Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

För att studera interaktioner mellan förkläde och förkläde- och förkläde- och substrat utför vi syntetiska interaktionsskärmar i Caenorhabditis elegans med hjälp av RNA-interferens i kombination med milda mutationer eller överuttryck av förkläden och övervakar vävnadsspecifik proteindysfunktion på organismnivå.

Abstract

Korrekt vikning och montering av proteiner och proteinkomplex är avgörande för cellulär funktion. Celler använder kvalitetskontrollvägar som korrigerar, spärrar eller eliminerar skadade proteiner för att upprätthålla en hälsosam proteom, vilket säkerställer cellulär proteostas och förhindrar ytterligare proteinskador. På grund av överflödiga funktioner inom proteostasis nätverket, screening för detekterbara fenotyper med hjälp av knockdown eller mutationer i förkläde-kodning gener i multicellular organism Caenorhabditis elegans resulterar i upptäckt av mindre eller inga fenotyper i de flesta fall. Vi har utvecklat en riktad screeningstrategi för att identifiera förkläden som krävs för en specifik funktion och därmed överbrygga klyftan mellan fenotyp och funktion. Specifikt övervakar vi nya förkläde interaktioner med RNAi syntetiska interaktionsskärmar, knock-down förkläde uttryck, en förkläde i taget, hos djur som bär en mutation i en förkläde-kodning gen eller över uttrycker ett förkläde av intresse. Genom att störa två förkläden som individuellt inte presenterar någon grov fenotyp, kan vi identifiera förkläden som förvärrar eller exponerar en specifik fenotyp när båda störs. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera specifika uppsättningar av förkläden som fungerar tillsammans för att modulera vikning av ett protein eller proteinkomplex i samband med en given fenotyp.

Introduction

Celler hanterar proteinskador genom att använda kvalitetskontrollmaskiner som reparerar, spärrar eller tar bort skadade proteiner1,2. Vikning och montering av proteinkomplex stöds av molekylära förkläde, en mångfaldig grupp mycket bevarade proteiner som kan reparera eller binda skadade proteiner3,4,5,6,7. Avlägsnandet av skadade proteiner förmedlas av ubiquitin-proteasomsystemet (UPS)8 eller av autofagimaskineriet9 i samarbete med förkläde10,11,12. Proteinhomeostas (proteostas) upprätthålls därför av kvalitetskontrollnätverk som består av viknings- och nedbrytningsmaskiner3,13. Att förstå interaktionerna mellan de olika komponenterna i proteostasisnätverket in vivo är dock en stor utmaning. Medan proteinproteininteraktionsskärmar bidrar med viktig information om fysiska interaktioner och förklädekomplex14,15, saknas förståelse för organisationen och kompensatoriska mekanismer inom vävnadsspecifika förklädenätverk in vivo.

Genetiska interaktioner används ofta som ett kraftfullt verktyg för att undersöka förhållandet mellan par av gener som är involverade i vanliga eller kompensatoriska biologiskavägar 16,17,18. Sådana relationer kan mätas genom att kombinera par mutationer och kvantifiera effekten av en mutation i en gen på den fenotypiska svårighetsgraden orsakad av en mutation i den andragenen 16. Medan de flesta sådana kombinationer inte visar någon effekt när det gäller fenotyp, vissa genetiska interaktioner kan antingen förvärra eller lindra svårighetsgraden av den uppmätta fenotypen. Försvårande mutationer observeras när fenotypen av dubbel borttagning mutant är allvarligare än den förväntade fenotyp sett vid kombinera den enda borttagning mutanter, vilket innebär att de två generna fungerar i parallella vägar, tillsammans påverkar en given funktion. Däremot observeras lindrande mutationer när fenotypen av den dubbla borttagningsmutanten är mindre allvarlig än fenotypen som ses med de enda borttagningsmutanterna, vilket innebär att de två generna fungerar tillsammans som ett komplex eller deltar i samma väg16,18. Följaktligen har olika fenotyper som kan kvantifieras, inklusive breda fenotyper, såsom dödlighet, tillväxthastigheter och kullstorlek, liksom specifika fenotyper, såsom transkriptionella reportrar, använts för att identifiera genetiska interaktioner. Till exempel förlitade sig Jonikas et al. på en ER stressreporter för att undersöka interaktioner mellan Saccharomyces cerevisiae ER utvecklat proteinsvar proteostasnätverk med hjälp av parvisa genborttagningsanalyser19.

Genetiska interaktionsskärmar innebär systematiskt korsning parvis borttagning mutationer för att generera en omfattande uppsättning dubbla mutanter20. Men i djurmodeller, och specifikt i C. elegans, är detta storskaliga tillvägagångssätt inte genomförbart. Istället kan mutanta stammar testas för sina genetiska interaktionsmönster genom att nedreglera genuttrycket med hjälp av RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans är ett kraftfullt system för skärmar baserade på RNAi22,23. I C. elegansuppnås dubbelsträngad RNA (dsRNA) leverans genom bakteriell utfodring, vilket leder till spridning av dsRNA-molekyler till många vävnader. På detta sätt påverkar de introducerade dsRNA-molekylerna djuret via ett snabbt och enkelt förfarande21. En genetisk interaktionsskärm med RNAi kan därför avslöja effekten av att nedreglera en uppsättning gener eller de flesta C. eleganskodande gener med hjälp av RNAi-bibliotek24. I en sådan skärm, träffar som påverkar beteendet hos mutanten av intresse men inte den vilda typen stam är potentiella modifierare av fenotyp övervakas25. Här tillämpar vi en kombination av mutationer och RNAi screening för att systematiskt kartlägga vävnadsspecifika förklädesinteraktioner i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av nematod tillväxtmedieplattor för RNAi

  1. Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar och destillerat vatten upp till 1 L och autoklav på en 1 L-flaska.
  2. Kyl flaskan till 55 °C.
  3. Tillsätt 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4och 1 ml kolesterollösning(tabell 1)för att göra nematodtillväxtmedia (NGM).
  4. Tillsätt 1 ml ampicillin (100 mg/ml) och 0,5 ml 1 M IPTG(tabell 1)för att göra NGM-RNAi-lösningen.
    OBS: Vanliga HT115(DE3) E. coli bakterier innehåller en IPTG-inducible T7 DNA-polymeras som används för att uttrycka dsRNA-kodning plasmider. Dessa plasmider kodar också för ampicillinresistens.
  5. Blanda den varma lösningen genom att virvla flaskan.
  6. Häll NGM-lösningen i plattor eller använd en peristaltisk pump i huven eller använd sterila procedurer och dela ut lösningen i plattor. Använd 6-brunns, 12-brunns, 40 mm eller 60 mm plattor för denna skärm. Agar ska fylla ca 2/3 av plåtdjupet.
  7. Låt plattorna torka över natten på bänken vid rumstemperatur och håll plattorna täckta. NGM-plattor för RNAi kan förvaras vid 4 °C i upp till en månad.

2. Odla RNAi-bakterier och så plattorna

  1. I huven eller med sterila ingrepp, tillsätt 1 ml ampicillin (100 mg/ml) och 2,5 ml tetracyklin (5 mg/ml)(tabell 1)till en för autoklaverad 1 L LB-lösning och blandning.
    OBS: Vanliga HT115(DE3) E. coli bakterier är tetracyklinresistenta.
  2. I huven eller med sterila procedurer, tillsätt 600 μL LB-lösning till varje brunn i 2 ml djupa 96-brunns sterila plattor. Det är bäst att använda en flerkanalsrör för att dela ut mediet.
  3. Med sterila ingrepp, inokulera brunnar med HT115(DE3) E. coli bakterier omvandlas med en dsRNA-kodning plasmid som riktar sig mot en gen av intresse eller en tom plasmid, som en kontroll. Täck plattorna och inkubera vid 37 °C över natten. Bibliotek som består av bakteriella kloner som uttrycker dsRNA, motsvarande ~94% av de förväntade C. elegansgenerna konstrueradestidigare 22,23 och är kommersiellt tillgängliga. Förklädebiblioteket som används här byggdes av Dr. Richard Morimoto laboratorium26.
  4. Använd sterila procedurer, frö 75, 150 eller 250 μL bakterier på 12-brunns-, 40 mm- respektive 6-brunns- respektive 60 mm NGM RNAi-plattorna. Markera tydligt namnet på målgenen på plattan. Bakterier bör täcka 30-50% av agarytan och bör inte röra kanterna på plattan.
  5. Låt plattorna torka i minst 2 dagar på bänken vid rumstemperatur och håll plattorna täckta.
    OBS: Plattor kan inkuberas vid 37 °C över natten. Se till att de inre brunnarna är torra innan du använder eller förvarar plattorna. För alla långsiktiga ändamål (dvs. torkning eller förvaring) förvarar du plattorna i mörker. Torkade, sådda plattor kan förvaras vid 4 °C i upp till en månad.

3. Icke-stressig synkronisering av embryon

  1. Använd en maskplockning för att flytta cirka 100 ägg från en osynkroniserad maskplatta till en nysådd NGM-platta.
  2. Odla djur i 5 dagar vid 15 °C, 3,5 dagar vid 20 °C eller 2,5 dagar vid 25 °C. Djur bör nå den första dagen av äggläggning.
    OBS: Maskar odlas ofta vid 20 °C. Olika förkläde mutanta stammar kan dock kräva specifika odlingstemperaturer. Till exempel odlas många temperaturkänsliga stammar vid 15 °C men flyttas till 25 °C för att exponera sin fenotyp.
  3. Tillsätt 1 ml M9-buffert (tabell 1) långsamt och bort från bakteriegräsmattan. Rotera plattan så att bufferten helt täcker plattan. Luta den sedan åt sidan och ta bort vätskan från plattan och tvätta djuren från plattan.
    OBS: Vid användning av temperaturkänsliga djur eller förklädesmutanter är det bäst att upprätthålla de buffertar som används i protokollet vid djurens odlingstemperatur.
  4. Upprepa steg 3.3 tre gånger eller tills alla djur tvättas bort från plattan.
  5. Använd en vanlig plastspets, skär en kvadrat av agar från den tvättade plattan där ägg är koncentrerade och placera agarbiten på en nysådd NGM-platta.
    OBS: ~ 200 ägg krävs för att producera tillräckligt med äggläggande djur; för många djur konsumerar bakterierna för snabbt. Låga matnivåer kan påverka proteostas27.
  6. Odla djuren i 5 dagar vid 15 °C, 3,5 dagar vid 20 °C eller 2,5 dagar vid 25 °C. Vid denna tidpunkt bör plattorna täckas med synkroniserade ägg.
    OBS: Djur kan flyttas till en ny tallrik under en kort tid för en strängare synkronisering. Det är dock viktigt att endast använda vuxna i de tidiga stadierna av äggläggning eftersom djur kan behålla ägg i livmodern som påverkar synkroniseringen.
  7. Tillsätt 1 ml M9-buffert långsamt och bort från bakteriegräsmattan.
  8. Rotera plattan så att bufferten helt täcker plattan. Luta den sedan åt sidan och ta bort vätskan från plattan och tvätta djuren från plattan.
  9. Upprepa steg 3.7 tre gånger eller tills alla djur tvättas bort från plattan.
  10. Tillsätt 1 ml M9-buffert och använd en cellskrapa för att frigöra äggen från plattan.
  11. Samla upp M9-bufferten som innehåller äggen från plattorna.
  12. Centrifugera M9-bufferten som innehåller äggen vid 3 000 x g i 2 minuter.
  13. Ta bort supernaten och tillsätt M9-bufferten för att nå en volym på 1 ml.
  14. Återanvänd äggen för att störa eventuella bitar av ägg och bakterier.
  15. Upprepa tvättproceduren som beskrivs i steg 3.11-3.13 fem gånger. Äggpelleten ska verka vit. Om den fortfarande är gul/brun, upprepa tvätten tills en vit pellet har uppnåtts.
    OBS: Bakterier som finns kvar på äggen kan förorena de dsRNA-uttrycksbakterier.
  16. Ta bort det mesta av supernatanten, vilket lämnar ca 200 μL. Synkroniserade ägg kan användas för RNAi-skärmar.

4. Vanliga fenotypiska analyser

  1. Odling av djur under försök
    1. Placera en droppe på ~ 30 ägg nära bakteriegräsmattan i varje RNAi-sådd tallrik. Som referens, placera också ~ 30 ägg på tallrikar sådda med tomma vektorinnehållande (L4440) bakterier.
    2. Odla ålderssynkronerade djur på NGM RNAi-sådda tallrikar. Försökets varaktighet beror på i vilket skede djuren ska övervakas och odlingstemperaturen. Justera odlingstemperaturen vid användning av temperaturkänsliga mutantdjur. Justera odlingstiden vid användning av utvecklingsmässigt fördröjda mutantdjur.
      OBS: Även om timingen kan variera, när djur når vuxen ålder, kan äggläggning (och den resulterande snabba matkonsumtionen), liksom åldersberoende proteostsiskollaps28, påverka resultaten. Det rekommenderas därför att poängdjur före början av äggläggning (dag 1 av vuxenlivet). Vilda djur når detta stadium efter 4,5 dagar vid 15 °C, 3 dagar vid 20 °C eller 2 dagar vid 25 °C.
    3. Antalet upprepningar som används beror på storleken på den undersökta genuppsättningen. För förklädebiblioteket (97 gener) upprepa experiment minst fyra gånger. Befolkningens storlek beror på vilken analys som används. I de beteendemässiga analyser som diskuteras här, poäng >15 djur per experimentellt tillstånd i varje upprepning. Data och statistiska analyser beror också starkt på vilken typ av analys som används. Data i de analyser som diskuteras här kan presenteras som medel ± SEM.
    4. Jämför RNAi- och tomma vektorkontrollbehandlade djur som oberoende populationer. P-värden kan beräknas med enkel- eller dubbelvägs-ANOVA, beroende på de undersökta förändringarna, nämligen att förvärra eller lindra ensam eller båda. Vid undersökning av en enda RNAi-behandling kontra kontroll kan P-värden beräknas med hjälp av ettvägs- eller tvåvägs Mann-Whitney rank sum-test. Förutom statistisk signifikans, överväga en tröskel för träffar baserat på graden av inverkan på fenotypen.
  2. Utvecklingsarrest/försening
    1. Odla ålderssynkronerade djur som i steg 4.1 tills djur som odlas på tomma vektorinnehållande kontrollbakterier når vuxen ålder men innan äggläggningen börjar.
    2. Övervaka djur som använder ett stereomikroskop och räkna antalet larver och vuxna för att få procent av utvecklingsfördröjda djur. Som referens, jämför med mutanta djur som odlas på tomma vektorinnehållande kontrollbakterier. hsp-1 eller hsp-90 RNAi behandling resulterar i utvecklingsmässiga gripande av vilda djur och kan användas som en positiv kontroll.
    3. Upprepa steg 4.2.2 för att få procent av utvecklingsfördröjda djur över tid.
      OBS: Om det finns äggläggande vuxna på plattan, överför de utvecklingsfördröjda djuren till en ny NGM-RNAi-platta märkt för samma målgen för att undvika förväxling med avkomma.
  3. Sterilitet eller äggläggningsdefekter
    1. Odla ålderssynkronerade djur som i steg 4.1 tills djur som odlas på tomma vektorkontrollbakterier börjar lägga ägg.
    2. Övervaka djur som använder ett stereomikroskop och få procent av djur utan synliga ägg i livmodern. Som referens, jämför med mutanta djur som odlas på tomma vektorkontrollbakterier.
    3. Övervaka alternativt djur som använder ett stereomikroskop och poäng procent av djur med en livmoder full av ägg, definierat som EGg Laying defekt (Egl-d) fenotyp29.
  4. Embryonal dödlighet
    1. Odla ålderssynkronerade djur som i steg 4.1 tills djuren börjar lägga ägg.
    2. Överför ~100 ägg till en tom tallrik. Sprid äggen i rader för att förenkla räkningen.
    3. Poäng procent av ouppnåeade ägg på tallriken efter 24-48 timmar. Som referens, jämför med ägg från djur som behandlats med tomma vektorkontrollbakterier.
  5. Förlamningsanalys
    1. För vuxna dag 1, odla ålderssynkronerade djur som i steg 4.1 tills djur som odlas på tomma vektorkontrollbakterier når vuxen ålder men innan äggläggningen börjar.
    2. Rita en linje på baksidan av en vanlig NGM-agarplatta med en fin markör.
    3. Placera 5-10 djur på den markerade linjen.
    4. Ställ in en timer och vänta i 10 min.
    5. Poäng procent av djur som förblir på linjen som förlamade maskar. Som referens, jämför med mutanta djur som odlas på tomma vektorkontrollbakterier. Vilda djur behandlade med unc-45 RNAi visar svår förlamning fenotyp och kan användas som en positiv kontroll.
      OBS: Denna analys belyser djur som visar medelhög till svår förlamning. Sådana djur ligger vanligtvis rakt på plattan, snarare än att presentera den gemensamma böjda formen. Dessutom är ett plåster rensat av bakterier synligt runt huvudet på förlamade maskar.
  6. Thrashing analys
    1. Odla ålderssynkronerade djur som i steg 4.1 tills djur som odlas på tomma vektorkontrollbakterier når vuxen ålder men innan äggläggningen börjar.
    2. Rör 100 μL M9-buffert vid djurens odlingstemperatur till en 96-brunnsplatta.
    3. Placera ~15 maskar, en per brunn, i M9-bufferthaltiga brunnar.
    4. Låt djuren anpassa sig i 5 minuter.
    5. Undersök varje djur under stereomikroskopet, starta en timer som räknar ner 15 s och räkna antalet kroppsböjar varje djur utför under den tidsspannet. De räknade värdena kan normaliseras till kroppskuränder per minut. Som referens, jämför med mutanta djur som odlas på tomma vektorkontrollbakterier.
      OBS: Denna motilitetsanalys är mycket känslig och kan upptäcka mycket milda skillnader mellan behandlingarna. Motilitet i vätska och motilitet på agar kan dock skilja sig åt.

5. Validering av proteinnedslag

  1. Placera 250-300 synkroniserade ägg på en 60 mm NGM-RNAi-platta sådd med relevanta dsRNA-uttryck eller tomma vektorinnehållande (L4440) bakterier.
    OBS: RNAi knockdown kan resultera i avvikande ackumulering av embryon, i brist på embryon eller i utvecklingsmässiga gripande som kan påverka genuttryck. Detta bör beaktas vid fastställandet av åldern på de djur som ska undersökas.
  2. För vuxna dag 1 odla djur i 4,5 dagar vid 15 °C, 3 dagar vid 20 °C eller 2 dagar vid 25 °C.
  3. Plocka och överför totalt 200 unga vuxna djur till locket på en 1,5 ml rörfyllning med 200 μL PBS-T.
    OBS: Vid användning av temperaturkänsliga djur eller förklädesmutanter är det bäst att upprätthålla de buffertar som används i protokollet vid djurens odlingstemperatur.
  4. Stäng locket försiktigt och centrifug på 1 000 x g i 1 min.
  5. Tillsätt 800 μL PBS-T(tabell 1)och centrifugera vid 1 000 x g i 1 minut.
  6. Ta försiktigt bort toppen 900 μL.
  7. Upprepa steg 5.4-5.6 tre gånger.
  8. Ta bort 900 μL och lämna 100 μL lösning som innehåller de 200 maskarna.
  9. Tillsätt 25 μL 5x provbuffert (tabell 1).
  10. Värm proverna i 10 min vid 92°C medan du skakar vid 1000 varv/min. Proverna kan sedan frysas och förvaras vid -20 °C.
  11. Ladda 20 μL av varje prov och kör på en SDS-PAGE-gel.
  12. Utför western blot-analys med lämpliga antikroppar för att bestämma proteinens relativa stabilitet.
  13. Bestäm intensiteten hos banden med hjälp av densitometrisk programvara, till exempel den fritt tillgängliga ImageJ-gelmodulen. Normalisera alla värden till de värden som mäts i kontrollproverna.
    OBS: Syftet med RNAi knockdown i våra skärmar är att sänka proteinnivåerna i ett specifikt förkläde / co-chaperone. Således är det bästa sättet att bedöma effektiviteten av RNAi knockdown genom western blot analys. Detta kräver specifika antikroppar. Alternativt kan qPCR användas för att kvantifiera mRNA-nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använda temperaturkänsliga mutationer i UNC-45 för att screena för att förvärra eller lindra interaktioner under tillåtande eller restriktiva förhållanden
Muskelmontering och underhåll erbjuder ett effektivt system för att studera vävnadsspecifika förkläde interaktioner. Den funktionella enheten av kontraktila muskler, sarkom, presenterar ett kristallint-liknande arrangemang av strukturella och reglerande proteiner. Stabiliteten hos motorproteinet myosin och dess införlivande i de tjocka filamenten av kontraktila muskel sarkomeres beror på samarbete mellan förkläde och UPS komponenter30. Ett exempel på ett sådant förkläde är det bevarade och specialiserade myosinförklädet UNC-45 som huvudsakligen uttrycks i kroppsväggsmuskeln31,32,33,34,35. Mutationer i UNC-45 har visat sig inducera myosin oorganisering och allvarliga motility defekter i C. elegans31,36. UNC-45 tandemmoduler monteras i en dockningsplattform för flera platser37 som upprätthåller samarbete mellan UNC-45, HSP-90 och HSP-1 och sannolikt andra förkläde och co-chaperones i myosinglödtrådsenheten25,36,37,38. För att bekräfta kända UNC-45 interaktioner och identifiera nya genetiska interaktioner i muskel proteostas, etablerade vi en strategi med C. elegans temperaturkänsliga unc-45 mutationer som en sensibiliserad genetisk bakgrund för vävnadsspecifik förkläde interaktion screening19,25.

Enstaka aminosyraersättning i C. elegans UNC-45 (L822F och E781K, motsvarande e286 respektive m94-allelerna; unc-45(ts) ansvarar för temperaturberoende motilitetsdefekter och myosin-oorganiserings fenotyper när drabbade djur odlas under restriktiva förhållanden (>22 °C). Däremot visar dessa unc-45(ts) mutanter ingen rörelse eller myosin organisation defekter vid den tillåtande temperaturen (15 °C)31. I det föreslagna tillvägagångssättet utarmades ålderssynkronerade unc-45(e286) djur vid det första larvstadiet (L1) av olika molekylära förkläde av RNAi (97 gener) och övervakades sedan för motilitetsdefekter under tillåtande förhållanden (15 °C) (figur 1). Vi bekräftade den kända interaktionen mellan UNC-45 och HSP-90 proteiner i vår genetiska interaktioner skärm och identifierade tre hsp-90 co-chaperones, sti-1, ahsa-1 och daf-41, som specifikt orsakar en syntetisk rörelse defekt i unc-45(ts) mutant djur men inte i vilda djur25. Vi fortsatte med att undersöka om sti-1-, ahsa-1- eller daf-41-associerade syntetiska fenotyper orsakades av myosin oorganisering genom att övervaka subcellulära arrangemanget av myosin tunga kedjan A (MYO-3), med hjälp av etablerade immun-färgning tekniker39. Behandling av vilda djur med sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi påverkade inte myofilament organisation, utarmning av dessa gener i unc-45 (e286) mutanta djur resulterade i fullständig störning av sarkomiska strukturer och MYO-3 fellokalisering, även under tillåtande villkor (15 °C). Denna effekt var jämförbar med vad som sågs med unc-45(e286) enstaka mutanter odlade vid den restriktiva temperaturen (25 °C)25. Dessa resultat bekräftades med hjälp av en annan unc-45(ts)-allel, nämligen unc-45(m94) mutant djur25.

För att identifiera förkläde som destabiliserar UNC-45, screenade vi nästa förkläde som förbättrade motiliteten hos unc-45(286) djur vid 25 °C, förlita sig på gen knockdown av RNAi. Medan unc-45(e286) mutanta djur uppvisade allvarliga rörelsedefekter vid 25 °C, förbättrades motiliteten hos djur som behandlats med RNAi mot gener som kodar fyra av de 97 förkläde som screenades avsevärt. Även här bekräftades resultaten med hjälp av o-45(m94) mutanta djur. Användningen av temperaturkänsliga mutationer gör det således möjligt att fastställa både försvårande och lindrande skärmar, beroende på temperaturen vid vilken skärmen utförs.

Använda vävnadsspecifikt överuttryck av ett förkläde för att screena för att förvärra interaktioner
Vi använde nästa användning vävnad-specifika överuttryck av en enda förkläde som en mild störning av muskelförkläde nätverket för screening ändamål. Specifikt använde vi djur över-uttrycka vilda typ dnj-24, kodning C. elegans homolog av Hsp40 protein DNAJB6 i C. elegans kroppsväggmuskeln (DNJ-24M). Som ovan behandlades L1 DNJ-24M djur med RNAi för olika förkläde och övervakades för motilitetsdefekter (20 °C) (Figur 1). Medan DNJ-24M djur visade inga anmärkningsvärda motilitet defekter, tre gener (av de 48 förkläde-kodning gener undersökt; 6%), nämligen hsp-1, rme-8, och dnj-8, specifikt påverkade motility av DNJ-24M-uttrycker djur men inte vilda typ djur. Det är anmärkningsvärt att testning av särdragen hos träffarna med djur som över uttrycker ett annat förkläde, nämligen HSP-90, i muskler (HSP90M), visade ingen effekt på HSP90M motilitet vid hsp-1, rme-8, eller dnj-8 RNAi behandling40. Sammantaget resulterade screeningplattformen, som använder mild störning till förklädesnätverket, såsom uttryck för metastaserbara mutantproteiner eller vävnadsspecifikt överuttryck, i en mycket specifik träfffrekvens (normalt ~ 5%).

Använda vävnadsspecifik RNAi för att screena för vävnadsspecifika genetiska interaktioner
Vävnadsspecifika RNAi-känsliga stammar möjliggör vävnadsspecifik knockdown av gener samtidigt som bakteriell utfodring för dsRNA-leverans används. Dessa stammar är mutanta för RDE-1 argonaute protein, en viktig komponent i RNAi-vägen som krävs för effektiv gensilencing21. Att uttrycka vild typ RDE-1 under kontroll av en vävnadsspecifik promotor ledde dock till effektiv vävnadsspecifik genknackning41,42. Detta verktyg möjliggör således genetiska interaktionsskärmar utan att använda vävnadsspecifika förkläde, såsom UNC-45 eller DNAJ-24M. Till exempel resulterade hsp-6 (mortalin) knockdown hos vilda djur under utveckling i ett starkt utvecklingsarrest (96±1% av de RNAi-behandlade djuren). Samtidigt orsakade hsp-6 knockdown i en stam som uttrycker vilda typ RDE-1 i muskel inte utvecklingsmässiga gripande, medan uttrycker vilda typ RDE-1 i intestinala celler resulterade i en stark utvecklingsmässiga gripande fenotyp (90±3%. Figur 2). Således krävs HSP-6-funktion i tarmceller för normal utveckling. En mutation i hsp-6(mg585) som orsakar en mild tillväxtfördröjning kan därför användas för att screena för att förvärra eller lindra förkläde interaktioner genom att korsa den muterade genen i en intestinal-specifik RNAi stam och screening förkläde RNAi biblioteket.

Övervakning av åldersberoende förändringar i vikmiljön med hjälp av genetiska interaktioner
Djur visar en åldersberoende minskning av motilitet som är förknippad med sarkomisk oorganisering43,44,45. Förändringar i proteinvikningskapaciteten sammanfaller med förändrad reglering och sammansättning av cellulära proteostasmaskiner28, inklusive ändrade nivåer av UNC-45, CHN-1 och UFD-2, proteiner i muskelkvalitetskontrollmaskineriet46. I samförstånd påverkas myosinvikning och nedbrytning av förändringar i proteostatisk kapacitet vid övergången till vuxen ålder47. Vi frågade därför om sådana förändringar kunde påverka förklädesinteraktioner. Till exempel övervakade vi effekten av sti-1, ahsa-1 och daf-41 knockdown på motility över tid. Vi fann att även om sti-1-, ahsa-1- och daf-41-RNAi behandlade djur visade minskad rörlighet under larv utveckling, minskade motility starkt i unc-45(ts) vuxna maskar. Dessutom liknade MYO-3-organisationen hos icke-45(ts) mutanta djur som behandlades med sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi den hos vilda maskar i det fjärde larvstadiet (L4), även om mutanterna uppvisade störda sarkomer efter att djuren nått vuxen ålder (figur 3). Däremot förblev båda de icke-45(ts) muterade djuren behandlade med en tom vektorkontroll och vilda djur opåverkade (figur 3). Således kan proteostasdynamik som en funktion av ålder eller miljöförhållanden27,45,46,48,49 kritiskt påverka förklädeinteraktioner.

Figure 1
Figur 1: Installation av syntetiska RNAi-interaktionsskärmar med C. elegans som bär en mutation i en gen som kodar ett förkläde av intresse. (A) Schematisk representation av den grundläggande inställningen av riktade förkläde interaktionsskärmar. (B) Träffvalidering kräver bekräftelse av den genetiska interaktionen med hjälp av en annan förklädesmutant, samt validerar angivandet av RNAi-knockdown. (C-D) Enkla avläsningar, såsom motilitetsdefekter, kan kvantifieras för att bestämma försvårande eller lindrande interaktioner, med hjälp av förlamning respektive thrashing analyser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Vävnadsspecifik RNAi av mitokondriellt förkläde hsp-6 kan användas för att undersöka genetiska interaktioner i en vävnad. Vilda typ tarm- och muskelspecifika RNAi stammar behandlades med hsp-6 RNAi och (A) utvecklingsmässiga dröjsmål gjordes eller (B) bilder togs på den första dagen av vuxen ålder. Data är genomsnittliga ± SEM, N=6. Skalstrecket är 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Åldersberoende effekter av RNAi. Motilitetmed åldern. Vilda eller unc-45(e286) embryon placerades på sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi-sådda plattor vid 15 °C och poängsattes för motilitet med hjälp av en thrashing analys i varje utvecklingsstadium, L1-L4, ung vuxen och dag 1 av vuxen ålder. Data är genomsnittliga ± SEM, N=15. (B) Konfokala bilder av kroppsväggsmuskeln. Djur behandlades som i A och fastställdes vid L4, ung vuxen och dag 1 av vuxen ålder stadier och immuno-stained med anti-MYO-3 antikroppar. Skalbaren är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lösning Instruktioner för förberedelse Lagring
1 M CaCl2 (1 L) Lägg till 147,01 g CaCl2·2H2O Butik på RT
Lägg till dH2O till 1 L
Autoklav eller filter (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6,0 (1 L) Lägg till 136,09 g KH2PO4 Butik på RT
Tillsätt 800 ml dH2O
Blanda med magnetomrörare tills den är upplöst
Titrera pH med KOH
Lägg till dH2O till 1 L
Autoklav eller filter (0,22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) Tillsätt 248,58 g MgSO4·7H2O Butik på RT
Lägg till dH2O till 1 L
Autoklav eller filter (0,22 μm)
Kolesterollösning (50 ml) Tillsätt 250 mg kolesterol till ett 50 ml Falcon-rör Förvaras vid -20 °C
Lös upp helt i 40 ml etanol
Tillsätt etanol till 50 ml
1 M IPTG (50 ml) Tillsätt 11,9 g IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) till ett 50 ml Falcon-rör Förvara i mörkret vid -20 °C
Lös upp helt i 40 ml dH2O
Lägg till dH2O till 50 ml
Filter (0,22 μm), alikvot 1mL rör
Ampicillin lager (50 ml) Tillsätt 5 g ampicillin till ett Falcon-rör på 50 ml Förvaras vid -20 °C
Lös upp helt i 40 ml dH2O
Lägg till dH2O till 50 ml
Filter (0,22 μm), fördela 1 ml alikvot i Eppendorfrör
Tetracyklinlager (50 ml) Tillsätt 250 mg tetracyklin till ett Falcon-rör på 50 ml Förvaras vid -20 °C
Lös upp helt i 40 ml etanol
Tillsätt etanol till 50 ml
Aliquot 1 ml rör
M9 buffert (1 L) Lägg till 5,8 g Na2HPO4·7H2O Butik på RT
Lägg till 3 g KH2PO4
Lägg till 5 g NaCl
Tillsätt 0,25 g MgSO4·7H2O
Lägg till dH2O till 1 L
Filter (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 L) Lägg till 8 g NaCl Butik på RT
Tillsätt 200 mg KCl
Tillsätt 1,44 g Na2HPO4·7H2O
Tillsätt 240 mg KH2PO4
Lös upp helt i 800 ml dH2O
Titrera pH med KOH tp pH 7.4
Tillsätt 500 μL interpolering-20
Lägg till dH2O till 1 L
5x provbuffert Tillsätt 6,8 ml dH2O Förvaras vid -20 °C
Tillsätt 2 ml 0,5 M Tris pH 6,8
Tillsätt 3,2 ml glycerol
Lägg till 1,6 ml 20 % SDS
Tillsätt 0,8 ml ß-mercaptoethanol
1% bromophenol blå

Tabell 1: Lösningsrecept

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En integrerad bild av proteostasnätverket som återspeglar hur det är organiserat och fungerar i olika metazoiska celler och vävnader saknas fortfarande. För att ta itu med denna brist krävs specifik information om interaktioner mellan olika komponenter i detta nätverk, såsom molekylära förkläde, i specifika vävnader under utveckling och åldrande. Här visade vi hur användningen av vävnadsspecifika problem gjorde det möjligt för oss att undersöka förkläde nätverket i en given vävnad. För att utforska vävnadsspecifika förkläde genetiska interaktioner övervägdes tre olika metoder. I det första tillvägagångssättet, UNC-45, användes ett förkläde som är starkt uttryckt i muskelceller, för att screena för förkläde interaktioner via utfodring-RNAi25. Medan användningen av ett specialiserat förkläde möjliggör kräsen vävnadsspecifikitet, kan det bara rapportera om det mycket fokuserade undernätverket som det bidrar till. Observera att de flesta C. elegans-nervceller är resistenta mot utfodringsbaserad RNAi-leverans50 och därmed använder detta tillvägagångssätt för att identifiera genetiska interaktioner i neuronala celler kräver att man korsar det mutanta förklädet som undersöks med en RNAi-förbättradstam 51. I ett andra tillvägagångssätt användes en vävnadsspecifik promotor för att driva överuttryck av ett förkläde i muskler och därmed specifikt påverka muskelvikningsmiljön40. Att överrep uttrycka ett enda förkläde kan dock i allmänhet vara fördelaktigt för den vikbara miljön och därmed maskera störningar som orsakas av de två förklädena tillsammans. Det tredje tillvägagångssättet förlitade sig på vävnadsspecifik RNAi knockdown för att undersöka förkläde interaktioner i en givenvävnad 41. En fördel med detta tillvägagångssätt är att det möjliggör inriktning på neuronala celler som är resistenta mot RNAi-leverans via utfodring42. Fortfarande kräver detta tillvägagångssätt användningen av en mild mutant (även om den inte är specialiserad), liksom att denna mutant korsas till en rde-1 null mutant som bär en vävnadsspecifik rde-1 räddningsgen. Viktigt är att dessa metoder kan kombineras för att potentiellt modulera förkläde funktion i en enda vävnad eller till och med en enda cell.

Kvalitetskontrollmaskineriet kan påverka funktionen hos många genprodukter genom att stör proteostas. Detta är en stor utmaning när man använder genetiska interaktioner för att utforska kvalitetskontrollnätverket18. Till exempel resulterade kroniskt uttryck av aggregeringsbenägna proteiner eller proteostaskollaps i åldrande i fenotypisk försämring av många icke-relaterade metastaserbara proteiner i C. elegans och jäst45,52,53. Dessutom hämmades clathrin-medierad endocytos i däggdjur celler vid funktionella bindning av Hsc70 till protein aggregat. Ändå visades det att endocytos kunde räddas av Hsc70 överuttryck, medan aggregering intekunde 54,55. På samma sätt identifierade en genetisk skärm i Drosophila utformad för att avslöja regulatorer av värmechocksvaret en missense mutation i flygmuskeln aktin som konstitutivt aktiverade värmechocksvaret56. Sammantaget kan oro av proteostasnätverket exponera metastaserbara proteiner eller inducera stress som kan påverka resultatets specificitet. Att analysera genetiska interaktioner kan dock ge mycket specifik och funktionell insikt. Till exempel identifierade epistatiska analyser av jästgener som krävs för vikning i det endoplasmatiska retikulum specifika genetiska interaktioner mellan molekylära förkläde som senare validerades19. På samma sätt identifierade en försvårande skärm för förkläde som förbättrar toxiciteten hos två aggregeringsbenägna modeller (mätt med motilitet) en specifik delmängd av 18 förkläde, vars ortologer påverkade Huntingtin-aggregering i mänskliga celler26. Här visade vi att olika ningar av proteostasnätverket kan avslöja specifika och funktionella förkläde interaktioner.

Den största fördelen med att använda RNAi-matningsbaserade genetiska interaktionsskärmar är metodens relativa enkelhet. Även om man använder en allmän beteendemässig produktion, såsom motilitet, kan man avslöja nya genetiska interaktioner (figur 3). Variation och partiella effekter av uttrycksknackning kan dock begränsa robustheten och specificiteten hos resultaten57. Dessutom tyder genetiska interaktioner inte på fysiska interaktioner och förhållandet mellan två gener kan därför vara indirekt. Att utforska interaktionens natur och kassera icke-specifika interaktioner kan vara tidskrävande57,58,59. Detta är ett problem som måste åtgärdas i skärminställningarna och valideringen. Att använda null alleler i genetisk screening gör det till exempel möjligt att avgöra om dessa gener fungerar i samma eller distinkta vägar i en given biologisk process. Med hjälp av partiell förlust av genfunktion resulterar dock hypomorfa alleler, såsom temperaturkänsliga alleler, eller RNAi-beroende nedreglering av uttryck, i kvarvarande aktiviteter som kan ge förvärrande eller lindrande fenotyper, oavsett om generna verkar i samma eller parallellavägar 59. Således kräver arten av någon interaktion ytterligare analys. Men med hypomorfa alleler och RNAi kan identifiera ett brett spektrum av interactorer, inklusive gener i samma proteinkomplex eller väg eller i en redundant väg59. Medan detta större omfång av möjliga interaktioner kan ge fler träffar i en genetisk skärm, kan det också leda till icke-specifika interaktioner, till exempel den icke-specifika exponeringen av temperaturkänsliga alleler i proteostaskollaps45,53.

Träffvalidering och icke-specifika interaktioner kan undersökas på flera sätt. Antalet träffar bör vara lågt. Till exempel resulterade nedreglering av förkläde uttryck i en unc-45 mutant bakgrund i en liten andel träffar (4%), med de flesta förkläde gen nedreglering inte visar någon effekt på motility. En liknande frekvens observerades när DNJ-24M var överbetald (6%). Som nämnts ovan identifierade en skärm för förkläde interaktioner med aggregering-benägna proteiner 18 förkläde av 219 screenade (8%).

Flera mutanta alleler, överuttryckslinjer eller sjukdomsmodeller bör användas. Användningen av olika mutanta alleler som har olika effekter på förkläde funktion, liksom olika stammar med olika genetiska bakgrunder, kan stödja specificiteten hos alla skärmträffar. Alternativt kan användning av mutation eller överuttryck av ett annat förkläde som inte leder till liknande stör fungera som en negativ kontroll. Till exempel visade både unc-45(e286) och unc-45(m94) förvärrande beteende när sti-1, ahsa-1 eller daf-41 var nedreglerade. Dessutom observerades en liknande interaktion när djur som bar ahsa-1(ok3501) borttagning mutant behandlades med hsp-90 RNAi25.

Förklädesträffens identitet och deras kända interaktioner bör undersökas. Till exempel är förkläden som identifieras i en unc-45 försvårande skärm en mycket specifik uppsättning förkläden som krävs för HSP-90 ATPase-cykeln, inklusive de som kodar en klientrekryterare (STI-1), ett ombyggnadssamarskap (AHSA-1) och ett klientmognad co-chaperone (DAF-41). Faktum är att denna uppsättning co-chaperones bildar en komplett HSP-90 vikningscykel60. På samma sätt identifierade en DNJ-24M-skärm HSP-1, huvudförklädepartnern till Hsp40s40.

Förändringar i interaktioner under djurets livslängd bör också undersökas. Till exempel påverkade förkläde som identifierats i unc-45 försvårande skärm starkt motility och myosin organisation i vuxen ålder men hade en mildare effekt under utvecklingen. Detta kan bero på förändringar i proteostasnätverket i vuxen ålder28 eller på förändringar i myosinvikningskraven mellan myofibervikning och underhåll.

Använd kompletterande biokemiska metoder för att direkt undersöka interaktioner mellan proteinerna, liksom deras lokalisering i cellen. Till exempel är HSP-90 co-chaperones, STI-1, AHSA-1 och DAF-41, lokaliserade till sarkom där de interagerar med myosin25.

C. elegans är en väletablerad metazoanmodell för övervakning av kvalitetskontroll. Det används ofta för att övervaka cellulär och organismisk proteostas med hjälp av en variabel verktygslåda för cellbiologi, biokemiska och genetiska metoder. Här använde vi genetiska screeningmetoder och tillgängliga verktyg57,58,59, till exempel en mutantbank, tillgängliga RNAi-bibliotek22,23 och vävnadsspecifika RNAi-stammar41,42, för att övervaka förklädeinteraktioner i ett levande djur under utveckling och åldrande. Användningen av enkla beteendemässiga analyser, såsom motilitet, förenklar skärmen av många möjliga genpar för att utforska nya genetiska interaktioner. Detta kan sedan fungera som en plattform för att ytterligare utforska förklädeslokalisering och fysiska interaktioner med hjälp av biokemiska verktyg för att mekanistiskt studera deras potentiella interaktioner in vivo och in vitro. Protokollet som beskrivs här har framgångsrikt använts för att identifiera nya förkläde interaktioner i C. elegans kroppsvägg muskel25,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center, finansierat av NIH National Center for Research Resources (NCRR), för några av nematodstammarna. Monoklonala antikroppar utvecklade av H.F. Epstein erhölls från utvecklingsstudierna Hybridoma Bank utvecklades under beskydd av NICHD och underhålls av Institutionen för biologi, University of Iowa. Denna forskning stöddes av ett anslag från Israel Science Foundation (anslag nr 278/18) och av ett bidrag från Israels ministerium för vetenskap & teknik, och utrikesministeriet och det internationella samarbetet, GeneralDirektoratet för landbefordran, Italien (anslag nr 3-14337). Vi tackar medlemmar av Ben-Zvi-laboratoriet för hjälp med att förbereda detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Biologi Utgåva 160 Caenorhabditis elegans förkläde genetiska interaktioner proteostas RNAi skärm temperaturkänslig
Använda <em>Caenorhabditis elegans för</em> att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter