För att studera interaktioner mellan förkläde och förkläde- och förkläde- och substrat utför vi syntetiska interaktionsskärmar i Caenorhabditis elegans med hjälp av RNA-interferens i kombination med milda mutationer eller överuttryck av förkläden och övervakar vävnadsspecifik proteindysfunktion på organismnivå.
Korrekt vikning och montering av proteiner och proteinkomplex är avgörande för cellulär funktion. Celler använder kvalitetskontrollvägar som korrigerar, spärrar eller eliminerar skadade proteiner för att upprätthålla en hälsosam proteom, vilket säkerställer cellulär proteostas och förhindrar ytterligare proteinskador. På grund av överflödiga funktioner inom proteostasis nätverket, screening för detekterbara fenotyper med hjälp av knockdown eller mutationer i förkläde-kodning gener i multicellular organism Caenorhabditis elegans resulterar i upptäckt av mindre eller inga fenotyper i de flesta fall. Vi har utvecklat en riktad screeningstrategi för att identifiera förkläden som krävs för en specifik funktion och därmed överbrygga klyftan mellan fenotyp och funktion. Specifikt övervakar vi nya förkläde interaktioner med RNAi syntetiska interaktionsskärmar, knock-down förkläde uttryck, en förkläde i taget, hos djur som bär en mutation i en förkläde-kodning gen eller över uttrycker ett förkläde av intresse. Genom att störa två förkläden som individuellt inte presenterar någon grov fenotyp, kan vi identifiera förkläden som förvärrar eller exponerar en specifik fenotyp när båda störs. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera specifika uppsättningar av förkläden som fungerar tillsammans för att modulera vikning av ett protein eller proteinkomplex i samband med en given fenotyp.
Celler hanterar proteinskador genom att använda kvalitetskontrollmaskiner som reparerar, spärrar eller tar bort skadade proteiner1,2. Vikning och montering av proteinkomplex stöds av molekylära förkläde, en mångfaldig grupp mycket bevarade proteiner som kan reparera eller binda skadade proteiner3,4,5,6,7. Avlägsnandet av skadade proteiner förmedlas av ubiquitin-proteasomsystemet (UPS)8 eller av autofagimaskineriet9 i samarbete med förkläde10,11,12. Proteinhomeostas (proteostas) upprätthålls därför av kvalitetskontrollnätverk som består av viknings- och nedbrytningsmaskiner3,13. Att förstå interaktionerna mellan de olika komponenterna i proteostasisnätverket in vivo är dock en stor utmaning. Medan proteinproteininteraktionsskärmar bidrar med viktig information om fysiska interaktioner och förklädekomplex14,15, saknas förståelse för organisationen och kompensatoriska mekanismer inom vävnadsspecifika förklädenätverk in vivo.
Genetiska interaktioner används ofta som ett kraftfullt verktyg för att undersöka förhållandet mellan par av gener som är involverade i vanliga eller kompensatoriska biologiskavägar 16,17,18. Sådana relationer kan mätas genom att kombinera par mutationer och kvantifiera effekten av en mutation i en gen på den fenotypiska svårighetsgraden orsakad av en mutation i den andragenen 16. Medan de flesta sådana kombinationer inte visar någon effekt när det gäller fenotyp, vissa genetiska interaktioner kan antingen förvärra eller lindra svårighetsgraden av den uppmätta fenotypen. Försvårande mutationer observeras när fenotypen av dubbel borttagning mutant är allvarligare än den förväntade fenotyp sett vid kombinera den enda borttagning mutanter, vilket innebär att de två generna fungerar i parallella vägar, tillsammans påverkar en given funktion. Däremot observeras lindrande mutationer när fenotypen av den dubbla borttagningsmutanten är mindre allvarlig än fenotypen som ses med de enda borttagningsmutanterna, vilket innebär att de två generna fungerar tillsammans som ett komplex eller deltar i samma väg16,18. Följaktligen har olika fenotyper som kan kvantifieras, inklusive breda fenotyper, såsom dödlighet, tillväxthastigheter och kullstorlek, liksom specifika fenotyper, såsom transkriptionella reportrar, använts för att identifiera genetiska interaktioner. Till exempel förlitade sig Jonikas et al. på en ER stressreporter för att undersöka interaktioner mellan Saccharomyces cerevisiae ER utvecklat proteinsvar proteostasnätverk med hjälp av parvisa genborttagningsanalyser19.
Genetiska interaktionsskärmar innebär systematiskt korsning parvis borttagning mutationer för att generera en omfattande uppsättning dubbla mutanter20. Men i djurmodeller, och specifikt i C. elegans, är detta storskaliga tillvägagångssätt inte genomförbart. Istället kan mutanta stammar testas för sina genetiska interaktionsmönster genom att nedreglera genuttrycket med hjälp av RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans är ett kraftfullt system för skärmar baserade på RNAi22,23. I C. elegansuppnås dubbelsträngad RNA (dsRNA) leverans genom bakteriell utfodring, vilket leder till spridning av dsRNA-molekyler till många vävnader. På detta sätt påverkar de introducerade dsRNA-molekylerna djuret via ett snabbt och enkelt förfarande21. En genetisk interaktionsskärm med RNAi kan därför avslöja effekten av att nedreglera en uppsättning gener eller de flesta C. eleganskodande gener med hjälp av RNAi-bibliotek24. I en sådan skärm, träffar som påverkar beteendet hos mutanten av intresse men inte den vilda typen stam är potentiella modifierare av fenotyp övervakas25. Här tillämpar vi en kombination av mutationer och RNAi screening för att systematiskt kartlägga vävnadsspecifika förklädesinteraktioner i C. elegans.
En integrerad bild av proteostasnätverket som återspeglar hur det är organiserat och fungerar i olika metazoiska celler och vävnader saknas fortfarande. För att ta itu med denna brist krävs specifik information om interaktioner mellan olika komponenter i detta nätverk, såsom molekylära förkläde, i specifika vävnader under utveckling och åldrande. Här visade vi hur användningen av vävnadsspecifika problem gjorde det möjligt för oss att undersöka förkläde nätverket i en given vävnad. För att utforsk…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center, finansierat av NIH National Center for Research Resources (NCRR), för några av nematodstammarna. Monoklonala antikroppar utvecklade av H.F. Epstein erhölls från utvecklingsstudierna Hybridoma Bank utvecklades under beskydd av NICHD och underhålls av Institutionen för biologi, University of Iowa. Denna forskning stöddes av ett anslag från Israel Science Foundation (anslag nr 278/18) och av ett bidrag från Israels ministerium för vetenskap & teknik, och utrikesministeriet och det internationella samarbetet, GeneralDirektoratet för landbefordran, Italien (anslag nr 3-14337). Vi tackar medlemmar av Ben-Zvi-laboratoriet för hjälp med att förbereda detta manuskript.
12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
Camera | Qimaging | q30548 | |
Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
Confocal | Leica | DM5500 | |
Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
Peptone | Merck | 61930705001730 | |
Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
RNAi Chaperone library | NA | NA | |
SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 |