0,22 μm), aliquot 1mL rør
Ampicillin lager (50 mL) Tilsæt 5 g ampicillin til et 50 mL Falcon rør Opbevar ved -20 °C
Opløses helt i 40 mL dH2O
Tilføj dH2O til 50 mL
Filter (0,22 μm), fordel 1 mL aliquot i Eppendorf rør
Tetracyklinbestand (50 mL) Tilsæt 250 mg tetracyklin til et 50 mL Falcon rør Opbevar ved -20 °C
Opløses helt i 40 mL ethanol
Tilsæt ethanol til 50 mL
Aliquot 1 mL rør
M9 buffer (1 L) Tilføj 5,8 g Na2HPO4·7H2O Butik hos RT
Tilføj 3 g KH2PO4
Tilføj 5 g NaCl
Tilsættes 0,25 g MgSO4·7H2O
Tilføj dH2O til 1 L
Filter (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 L) Tilføj 8 g NaCl Butik hos RT
Tilsæt 200 mg KCl
Tilføj 1,44 g Na2HPO4·7H2O
Tilføj 240 mg KH2PO4
Opløses helt i 800 mL dH2O
Titrere pH ved hjælp af KOH tp pH 7,4
Tilsæt 500 μL Tween-20
Tilføj dH2O til 1 L
5x eksempelbuffer Tilføj 6,8 mL dH2O Opbevar ved -20 °C
Tilføj 2 mL 0,5 M Tris pH 6,8
Tilsæt 3,2 mL Glycerol
Tilføj 1,6 mL 20% SDS
Tilføj 0,8 mL ß-mercaptoethanol
1% bromophenol blå

Tabel 1: Løsning Opskrifter

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et integreret billede af proteostasenetværket, der afspejler, hvordan det er organiseret og fungerer i forskellige metazoceller og væv, mangler stadig. For at løse denne mangel kræves der specifikke oplysninger om samspillet mellem forskellige komponenter i dette netværk, såsom molekylære chaperoner, i specifikke væv i løbet af udvikling og aldring. Her viste vi, hvordan brugen af vævsspecifikke forstyrrelser gjorde det muligt for os at undersøge chaperonenetværket i et givet væv. For at udforske vævsspecifikke chaperone genetiske interaktioner, tre forskellige tilgange blev overvejet. I den første tilgang, UNC-45, en anstandsdame, der er stærkt udtrykt i muskelceller, blev brugt til at screene for chaperone interaktioner via fodring-RNAi25. Mens brugen af en specialiseret chaperone giver mulighed for kræsne vævsspecifikitet, kan det kun rapportere om det meget fokuserede undernetværk, som det bidrager til. Bemærk, at de fleste C. elegans neuroner er resistente over for fodring-baserede RNAi levering50 og dermed bruge denne tilgang til at identificere genetiske interaktioner i neuronale celler kræver at krydse mutant chaperone undersøgt med en RNAi-forbedret stamme51. I en anden tilgang, en vævsspecifik promotor blev brugt til at drive over-udtryk for en anstandsdame i musklen og dermed specifikt påvirke muskel folde miljø40. Men over-udtrykke en enkelt chaperone kunne være generelt gavnligt for folde miljø og dermed maske forstyrrelser forårsaget af de to chaperoner sammen. Den tredje tilgang var baseret på vævsspecifik RNAi knockdown for at undersøge chaperoneinteraktioner i en given væv41. En fordel ved denne tilgang er, at det giver mulighed for at målrette neuronale celler, der er resistente over for RNAi levering via fodring42. Stadig, denne tilgang kræver brug af en mild mutant (men ikke specialiseret), samt at denne mutant krydses ind i en rde-1 null mutant transporterer et vævsspecifik rde-1 redningsgen. Vigtigere, disse tilgange kan kombineres for potentielt at modulere chaperone funktion i et enkelt væv eller endda en enkelt celle.

Kvalitetskontrol maskiner kan påvirke funktionen af mange genprodukter ved at forstyrre proteostase. Dette er en stor udfordring, når du bruger genetiske interaktioner til at udforske kvalitetskontrolnetværket18. For eksempel resulterede kronisk udtryk for aggregeringstruede proteiner eller proteostasekollaps i aldring i fænotypisk forværring af mange ikke-relaterede metastable proteiner i C. elegans og gær45,52,53. Desuden blev clathrin-medieret endokytose i pattedyrceller hæmmet ved funktionel binding af Hsc70 til proteinaggregater. Alligevel blev det vist, at endokytose kunne reddes af Hsc70 over-udtryk, mens sammenlægning ikke kunne54,55. Ligeledes identificerede en genetisk skærm i Drosophila designet til at afdække regulatorer af varmechokresponset en missense-mutation i flyvemuskelhandlingen, der konstituerende aktiverede varmechokresponset56. Samlet set kan forstyrrelser af proteostasenetværket udsætte metastable proteiner eller fremkalde stress, der kan påvirke resultatspecifikiteten. Ikke desto mindre kan analyse af genetiske interaktioner give meget specifik og funktionel indsigt. For eksempel identificerede epistatiske analyser af gærgener, der kræves til foldning i endoplasmisk reticulum, specifikke genetiske interaktioner mellem molekylære chaperoner, der efterfølgende blev valideret19. Ligeledes identificerede en skærpende skærm for chaperoner, der forbedrer toksiciteten af to aggregeringstruede modeller (målt ved motilitet) en bestemt delmængde på 18 chaperoner, ortologer, hvoraf påvirkede Huntingtin-sammenlægningen i menneskelige celler26. Her viste vi, at forskellige forstyrrelser af proteostasenetværket kan afdække specifikke og funktionelle chaperoneinteraktioner.

Den største fordel ved at bruge RNAi fodringsbaserede genetiske interaktionsskærme er metodens relative enkelhed. Selv anvender en generel adfærdsmæssige output, såsom motilitet, kan afsløre nye genetiske interaktioner (Figur 3). Men variabilitet og delvise virkninger af udtryk knockdown kan begrænse robustheden og specificiteten af resultaterne57. Desuden er genetiske interaktioner ikke tegn på fysiske interaktioner, og forholdet mellem to gener kan således være indirekte. At udforske interaktionernes art og kassere ikke-specifikke interaktioner kan være tidskrævende57,58,59. Dette er en bekymring, der skal løses i skærmopsætningen og valideringen. For eksempel, ved hjælp af null alleler i genetisk screening giver mulighed for at afgøre, om disse gener fungerer i de samme eller forskellige veje i en given biologisk proces. Ved hjælp af delvis tab af genfunktion resulterer hypomorfe alleler, såsom temperaturfølsomme alleler, eller RNAi-afhængig down-regulering af udtryk, i resterende aktiviteter, der kan give skærpende eller lindre fænotyper, uanset om generne virker i samme eller i parallelle veje59. Således kræver karakteren af enhver interaktion yderligere analyse. Men ved hjælp af hypomorfe alleler og RNAi kunne identificere en bred vifte af interactorer, herunder gener i samme protein kompleks eller vej eller i en redundant vej59. Mens dette større omfang af mulige interaktioner kan give flere hits i en genetisk skærm, kan det også føre til ikke-specifikke interaktioner, såsom for eksempel den ikke-specifikke eksponering af temperaturfølsomme alleler i proteostase kollaps45,53.

Hit validering og ikke-specifikke interaktioner kan undersøges på flere måder. Antallet af hits skal være lavt. For eksempel, down-regulering af chaperone udtryk i en unc-45 mutant baggrund resulterede i en lille procentdel af hits (4%), med de fleste chaperone gen down-regulering ikke viser nogen effekt på motilitet. En lignende sats blev observeret, da DNJ-24M var over-udtrykt (6%). Som nævnt ovenfor identificerede en skærm for chaperoneinteraktioner med aggregeringstruede proteiner 18 chaperoner på 219 screenet (8%).

Der bør anvendes flere mutant alleler, overudtrykslinjer eller sygdomsmodeller. Brugen af forskellige mutant alleler, der har forskellige virkninger på chaperone funktion, samt forskellige stammer med forskellige genetiske baggrunde, kan støtte specificiteten af enhver skærm hits. Alternativt kan brug af mutation eller overudtryk af en anden chaperone, der ikke fører til lignende forstyrrelse, tjene som en negativ kontrol. For eksempel viste både unc-45(e286) og unc-45(m94) skærpende adfærd, når sti-1, ahsa-1 eller daf-41 var nedreguleret. Desuden blev en lignende interaktion observeret, når dyr, der bærer ahsa-1(ok3501) sletning mutant blev behandlet med hsp-90 RNAi25.

Chaperonehits identiteten og deres kendte interaktioner bør undersøges. For eksempel er chaperoner, der er identificeret i en unc-45 skærpende skærm, et meget specifikt sæt chaperoner, der kræves til HSP-90 ATPase-cyklussen, herunder dem, der kodning af en klientrekruttering (STI-1), en ombygning af co-chaperone (AHSA-1) og en klientmodning co-chaperone (DAF-41). Faktisk danner dette sæt co-chaperones en komplet HSP-90 foldecyklus60. Ligeledes identificerede en DNJ-24M-skærm HSP-1, den vigtigste chaperone partner i Hsp40s40.

Ændringer i interaktioner i dyrets levetid bør også undersøges. For eksempel, chaperones identificeret i unc-45 skærpende skærm stærkt påvirket motilitet og myosin organisation i voksenalderen, men havde en mildere effekt under udviklingen. Dette kan skyldes ændringer i proteostase netværk i voksenalderen28 eller ændringer i myosin folde krav mellem myo-fiber foldning og vedligeholdelse.

Brug komplementære biokemiske tilgange til direkte at undersøge interaktioner mellem proteinerne, samt deres lokalisering i cellen. For eksempel er HSP-90 co-chaperones, STI-1, AHSA-1 og DAF-41 lokaliseret til sarkomet, hvor de interagerer med myosin25.

C. elegans er en veletableret metazo model til overvågning af kvalitetskontrol. Det bruges ofte til at overvåge cellulære og organisme proteostase ved hjælp af en variabel værktøjskasse af cellebiologi, biokemiske og genetiske tilgange. Her anvendte vi genetiske screeningsmetoder og tilgængelige værktøjer57,58,59, såsom en mutant bank, tilgængelige RNAi biblioteker22,23 og vævsspecifikke RNAi stammer41,42, til at overvåge chaperone interaktioner i et levende dyr under udvikling og aldring. Brugen af enkle adfærdsmæssige assays, såsom motilitet, forenkle skærmen af mange mulige genpar til at udforske nye genetiske interaktioner. Dette kan derefter tjene som en platform til yderligere at udforske chaperone lokalisering og fysiske interaktioner ved hjælp af biokemiske værktøjer til mekanistisk studere deres potentielle interaktioner in vivo og in vitro. Protokollen beskrevet her er blevet brugt til at identificere nye chaperone interaktioner i C. elegans krop væg muskel25,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Caenorhabditis Genetics Center, finansieret af NIH National Center for Research Resources (NCRR), for nogle af nematode stammer. Monoklonale antistoffer udviklet af H.F. Epstein blev fremstillet fra Developmental Studies Hybridoma Bank udviklet i regi af NICHD og vedligeholdt af Department of Biology, University of Iowa. Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Israel Science Foundation (bevilling nr. 278/18) og af et tilskud fra Israels ministerium for videnskab og teknologi og udenrigsministeriet og internationalt samarbejde, Generaldirektoratet for Landefremme, Den Italienske Republik (tilskud nr. 3-14337). Vi takker medlemmer af Ben-Zvi laboratoriet for hjælp til at forberede dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Biologi Caenorhabditis elegans chaperone genetiske interaktioner proteostase RNAi skærm temperaturfølsomme
Brug <em>caenorhabditis elegans</em> til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter