Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

For å studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaksjoner, utfører vi syntetiske interaksjonsskjermer i Caenorhabditis elegans ved hjelp av RNA-interferens i kombinasjon med milde mutasjoner eller overuttrykk av anstander og overvåker vevsspesifikk proteindysfunksjon på organismenivå.

Abstract

Korrekt folding og montering av proteiner og proteinkomplekser er avgjørende for cellulær funksjon. Celler bruker kvalitetskontrollveier som korrigerer, fanger eller eliminerer skadede proteiner for å opprettholde et sunt proteom, og sikrer dermed cellulær proteostase og forhindrer ytterligere proteinskade. På grunn av redundante funksjoner i proteostasenettverket, screening for påvisbare fenotyper ved hjelp av knockdown eller mutasjoner i anstandskodingsgener i den multicellulære organismen Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning av mindre eller ingen fenotyper i de fleste tilfeller. Vi har utviklet en målrettet screeningstrategi for å identifisere anstander som kreves for en bestemt funksjon og dermed bygge bro mellom fenotype og funksjon. Spesielt overvåker vi nye anstandsinteraksjoner ved hjelp av RNAi syntetiske interaksjonsskjermer, knocking-down chaperone uttrykk, en anstand om gangen, hos dyr som bærer en mutasjon i et anstandskodingsgen eller over-uttrykker en anstand av interesse. Ved å forstyrre to anstander som individuelt ikke presenterer noen grov fenotype, kan vi identifisere anstander som forverrer eller eksponerer en bestemt fenotype når begge er forstyrret. Vi viser at denne tilnærmingen kan identifisere spesifikke sett med anstander som fungerer sammen for å modulere foldingen av et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en gitt fenotype.

Introduction

Celler takler proteinskader ved å bruke kvalitetskontrollmaskiner som reparerer, beslaglegger eller fjerner skadede proteiner1,2. Folding og montering av proteinkomplekser støttes av molekylære anstander, en mangfoldig gruppe svært konserverte proteiner som kan reparere eller sequester skadede proteiner3,4,5,6,7. Fjerning av skadede proteiner formidles av ubiquitin-proteasome systemet (UPS)8 eller av autofagi maskineri9 i samarbeid med chaperones10,11,12. Protein homeostase (proteostase) opprettholdes derfor av kvalitetskontrollnettverk som består av folde- og nedbrytningsmaskiner3,13. Det er imidlertid en stor utfordring å forstå samspillet mellom de ulike komponentene i proteostasenettverket in vivo. Mens proteinprotein interaksjonsskjermer bidrar med viktig informasjon om fysiske interaksjoner og anstandskomplekser14,15, mangler det å forstå organisasjonen og kompenserende mekanismer innen vevsspesifikke anstandsnettverk in vivo.

Genetiske interaksjoner brukes ofte som et kraftig verktøy for å undersøke forholdet mellom par gener som er involvert i vanlige eller kompenserende biologiske veier16,17,18. Slike forhold kan måles ved å kombinere par mutasjoner og kvantifisere virkningen av en mutasjon i ett gen på fenotypisk alvorlighetsgrad forårsaket av en mutasjon i det andre genet16. Mens de fleste slike kombinasjoner ikke viser noen effekt når det gjelder fenotype, kan noen genetiske interaksjoner enten forverre eller lindre alvorlighetsgraden av den målte fenotypen. Skjerpende mutasjoner observeres når fenotypen til den doble slettingsmutanten er mer alvorlig enn den forventede fenotypen sett ved å kombinere de enkle slettingsmutantene, noe som antyder at de to genene fungerer parallelt, sammen påvirker en gitt funksjon. Til sammenligning observeres lindrende mutasjoner når fenotypen til den doble slettingsmutanten er mindre alvorlig enn fenotypen sett med de enkelte slettingsmutantene, noe som antyder at de to genene fungerer sammen som et kompleks eller deltar i samme vei16,18. Følgelig har forskjellige fenotyper som kan kvantifiseres, inkludert brede fenotyper, som dødelighet, vekstrater og brødstørrelse, samt spesifikke fenotyper, som transkripsjonelle reportere, blitt brukt til å identifisere genetiske interaksjoner. For eksempel stolte Jonikas et al. på en ER stressreporter for å undersøke interaksjoner mellom Saccharomyces cerevisiae ER utfoldet proteinresponsproteostasenettverk ved hjelp av parvise genslettingsanalyser19.

Genetiske interaksjonsskjermer innebærer systematisk kryssing av parvis sletting av mutasjoner for å generere et omfattende sett med doble mutanter20. Men i dyremodeller, og spesielt i C. elegans, er denne store tilnærmingen ikke mulig. I stedet kan mutante stammer testes for deres genetiske interaksjonsmønstre ved å regulere genuttrykket ned ved hjelp av RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans er et kraftig system for skjermer basert på RNAi22,23. I C. elegansoppnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriell fôring, noe som fører til spredning av dsRNA-molekyler til mange vev. På denne måten påvirker de introduserte dsRNA-molekylene dyret via en rask og enkel prosedyre21. En genetisk interaksjonsskjerm ved hjelp av RNAi kan derfor avsløre virkningen av å regulere et sett med gener eller de fleste C. elegans-kodegener ved hjelp av RNAi-biblioteker24. I en slik skjerm, treff som påvirker oppførselen til mutanten av interesse, men ikke den ville typen belastning er potensielle modifikatorer av fenotypen som overvåkes25. Her bruker vi en kombinasjon av mutasjoner og RNAi screening for systematisk å kartlegge vevsspesifikke anstandsinteraksjoner i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av nematode vekstmedieplater for RNAi

  1. Til en 1 L flaske, tilsett 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar og destillert vann opp til 1 L og autoklav.
  2. Avkjøl flasken til 55 °C.
  3. Tilsett 25 ml 1 M KH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4og 1 ml kolesteroloppløsning (tabell 1) for å lage nematodevekstmedier (NGM).
  4. Tilsett 1 ml ampicillin (100 mg/ml) og 0,5 ml 1 M IPTG (tabell 1) for å lage NGM-RNAi-oppløsning.
    MERK: Ofte brukte HT115(DE3) E. coli-bakterier inneholder en IPTG-induserbar T7 DNA-polymerase som brukes til å uttrykke dsRNA-kodingsplasmider. Disse plasmidene koder også for ampicillinmotstand.
  5. Bland den varme løsningen ved å virvle flasken.
  6. I hetten eller ved hjelp av sterile prosedyrer, hell NGM-oppløsningen i plater eller bruk en peristaltisk pumpe, dispenser løsningen i plater. Bruk 6-brønns, 12-brønns, 40 mm eller 60 mm plater til denne skjermen. Agar skal fylle ca 2/3 av platedybden.
  7. La platene tørke over natten på benken ved romtemperatur, og hold platene dekket. NGM-plater for RNAi kan oppbevares ved 4 °C i opptil en måned.

2. Voksende RNAi bakterier og såing platene

  1. I hetten eller ved hjelp av sterile prosedyrer, tilsett 1 ml ampicillin (100 mg/ml) og 2,5 ml tetracyklin (5 mg/ml) (tabell 1) til en forhåndsautomatisert 1 L LB-oppløsning og blanding.
    MERK: Ofte brukte HT115(DE3) E. coli-bakterier er tetracyklinresistente.
  2. I hetten eller ved hjelp av sterile prosedyrer, tilsett 600 μL LB-oppløsning til hver brønn i 2 ml dype 96-brønns sterile plater. Det er best å bruke en flerkanals pipet for å dispensere mediet.
  3. Ved hjelp av sterile prosedyrer inokulerer du brønner med HT115(DE3) E. coli-bakterier forvandlet med en dsRNA-kodingsplasmid rettet mot et gen av interesse eller en tom plasmid, som en kontroll. Dekk platene og inkuber ved 37 °C over natten. Biblioteker som består av bakterielle kloner som uttrykker dsRNA, tilsvarende ~ 94% av anslåtte C. elegans gener ble tidligere konstruert22,23 og er kommersielt tilgjengelige. Chaperone biblioteket som ble brukt her ble bygget av Dr. Richard Morimoto laboratorium26.
  4. Ved hjelp av sterile prosedyrer, frø 75, 150 eller 250 μL bakterier på henholdsvis 12-brønns, 40 mm og 6-brønns eller 60 mm NGM RNAi-plater. Merk tydelig navnet på målgenet på platen. Bakterier bør dekke 30-50% av agaroverflaten og bør ikke berøre kantene på platen.
  5. La platene tørke i minst 2 dager på benken ved romtemperatur, og hold platene dekket.
    MERK: Plater kan inkuberes ved 37 °C over natten. Pass på at de indre brønnene er tørre før du bruker eller lagrer platene. For alle langsiktige formål (dvs. tørking eller lagring) hold platene i mørket. Tørkede frøplater kan lagres ved 4 °C i opptil en måned.

3. Ikke-stressende synkronisering av embryoer

  1. Bruk en ormplukking til å flytte rundt 100 egg fra en usynkronisert ormplate til en nyseedet NGM-plate.
  2. Dyrk dyr i 5 dager ved 15 °C, 3,5 dager ved 20 °C eller 2,5 dager ved 25 °C. Dyr bør nå den første dagen av egglegging.
    MERK: Ormer dyrkes ofte ved 20 °C. Imidlertid kan forskjellige anstandsmutantstammer kreve spesifikke dyrkingstemperaturer. For eksempel dyrkes mange temperaturfølsomme stammer ved 15 °C, men skiftes til 25 °C for å eksponere fenotypen.
  3. Tilsett 1 ml M9 buffer (Tabell 1) langsomt og borte fra bakteriell plen. Roter platen slik at bufferen dekker platen helt. Vipp den deretter til den ene siden og fjern væsken fra platen og vask dyrene av platen.
    MERK: Ved bruk av temperaturfølsomme dyr eller anstandsmutanter er det best å opprettholde bufferne som brukes i protokollen ved dyrenes dyrkingstemperatur.
  4. Gjenta trinn 3,3 tre ganger eller til alle dyrene er vasket av platen.
  5. Bruk en standard plastspiss, kutt en firkant av agar fra den vaskede platen der eggene er konsentrert og legg agarstykket på en nylig frøet NGM-plate.
    MERK: ~ 200 egg er nødvendig for å produsere nok eggleggende dyr; for mange dyr bruker bakteriene for raskt. Lavt matnivå kan påvirke proteostase27.
  6. Dyrk dyrene i 5 dager ved 15 °C, 3,5 dager ved 20 °C eller 2,5 dager ved 25 °C. På dette tidspunktet skal platene dekkes med synkroniserte egg.
    MERK: Dyr kan flyttes til en ny plate i en kort periode for en strengere synkronisering. Det er imidlertid viktig å bare bruke voksne i de tidlige stadiene av egglegging, da dyr kan beholde egg i livmoren som påvirker synkroniseringen.
  7. Tilsett 1 ml M9 buffer sakte og borte fra bakteriell plen.
  8. Roter platen slik at bufferen dekker platen helt. Vipp den deretter til den ene siden og fjern væsken fra platen og vask dyrene av platen.
  9. Gjenta trinn 3,7 tre ganger eller til alle dyrene er vasket av platen.
  10. Tilsett 1 ml M9 buffer og bruk en celleskraper for å frigjøre eggene fra platen.
  11. Samle M9-bufferen som inneholder eggene fra platene.
  12. Sentrifuger M9-bufferen som inneholder eggene på 3000 x g i 2 min.
  13. Fjern supernatanten og tilsett M9-bufferen for å nå et volum på 1 ml.
  14. Resuspend eggene for å forstyrre noen biter av egg og bakterier.
  15. Gjenta vaskeprosedyren som er beskrevet i trinn 3.11-3.13 fem ganger. Eggpellet skal virke hvitt. Hvis den fortsatt er gul/brun, gjenta vasken til en hvit pellets er oppnådd.
    MERK: Bakterier som forblir på eggene kan forurense de dsRNA-uttrykkende bakteriene.
  16. Fjern det meste av supernatanten, og la ca 200 μL. Synkroniserte egg kan brukes til RNAi-skjermer.

4. Vanlige fenotypiske analyser

  1. Dyrking av dyr under eksperimenter
    1. Legg en dråpe på ~ 30 egg nær bakteriell plen i hver RNAi-frøplate. For referanse, plasser også ~ 30 egg på plater frøet med tomme vektorholdige (L4440) bakterier.
    2. Dyrk alderssynkroniserte dyr på NGM RNAi-frøplater. Varigheten av eksperimentet vil avhenge av scenen der dyrene skal overvåkes og temperaturen på dyrking. Juster dyrkingstemperaturen ved bruk av temperaturfølsomme mutantdyr. Juster dyrkingsvarigheten ved bruk av utviklingssink forsinkede mutante dyr.
      MERK: Selv om timingen kan variere, når dyrene når voksen alder, kan egglegging (og det resulterende hurtigmatforbruket), samt aldersavhengig proteostasekollaps28, påvirke resultatene. Det anbefales derfor å score dyr før egglegging (dag 1 av voksen alder). Villtype dyr når dette stadiet etter 4,5 dager ved 15 °C, 3 dager ved 20 °C eller 2 dager ved 25 °C.
    3. Antall repetisjoner som brukes vil avhenge av størrelsen på gensettet som undersøkes. For anstandsbiblioteket (97 gener) gjentar du eksperimenter minst fire ganger. Størrelsen på befolkningen avhenger av analysen som brukes. I atferdsanalysene som er diskutert her, score >15 dyr per eksperimentell tilstand i hver repetisjon. Data og statistiske analyser avhenger også sterkt av hvilken type analyse som brukes. Data i analysene som omtales her, kan presenteres som ± SEM.
    4. Sammenlign RNAi- og tomme vektorkontrollbehandlede dyr som uavhengige populasjoner. P-verdier kan beregnes ved hjelp av enveis eller toveis ANOVA, avhengig av endringene som undersøkes, nemlig skjerpende eller lindrende alene eller begge deler. Ved undersøkelse av en enkelt RNAi-behandling vs. kontroll, kan P-verdier beregnes ved hjelp av enveis eller toveis Mann-Whitney-rangeringssumtest. Bortsett fra statistisk signifikans, bør du vurdere en terskel for treff basert på graden av innvirkning på fenotypen.
  2. Utviklingsstans/forsinkelse
    1. Dyrk alderssynkroniserte dyr som i trinn 4.1 til dyr dyrket på tomme vektorholdige kontrollbakterier når voksen alder, men før eggleggingen starter.
    2. Overvåk dyr ved hjelp av et stereomikroskop og tell antall larver og voksne for å score prosentandelen av utviklingsforsinkede dyr. For referanse, sammenligne med mutante dyr dyrket på tomme vektorholdige kontrollbakterier. hsp-1 eller hsp-90 RNAi behandling resulterer i utviklingsstans av ville type dyr og kan brukes som en positiv kontroll.
    3. Gjenta trinn 4.2.2 for å skåre prosent av utviklingsforsinkede dyr over tid.
      MERK: Hvis det er eggleggende voksne på tallerkenen, overfør de utviklingsforsinkede dyrene til en ny NGM-RNAi-plate merket for samme målgen for å unngå forvirring med avkom.
  3. Sterilitet eller eggleggingsfeil
    1. Dyrk alderssynkroniserte dyr som i trinn 4.1 til dyr dyrket på tomme vektorkontrollbakterier begynner å legge egg.
    2. Overvåk dyr ved hjelp av et stereomikroskop og score prosentandelen av dyr uten synlige egg i livmoren. For referanse, sammenligne med mutante dyr dyrket på tomme vektor-kontroll bakterier.
    3. Alternativt kan du overvåke dyr ved hjelp av et stereomikroskop og score prosentandelen av dyr med livmor full av egg, definert som EGg Legge defekt (Egl-d) fenotype29.
  4. Embryonal dødelighet
    1. Dyrk alderssynkroniserte dyr som i trinn 4.1 til dyrene begynner å legge egg.
    2. Overfør ~100 egg til en tom tallerken. Spre eggene i rader for å forenkle tellingen.
    3. Score prosentandelen av unhatched egg på tallerkenen etter 24-48 timer. For referanse, sammenligne med egg av dyr behandlet med tomme vektor-kontroll bakterier.
  5. Lammelsesanalyse
    1. For dag 1 voksne, dyrk alderssynkroniserte dyr som i trinn 4.1 til dyr dyrket på tomme vektorkontrollbakterier når voksen alder, men før eggleggingen starter.
    2. Tegn en linje på baksiden av en vanlig NGM-agarplate ved hjelp av en fin markør.
    3. Plasser 5-10 dyr på merket linje.
    4. Still inn en timer og vent i 10 min.
    5. Score prosentandelen av dyr som gjenstår på linjen som lammede ormer. For referanse, sammenligne med mutante dyr dyrket på tomme vektor-kontroll bakterier. Villtype dyr behandlet med unc-45 RNAi viser alvorlig lammelse fenotype og kan brukes som en positiv kontroll.
      MERK: Denne analysen fremhever dyr som viser middels til alvorlig lammelse. Slike dyr ligger vanligvis rett på platen, i stedet for å presentere den vanlige buede formen. Videre er en ryddet av bakterier synlig rundt hodene til lammede ormer.
  6. Bankende analyse
    1. Dyrk alderssynkroniserte dyr som i trinn 4.1 til dyr dyrket på tomme vektorkontrollbakterier når voksen alder, men før eggleggingen starter.
    2. Pipet 100 μL M9 buffer ved dyrenes dyrkingstemperatur til en 96-brønns plate.
    3. Plasser ~15 ormer, en per brønn, inn i de bufferholdige brønnene på M9.
    4. La dyrene justere i 5 min.
    5. Undersøk hvert dyr under stereomikroskopet, start en timer som teller ned 15 s, og tell antall kroppsbøyninger hvert dyr utfører i den tidsperioden. Verdiene som telles kan normaliseres til kroppsbøyninger per min. For referanse, sammenligne med mutante dyr dyrket på tomme vektor-kontroll bakterier.
      MERK: Denne motilitetsanalysen er svært følsom og kan oppdage svært milde forskjeller mellom behandlinger. Imidlertid kan motilitet i væske og motilitet på agar variere.

5. Validering av protein knockdown

  1. Legg 250-300 synkroniserte egg på en 60 mm NGM-RNAi platefrø med relevante dsRNA-uttrykkende eller tomme vektorholdige (L4440) bakterier.
    MERK: RNAi-nedslag kan føre til avvikende opphopning av embryoer, mangel på embryoer eller i utviklingsstans som kan påvirke genuttrykket. Dette bør vurderes når du bestemmer alderen på dyrene som skal undersøkes.
  2. For dag 1 voksne, dyrk dyr i 4,5 dager ved 15 °C, 3 dager ved 20 °C eller 2 dager ved 25 °C .
  3. Plukk og overfør totalt 200 unge voksne dyr i hetten på et 1,5 ml rørfyll med 200 μL PBS-T.
    MERK: Ved bruk av temperaturfølsomme dyr eller anstandsmutanter er det best å opprettholde bufferne som brukes i protokollen ved dyrenes dyrkingstemperatur.
  4. Lukk hetten forsiktig og sentrifuger ved 1000 x g i 1 min.
  5. Tilsett 800 μL PBS-T (tabell 1) og sentrifuge ved 1000 x g i 1 min.
  6. Fjern forsiktig topp 900 μL.
  7. Gjenta trinn 5.4-5.6 tre ganger.
  8. Fjern 900 μL, og la 100 μL oppløsning som inneholder 200 ormer.
  9. Legg til 25 μL 5x prøvebuffer (Tabell 1).
  10. Varm opp prøvene i 10 min ved 92 °C mens du rister ved 1000 o/min. Prøver kan deretter fryses og oppbevars ved -20 °C.
  11. Last 20 μL av hver prøve og kjør på en SDS-PAGE gel.
  12. Utfør vestlig blotanalyse ved hjelp av passende antistoffer for å bestemme proteinets relative stabilitet.
  13. Bestem intensiteten til båndene ved hjelp av densitometrisk programvare, for eksempel den fritt tilgjengelige ImageJ gel-modulen. Normaliser alle verdier til verdiene som måles i kontrollprøvene.
    MERK: Målet med RNAi knockdown i skjermene våre er å senke proteinnivået til en bestemt anstand / medprest. Dermed er den beste måten å vurdere effektiviteten til RNAi-knockdown ved vestlig blotanalyse. Dette krever spesifikke antistoffer. Alternativt kan qPCR brukes til å kvantifisere mRNA-nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruke temperaturfølsomme mutasjoner i UNC-45 til å screene for å forverre eller lindre interaksjoner under tillatte eller restriktive forhold, henholdsvis
Muskelmontering og vedlikehold tilbyr et effektivt system for å studere vevsspesifikke anstandsinteraksjoner. Den funksjonelle enheten av kontraktil muskler, sarcomere, presenterer et krystallinsk-lignende arrangement av strukturelle og regulatoriske proteiner. Stabiliteten til motorproteinet myosin og dets inkorporering i de tykke filamentene av kontraktile muskel sarkomere avhenger av samarbeid mellom anstander og UPS-komponenter30. Et eksempel på en slik anstand er den konserverte og spesialiserte myosin chaperone UNC-45 som hovedsakelig uttrykkes i kroppsveggmuskel31,32,33,34,35. Mutasjoner i UNC-45 har vist seg å indusere myosindisorganisering og alvorlige motilitetsfeil i C. elegans31,36. UNC-45 tandemmoduler samles i en dokkingplattform med flere områder37 som fremtvinger samarbeid mellom UNC-45, HSP-90 og HSP-1 og sannsynligvis andre anstander og medprester i myosinfilamentsamling25,36,37,38. For å bekrefte kjente UNC-45 interaksjoner og identifisere nye genetiske interaksjoner i muskelproteostase, etablerte vi en strategi ved hjelp av C. elegans temperaturfølsomme unc-45 mutasjoner som en sensibilisert genetisk bakgrunn for vevsspesifikk chaperone interaksjon screening19,25.

Enkelt aminosyre substitusjoner i C. elegans UNC-45 (L822F og E781K, tilsvarende henholdsvis e286 og m94 alleler; unc-45(ts)) er ansvarlig for temperaturavhengige motilitetsfeil og myosindisorganiseringsfenotyper når berørte dyr dyrkes under restriktive forhold (>22 °C). Derimot viser disse u-45 (ts) mutantene ingen bevegelses- eller myosinorganisasjonsfeil ved tillatt temperatur (15 °C)31. I den foreslåtte tilnærmingen ble alderssynkroniserte u-45(e286) dyr i første larvalstadium (L1) utarmet av forskjellige molekylære anstander av RNAi (97 gener) og deretter overvåket for motilitetsfeil under tillatte forhold (15 °C) (Figur 1). Vi bekreftet den kjente interaksjonen mellom UNC-45 og HSP-90 proteiner i vår genetiske interaksjonsskjerm og identifiserte tre hsp-90 co-chaperones, sti-1, ahsa-1 og daf-41, som spesifikt forårsaker en syntetisk bevegelsesfeil hos u-45 (ts) mutante dyr, men ikke hos ville dyr25. Vi fortsatte med å undersøke om sti-1-, ahsa-1- eller daf-41-assosierte syntetiske fenotyper var forårsaket av myosindisorganisering ved å overvåke det subcellulære arrangementet av myosin tungkjede A (MYO-3), ved hjelp av etablerte immuno-fargingsteknikker39. Mens behandling av ville dyr med sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi ikke påvirket myofilamentorganisasjonen, resulterte uttømming av disse genene i u-45 (e286) mutante dyr i fullstendig forstyrrelse av sarkomeriske strukturer og MYO-3 feilfordeling, selv under tillatte forhold (15 °C). Denne effekten var sammenlignbar med det som ble sett med u-45 (e286) enkeltmutanter dyrket ved den restriktive temperaturen (25 °C)25. Disse resultatene ble bekreftet ved hjelp av en annen un-45(ts)-allele, nemlig unc-45(m94) mutante dyr25.

For å identifisere anstander som destabiliserer UNC-45, screenet vi neste for anstander som forbedret motiliteten til u-45 (286) dyr ved 25 °C, avhengig av gen-knockdown av RNAi. Mens u-45 (e286) mutante dyr viste alvorlige bevegelsesfeil ved 25 °C, ble motiliteten til dyr behandlet med RNAi mot gener som koding av fire av de 97 anstander som ble screenet betydelig forbedret. Også her ble resultatene bekreftet ved hjelp av u-45(m94) mutante dyr. Dermed gjør bruken av temperaturfølsomme mutasjoner det mulig å etablere både skjerpende og lindrende skjermer, avhengig av temperaturen der skjermen utføres.

Bruke vevsspesifikk overuttrykk av en anstand til å screene for skjerpende interaksjoner
Vi brukte deretter vevsspesifikk overuttrykk av en enkelt anstand som en mild perturbasjon av muskelprestnettverket for screeningformål. Spesielt brukte vi dyr over-uttrykkende vill type dnj-24, koding C. elegans homolog av Hsp40 protein DNAJB6 i C. elegans kroppsveggmuskel (DNJ-24M). Som ovenfor ble L1 DNJ-24M dyr behandlet med RNAi for forskjellige anstander og overvåket for motilitetsfeil (20 °C) (Figur 1). Mens DNJ-24M dyr ikke viste noen bemerkelsesverdige motilitetsfeil, tre gener (av de 48 anstandskodingsgenene undersøkt; 6%), nemlig hsp-1, rme-8og dnj-8, påvirket spesielt motiliteten til DNJ-24M-uttrykkende dyr, men ikke ville type dyr. Det er oppmerksom på at testing av spesifisiteten til treffene ved hjelp av dyr som over-uttrykker en annen anstand, nemlig HSP-90, i muskel (HSP90M), viste ingen effekt på HSP90M motilitet ved hsp-1, rme-8eller dnj-8 RNAi-behandling40. Samlet sett resulterte screeningplattformen, som brukte mild perturbasjon til anstandsnettverket, for eksempel uttrykket av metastabile mutantproteiner eller vevsspesifikk overuttrykk, i en svært spesifikk trefffrekvens (normalt ~ 5%).

Bruke vevsspesifikk RNAi til å screene for vevsspesifikke genetiske interaksjoner
Vevsspesifikke RNAi-sensitive stammer tillater vevsspesifikk nedslag av gener mens du fortsatt bruker bakteriell fôring for dsRNA-levering. Disse stammene er mutante for RDE-1 argonauteproteinet, en viktig komponent i RNAi-banen som kreves for effektiv genaktivering21. Men å uttrykke vill type RDE-1 under kontroll av en vevsspesifikk promotor førte til effektiv vevsspesifikk gennedslag41,42. Dette verktøyet tillater dermed genetiske interaksjonsskjermer uten å bruke vevsspesifikke anstander, for eksempel UNC-45 eller DNAJ-24M. For eksempel resulterte hsp-6 (mortalin) knockdown hos ville dyr under utvikling i en sterk utviklingsstans (96±1% av de RNAi-behandlede dyrene). Samtidig forårsaket hsp-6 knockdown i en stamme som uttrykte vill type RDE-1 i muskel ikke utviklingsstans, mens uttrykk for vill type RDE-1 i tarmceller resulterte i en sterk utviklingsstans fenotype (90±3%; Figur 2). Dermed er HSP-6-funksjon i tarmceller nødvendig for normal utvikling. En mutasjon i hsp-6 (mg585) som forårsaker en mild vekstforsinkelse, kan derfor brukes til å screene for å forverre eller lindre anstandsinteraksjoner ved å krysse det muterte genet inn i en tarmspesifikk RNAi-stamme og screene chaperone RNAi-biblioteket.

Overvåke aldersavhengige endringer i foldemiljøet ved hjelp av genetiske interaksjoner
Dyr viser en aldersavhengig nedgang i motilitet som er forbundet med sarkomisk disorganisering43,44,45. Endringer i protein folding kapasitet sammenfaller med endret regulering og sammensetning av cellulær proteostase maskiner28, inkludert endrede nivåer av UNC-45, CHN-1, og UFD-2, proteiner av muskel kvalitet kontroll maskiner46. I samsvar påvirkes myosin folding og nedbrytning av endringer i proteostatisk kapasitet ved overgangen til voksen alder47. Vi spurte derfor om slike endringer kunne påvirke anstandsinteraksjoner. For eksempel overvåket vi virkningen av sti-1, ahsa-1 og daf-41 knockdown på motilitet over tid. Vi fant at selv om sti-1-, ahsa-1- og daf-41-RNAi-behandlede dyr viste redusert bevegelighet under larvutvikling, falt motiliteten sterkt i u-45 (ts) voksne ormer. Videre var MYO-3-organisasjonen i u-45(ts) mutante dyr behandlet med sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi lik den av villtype ormer på fjerde larvalstadium (L4), selv om mutantene viste forstyrret sarkomer etter at dyrene nådde voksen alder (Figur 3). I motsetning til dette forble både u-45(ts) mutante dyr behandlet med en tom vektorkontroll og ville dyr upåvirket (figur 3). Dermed kan proteostasedynamikk som en funksjon av alder eller miljøforhold27,45,46,48,49 kritisk påvirke anstandsinteraksjoner.

Figure 1
Figur 1: Oppsett av RNAi syntetiske interaksjonsskjermer ved hjelp av C. elegans som bærer en mutasjon i et gen som koder en anstand av interesse. (A) Skjematisk representasjon av det grunnleggende oppsettet av målrettede anstandsinteraksjonsskjermbilder. (B) Treffvalidering krever bekreftelse av den genetiske interaksjonen ved hjelp av en annen anstandsmutant, samt validering av RNAi-knockdown. (CD) Enkle avlesninger, for eksempel motilitetsfeil, kan kvantifiseres for å bestemme skjerpende eller lindrende interaksjoner, henholdsvis ved hjelp av lammelse eller bankende analyser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vevsspesifikk RNAi hos mitokondrieprest hsp-6 kan brukes til å undersøke genetiske interaksjoner i ett vev. Wild type tarm- og muskelspesifikke RNAi stammer ble behandlet med hsp-6 RNAi og (A) utviklingsforsinkelse ble scoret eller (B) bilder ble tatt på den første dagen av voksen alder. Data er gjennomsnittlige ± SEM, N =6. Skalalinjen er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Aldersavhengige effekter av RNAi. (A) Motilitet med alderen. Wild type eller unc-45 (e286) embryoer ble plassert på sti-1, ahsa-1 eller daf-41 RNAi-seeded plater ved 15 °C og scoret for motilitet ved hjelp av en bankende analyse på hvert utviklingsstadium, L1-L4, ung voksen og dag 1 av voksen alder. Data er gjennomsnittlige ± SEM, N=15. (B) Confocal bilder av kroppen veggen muskel. Dyr ble behandlet som i A og festet på L4, ung voksen og dag 1 av voksen alder stadier og immuno-farget med anti-MYO-3 antistoffer. Skalalinjen er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Løsning Forberedelsesinstruksjoner Lagring
1 M CaCl2 (1 L) Legg til 147,01 g CaCl2·2H2O Lagre hos RT
Legg dH2O til 1 L
Autoklav eller filter (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6,0 (1 L) Legg til 136.09 g KH2PO4 Lagre hos RT
Legg til 800 ml dH2O
Bland med magnetisk rører til den er oppløst
Titrate pH ved hjelp av KOH
Legg dH2O til 1 L
Autoklav eller filter (0,22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) Tilsett 248,58 g MgSO4·7H2O Lagre hos RT
Legg dH2O til 1 L
Autoklav eller filter (0,22 μm)
Kolesteroloppløsning (50 ml) Tilsett 250 mg kolesterol til et 50 ml Falcon-rør Oppbevars ved -20 °C
Fullstendig oppløst i 40 ml etanol
Legg etanol til 50 ml
1 M IPTG (50 ml) Legg 11,9 g IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) til et 50 ml Falcon-rør Oppbevares i mørket ved -20 °C
Fullstendig oppløst i 40 ml dH2O
Legg dH2O til 50 ml
Filter (0,22 μm), aliquot 1ml rør
Ampicillin lager (50 ml) Tilsett 5 g ampicillin til et 50 ml Falcon-rør Oppbevars ved -20 °C
Fullstendig oppløst i 40 ml dH2O
Legg dH2O til 50 ml
Filter (0,22 μm), fordel 1 ml aliquot i Eppendorf-rør
Tetracyklin lager (50 ml) Tilsett 250 mg tetracyklin i et 50 ml Falcon-rør Oppbevars ved -20 °C
Fullstendig oppløst i 40 ml etanol
Legg etanol til 50 ml
Aliquot 1 ml rør
M9-buffer (1 L) Legg til 5.8 g Na2HPO4·7H2O Lagre hos RT
Legg til 3 g KH2PO4
Legg til 5 g NaCl
Tilsett 0,25 g MgSO4·7H2O
Legg dH2O til 1 L
Filter (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7,4) ( 1 L) Legg til 8 g NaCl Lagre hos RT
Tilsett 200 mg KCl
Legg til 1,44 g Na2HPO4·7H2O
Tilsett 240 mg KH2PO4
Fullstendig oppløst i 800 ml dH2O
Titrate pH ved hjelp av KOH tp pH 7.4
Tilsett 500 μL Tween-20
Legg dH2O til 1 L
5x prøvebuffer Legg til 6,8 ml dH2O Oppbevars ved -20 °C
Legg til 2 ml 0,5 M Tris pH 6,8
Tilsett 3,2 ml Glyserol
Legg til 1,6 ml 20 % SDS
Legg til 0,8 ml ß-mercaptoetanol
1% bromofenol blå

Tabell 1: Oppskrifter på løsninger

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et integrert bilde av proteostasenettverket som reflekterer hvordan det er organisert og fungerer i forskjellige metazoanske celler og vev, mangler fortsatt. For å løse denne mangelen er det nødvendig med spesifikk informasjon om samspillet mellom ulike komponenter i dette nettverket, for eksempel molekylære anstander, i bestemte vev i løpet av utvikling og aldring. Her viste vi hvordan bruk av vevsspesifikke perturbasjoner gjorde det mulig for oss å undersøke anstandsnettverket i et gitt vev. For å utforske vevsspesifikke anstandsgenetiske interaksjoner ble tre forskjellige tilnærminger vurdert. I den første tilnærmingen ble UNC-45, en anstand som er svært uttrykt i muskelceller, brukt til å screene for anstandsinteraksjoner via feeding-RNAi25. Mens bruken av en spesialisert anstand tillater kresen vevsspesifisitet, kan den bare rapportere om det svært fokuserte undernettverket som det bidrar til. Legg merke til at de fleste C. elegans nevroner er resistente mot fôringsbasert RNAi-levering50 og dermed bruker denne tilnærmingen til å identifisere genetiske interaksjoner i nevronceller krever å krysse mutantpresteren undersøkt med en RNAi-forbedret stamme51. I en annen tilnærming ble en vevsspesifikk promotor brukt til å drive overuttrykk av en anstand i muskel og dermed spesielt påvirke muskelfoldingsmiljøet40. Å over-uttrykke en enkelt anstand kan imidlertid være generelt gunstig for foldemiljøet og dermed maskere forstyrrelser forårsaket av de to anstandene sammen. Den tredje tilnærmingen stolte på vevsspesifikk RNAi knockdown for å undersøke anstandsinteraksjoner i et gitt vev41. En fordel med denne tilnærmingen er at den tillater målretting av nevronceller som er motstandsdyktige mot RNAi-levering via fôring42. Likevel krever denne tilnærmingen bruk av et mildt mutant (men ikke spesialisert), samt at denne mutanten krysses inn i en rde-1 null mutant som bærer et vevsspesifikt rde-1 redningsgen. Det er viktig at disse tilnærmingene kombineres for å potensielt modulere anstandsfunksjonen i et enkelt vev eller til og med en enkelt celle.

Kvalitetskontrollmaskineriet kan påvirke funksjonen til mange genprodukter ved å perturbing proteostase. Dette er en stor utfordring når du bruker genetiske interaksjoner til å utforske kvalitetskontrollnettverket18. For eksempel resulterte kronisk uttrykk for aggregeringsutsatte proteiner eller proteostase i aldring i fenotypisk forverring av mange ikke-relaterte metastabile proteiner i C. elegans og gjær45,52,53. Videre ble klaritrinmediert endokytose i pattedyrceller hemmet ved funksjonell fangst av Hsc70 til proteinaggregater. Likevel ble det vist at endokytose kunne reddes av Hsc70 overuttrykk, mens aggregering ikke kunne54,55. På samme måte identifiserte en genetisk skjerm i Drosophila designet for å avdekke regulatorer av varmesjokkresponsen en missense mutasjon i flymuskelhandlingin som vanligvis aktiverte varmesjokkresponsen56. Samlet sett kan perturbasjon av proteostasenettverket avsløre metastabile proteiner eller indusere stress som kan påvirke resultatspesifisiteten. Likevel kan analyse av genetiske interaksjoner gi svært spesifikk og funksjonell innsikt. For eksempel identifiserte epistatiske analyser av gjærgener som kreves for folding i det endoplasmiske retikulumet spesifikke genetiske interaksjoner mellom molekylære anstander som senere ble validert19. På samme måte identifiserte en forverrende skjerm for anstander som forbedrer toksisiteten til to aggregeringsutsatte modeller (målt ved motilitet) et bestemt delsett av 18 anstander, ortoologer som påvirket Huntingtin-aggregering i menneskelige celler26. Her viste vi at ulike perturbasjoner av proteostasenettverket kan avdekke spesifikke og funksjonelle anstandsinteraksjoner.

Den største fordelen med å bruke RNAi fôringsbaserte genetiske interaksjonsskjermer er den relative enkelheten i metoden. Selv å bruke en generell atferdsproduksjon, for eksempel motilitet, kan avsløre nye genetiske interaksjoner (Figur 3). Variasjon og delvise effekter av uttrykksnedslag kan imidlertid begrense robustheten og spesifisiteten til resultatene57. Videre er genetiske interaksjoner ikke en indikasjon på fysiske interaksjoner, og forholdet mellom to gener kan dermed være indirekte. Det kan være tidkrevende å utforske samhandlingenes art og forkaste ikke-spesifikke samhandlinger,57,58,59. Dette er en bekymring som må løses i skjermoppsettet og valideringen. For eksempel gjør bruk av null alleler i genetisk screening det mulig å avgjøre om disse genene fungerer i samme eller distinkte veier i en gitt biologisk prosess. Ved hjelp av delvis tap av genfunksjon resulterer imidlertid hypomorfiske alleler, som temperaturfølsomme alleler eller RNAi-avhengig nedregulering av uttrykk, i gjenværende aktiviteter som kan gi skjerpende eller lindre fenotyper, uavhengig av om genene virker i samme eller parallelle veier59. Dermed krever arten av enhver interaksjon videre analyse. Ved hjelp av hypomorfiske alleler og RNAi kan imidlertid identifisere et bredt spekter av interagere, inkludert gener i samme proteinkompleks eller bane eller i en overflødig vei59. Selv om dette større omfanget av mulige interaksjoner kan gi flere treff i en genetisk skjerm, kan det også føre til ikke-spesifikke interaksjoner, for eksempel den ikke-spesifikke eksponeringen av temperaturfølsomme alleler i proteostase kollapse45,53.

Treffvalidering og ikke-spesifikke samhandlinger kan undersøkes på flere måter. Antall treff bør være lavt. For eksempel resulterte nedregulering av anstandsuttrykk i en u-45 mutant bakgrunn i en liten prosentandel av treff (4%), med de fleste anstandsgen down-regulation som ikke viste noen effekt på motilitet. En tilsvarende rate ble observert da DNJ-24M ble over-uttrykt (6%). Som nevnt ovenfor identifiserte en skjerm for anstandsinteraksjoner med aggregeringsutsatte proteiner 18 anstander av 219 screened (8%).

Flere mutante alleler, overuttrykkslinjer eller sykdomsmodeller bør brukes. Bruken av forskjellige mutante alleler som har forskjellige effekter på anstandsfunksjon, samt forskjellige stammer med forskjellig genetisk bakgrunn, kan støtte spesifisiteten til eventuelle skjermtreff. Alternativt kan bruk av mutasjon eller overuttrykk av en annen anstand som ikke fører til lignende perturbasjon tjene som en negativ kontroll. Både unc-45(e286) og unc-45(m94) viste for eksempel skjerpende virkemåte når sti-1, ahsa-1 eller daf-41 var nedregulert. Videre ble det observert en lignende interaksjon når dyr som bærer ahsa-1 (ok3501) slettingsmutant ble behandlet med hsp-90 RNAi25.

Identiteten til anstandstreffene og deres kjente interaksjoner bør undersøkes. For eksempel er anstander identifisert i en u-45 skjerpende skjerm et svært spesifikt sett med anstander som kreves for HSP-90 ATPase-syklusen, inkludert de som koder en klientrekrutterer (STI-1), en ombygging co-chaperone (AHSA-1) og en klientmodning co-chaperone (DAF-41). Faktisk danner dette settet med co-chaperones en komplett HSP-90 foldesyklus60. På samme måte identifiserte en DNJ-24M-skjerm HSP-1, den viktigste anstandspartneren til Hsp40s40.

Endringer i interaksjoner over dyrets levetid bør også undersøkes. For eksempel påvirket anstander identifisert i u-45 forverrende skjerm sterkt motilitet og myosinorganisasjon i voksen alder, men hadde en mildere effekt under utviklingen. Dette kan skyldes endringer i proteostasenettverket i voksen alder28 eller endringer i myosinfoldingskrav mellom myofiberfolding og vedlikehold.

Bruk komplementære biokjemiske tilnærminger for å undersøke interaksjoner mellom proteinene direkte, samt deres lokalisering i cellen. For eksempel er HSP-90 co-chaperones, STI-1, AHSA-1 og DAF-41 lokalisert til sarcomere der de samhandler med myosin25.

C. elegans er en veletablert metazoanmodell for overvåking av kvalitetskontroll. Det brukes ofte til å overvåke cellulære og organismeproteostase ved hjelp av et variabelt verktøysett av cellebiologi, biokjemiske og genetiske tilnærminger. Her benyttet vi genetisk screening tilnærminger og tilgjengelige verktøy57,58,59, for eksempel en mutant bank, tilgjengelig RNAi biblioteker22,23 og vevsspesifikke RNAi stammer41,42, for å overvåke anstand interaksjoner i et levende dyr under utvikling og aldring. Bruken av enkle atferdsanalyser, som motilitet, forenkler skjermen til mange mulige genpar for å utforske nye genetiske interaksjoner. Dette kan da fungere som en plattform for å utforske anstandslokalisering og fysisk interaksjon ved hjelp av biokjemiske verktøy for å mekanistisk studere deres potensielle interaksjoner in vivo og in vitro. Protokollen beskrevet her har blitt vellykket brukt til å identifisere nye anstand interaksjoner i C. elegans kroppsvegg muskel25,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Caenorhabditis Genetics Center, finansiert av NIH National Center for Research Resources (NCRR), for noen av nematodestammene. Monoklonale antistoffer utviklet av H.F. Epstein ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdt av Institutt for biologi, Universitetet i Iowa. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Israel Science Foundation (tilskudd nr. 278/18) og av et tilskudd fra Israels vitenskapsdepartement, og Utenriksdepartementet og internasjonalt samarbeid, Generaldirektoratet for landfremming, Den italienske republikk (tilskudd nr. 3-14337). Vi takker medlemmer av Ben-Zvi-laboratoriet for hjelp til å forberede dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Biologi Utgave 160 Caenorhabditis elegans anstand genetiske interaksjoner proteostase RNAi skjerm temperaturfølsom
Bruke <em>Caenorhabditis elegans</em> til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter