Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Abstract

Hücresel fonksiyon için proteinlerin ve protein komplekslerinin doğru katlanır ve montajı esastır. Hücreler, sağlıklı bir proteom sağlamak için hasarlı proteinleri düzelten, inzup tutan veya ortadan kaldıran kalite kontrol yollarını kullanır, böylece hücresel proteostaz sağlar ve daha fazla protein hasarını önler. Proteostaz ağı içindeki gereksiz işlevler nedeniyle, çok hücreli organizma Caenorhabditis elegans'ta refakatçi kodlayıcı genlerde nakavt veya mutasyonlar kullanılarak tespit edilebilir fenotiplerin taranması, çoğu durumda küçük veya hiç fenotip tespit edilmesiyle sonuçlanır. Belirli bir işlev için gerekli olan refakatçileri belirlemek ve böylece fenotip ile işlev arasındaki boşluğu kapatmak için hedefli bir tarama stratejisi geliştirdik. Özellikle, refakatçi kodlayan gende mutasyon taşıyan veya bir ilgi refakatçisini aşırı ifade eden hayvanlarda RNAi sentetik etkileşim ekranlarını, yıkıcı refakatçi ifadesini, her seferinde bir refakatçiyi kullanarak yeni refakatçi etkileşimlerini izliyoruz. Bireysel olarak brüt fenotip sunmayan iki refakatçiyi bozarak, her ikisi de rahatsız edildiğinde belirli bir fenotipi ağırleştiren veya açığa çıkaran refakatçileri tanımlayabiliriz. Bu yaklaşımın, belirli bir fenotiple ilişkili bir protein veya protein komplekslerinin katlamasını modüle etmek için birlikte çalışan belirli refakatçi kümelerini tanımlayabileceğini gösteriyoruz.

Introduction

Hücreler, hasarlı proteinleri onaran, inzdiye alan veya uzaklaştıran kalite kontrol makineleri kullanarak protein hasarı ile başa çıkar1,2. Protein komplekslerinin katlanır ve montajı moleküler refakatçiler tarafından desteklenir, hasarlı proteinleri onarabilen veya inzal ettirebilen çok korunmuş proteinlerden oluşan çeşitli bir grup 3 ,4,5,6,7. Hasarlı proteinlerin uzaklaştırılması, ubiquitin-proteazom sistemi (UPS)8 veya10, 11, 12refakatçileri ile işbirliği içinde otofaji makineleri9 tarafındanaracılıkedilir. Protein homeostaz (proteostaz) bu nedenle, katlama ve bozulma makinelerinden oluşan kalite kontrol ağları tarafından sürdürülmektedir3,13. Bununla birlikte, proteostaz ağının çeşitli bileşenleri arasındaki etkileşimleri anlamak büyük bir zorluktur. Protein-protein etkileşim ekranları fiziksel etkileşimler ve refakat kompleksleri hakkında önemli bilgilere katkıda bulunurken14,15, organizasyonu anlamak ve dokuya özgü refakatçi ağları içindeki telafi edici mekanizmalar in vivo eksiktir.

Genetik etkileşimler genellikle ortak veya telafi edici biyolojik yollarda yer alan gen çiftleri arasındaki ilişkiyi incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılır16,17,18. Bu tür ilişkiler, mutasyon çiftlerinin birleştirilmesi ve bir gendeki bir mutasyonun ikinci gendeki bir mutasyonun neden olduğu fenotipik şiddet üzerindeki etkisinin ölçülmesi ile ölçülebilir16. Bu kombinasyonların çoğu fenotip açısından herhangi bir etki göstermese de, bazı genetik etkileşimler ölçülen fenotipin şiddetini ağırlaştırabilir veya hafifletebilir. Çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarının birleştirilmesiyle görülen beklenen fenotipten daha şiddetli olduğunda, iki genin paralel yollarda işlev gördüğünü ve belirli bir işlevi birlikte etkilediğini ima eden ağırlaştırıcı mutasyonlar gözlenir. Buna karşılık, çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarında görülen fenotipten daha az şiddetli olduğunda hafifletici mutasyonlar gözlenir, bu da iki genin bir kompleks olarak birlikte hareket ettiğini veya aynı yola katıldığını imaeder 16,18. Buna göre, genetik etkileşimleri tanımlamak için ölümcüllük, büyüme oranları ve kuluçka büyüklüğü gibi geniş fenotipler ve transkripsiyon muhabirleri gibi spesifik fenotipler de dahil olmak üzere ölçülebilen çeşitli fenotipler kullanılmıştır. Örneğin, Jonikas ve arkadaşları, çift yönlü gen silme analizleri kullanarak Saccharomyces cerevisiae ER açılmamış protein yanıtı proteostaz ağının etkileşimlerini incelemek için bir ER stres muhabirine güvendi19.

Genetik etkileşim ekranları, kapsamlı bir çift mutant kümesi oluşturmak için çift yönlü silme mutasyonlarını sistematik olarak geçmeyi içerir20. Bununla birlikte, hayvan modellerinde ve özellikle C. elegans'ta, bu büyük ölçekli yaklaşım mümkün değildir. Bunun yerine, mutant suşları, RNA paraziti (RNAi)21kullanılarak gen ekspresyonunu aşağı düzenleyerek genetik etkileşim kalıpları için test edilebilir. C. elegans RNAi22,23tabanlı ekranlar için güçlü bir sistemdir. C. elegans'ta,çift iplikli RNA (dsRNA) doğumu bakteriyel beslenme ile elde edilir ve dsRNA moleküllerinin çok sayıda dokuya yayılmasına yol açmaktadır. Bu şekilde, tanıtılan dsRNA molekülleri hayvanı hızlı ve basit bir prosedürle etkiler21. Bu nedenle, RNAi kullanan bir genetik etkileşim ekranı, RNAi kütüphanelerini kullanarak genleri kodlayan bir dizi geni veya çoğu C. elegans'ı aşağı düzenlemenin etkisini ortaya getirebilir24. Böyle bir ekranda, ilgi mutantının davranışını etkileyen ancak vahşi tip suşunu etkilemeyen isabetler, izlenen fenotipin potansiyel değiştiricileridir25. Burada, C. elegansdokuya özgü refakatçi etkileşimlerini sistematik olarak haritalamak için mutasyonların ve RNAi taramasının bir kombinasyonunu uyguluyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. RNAi için nematod büyüme medya plakalarının hazırlanması

  1. 1 L şişeye 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar ve 1 L'ye kadar damıtılmış su ekleyin ve otoklavlayın.
  2. 55 °C'ye kadar soğuk şişe.
  3. Nematod büyüme ortamı (NGM) yapmak için25mL 1 M KH 2 PO4, pH 6.0, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL 1 M MgSO4ve 1 mL kolesterol çözeltisi (Tablo 1) ekleyin.
  4. NGM-RNAi çözeltisi yapmak için 1 mL ampisilin (100 mg/mL) ve 0,5 mL 1 M IPTG(Tablo 1)ekleyin.
    NOT: Yaygın olarak kullanılan HT115(DE3) E. coli bakterisi, dsRNA kodlayıcı plazmidleri ifade etmek için kullanılan IPTG indükleyici T7 DNA polimeraz içerir. Bu plazmidler ampisilin direnci için de kodlanır.
  5. Şişeyi döndürerek ılık çözeltiyi karıştırın.
  6. Kaputta veya steril prosedürler kullanarak, NGM çözeltisini plakalara dökün veya peristaltik bir pompa kullanarak çözeltiyi plakalara dağıtın. Bu ekran için 6 kuyulu, 12 kuyulu, 40 mm veya 60 mm plakalar kullanın. Ağar, plaka derinliğinin yaklaşık 2/3'lerini doldurmalıdır.
  7. Plakaları kapalı tutarak oda sıcaklığında tezgahta gece boyunca kurutun. RNAi için NGM plakaları bir aya kadar 4 °C'de saklanabilir.

2. RNAi bakterisi yetiştirmek ve plakaların tohumlarını almak

  1. Davlumbazda veya steril prosedürler kullanarak, önceden otoklavlanmış 1 L LB çözeltisine 1 mL ampisilin (100 mg/mL) ve 2,5 mL tetrasiklin (5 mg/mL)(Tablo 1)ekleyin ve karıştırın.
    NOT: Yaygın olarak kullanılan HT115(DE3) E. coli bakterileri tetrasikline dirençlidir.
  2. Davlumbazda veya steril prosedürler kullanarak, 2 mL derinliğinde 96 kuyu steril plakalarda her kuyuya 600 μL LB çözeltisi ekleyin. Medyayı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanmak en iyisidir.
  3. Steril prosedürler kullanarak, HT115 (DE3) E. coli bakterisi ile kuyuları aşılayın, bir kontrol olarak ilgi çekici bir geni veya boş bir plazmidi hedef alan dsRNA kodlayıcı bir plazmid ile dönüştürülmüştür. Plakaları örtün ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. DsRNA'yı ifade eden bakteri klonlarından oluşan ve tahmin edilen C. elegans genlerinin ~%94'üne karşılık gelen kütüphaneler daha önce22,23 olarak inşa edilmiş ve ticari olarak mevcuttur. Burada kullanılan refakatçi kütüphanesi Dr. Richard Morimoto laboratuvarı 26 tarafından inşaedilmiştir.
  4. Steril prosedürler kullanılarak, sırasıyla 12 kuyu, 40 mm ve 6-well veya 60 mm NGM RNAi plakalarına 75, 150 veya 250 μL bakteri tohumu. Plakadaki hedef genin adını açıkça işaretle. Bakteriler agar yüzeyinin% 30-50'sini örtmeli ve plakanın kenarlarına dokunmamalıdır.
  5. Plakaları kapalı tutarak oda sıcaklığında tezgahta en az 2 gün kurumaya bırakın.
    NOT: Plakalar gece boyunca 37 °C'de inkübe edilebilir. Plakaları kullanmadan veya saklamadan önce iç kuyuların kuru olduğundan emin olun. Tüm uzun vadeli amaçlar için (yani kurutma veya depolama) plakaları karanlıkta tutun. Kurutulmuş, tohumlu plakalar bir aya kadar 4 ° C'de saklanabilir.

3. Embriyoların stresli olmayan senkronizasyonu

  1. Yaklaşık 100 yumurtayı eşitlenmemiş bir solucan plakasından yeni tohumlanmış bir NGM plakasına taşımak için bir solucan seçimi kullanın.
  2. Hayvanları 15 °C'de 5 gün, 20 °C'de 3,5 gün veya 25 °C'de 2,5 gün yetiştirin. Hayvanlar yumurtlamanın ilk gününe ulaşmalıdır.
    NOT: Solucanlar genellikle 20 °C'de yetiştirilir. Bununla birlikte, farklı refakatçi mutant suşları belirli ekim sıcaklıkları gerektirebilir. Örneğin, birçok sıcaklığa duyarlı suş 15 °C'de yetiştirilir, ancak fenotiplerini açığa çıkarmak için 25 °C'ye kaydırılır.
  3. Bakteri çimlerinden yavaşça ve uzağa 1 mL M9 tamponu (Tablo 1)ekleyin. Plakayı, tampon plakayı tamamen kaplar şekilde döndürün. Sonra bir tarafa eğin ve sıvıyı plakadan çıkarın ve hayvanları plakadan yıkayın.
    NOT: Sıcaklığa duyarlı hayvanlar veya refakatçi mutantları kullanırken, protokolde kullanılan tamponların hayvanların ekim sıcaklığında tutulması en iyisidir.
  4. 3.3 adımını üç kez veya tüm hayvanlar plakadan yıkanana kadar tekrarlayın.
  5. Standart bir plastik uç kullanarak, yumurtaların yoğunlaştığı yıkanmış plakadan bir kare agar kesin ve agar parçasını yeni tohumlanmış bir NGM plakasına yerleştirin.
    NOT: Yeterli yumurtlayan hayvan üretmek için ~200 yumurta gereklidir; çok fazla hayvan bakteriyi çok hızlı tüketir. Düşük gıda seviyeleri proteostaz27etkileyebilir.
  6. Hayvanları 15 °C'de 5 gün, 20 °C'de 3,5 gün veya 25 °C'de 2,5 gün yetiştirin. Bu noktada tabaklar senkronize yumurta ile kaplanmalıdır.
    NOT: Hayvanlar daha sıkı bir senkronizasyon için kısa bir süre için yeni bir tabağa kaydırılabilir. Bununla birlikte, hayvanlar uteruslarını etkileyen senkronizasyonda yumurta tutabildiğinden, yetişkinleri sadece yumurtlamanın erken aşamalarında kullanmak önemlidir.
  7. 1 mL M9 tamponu yavaşça ve bakteri çimlerinden uzağa ekleyin.
  8. Plakayı, tampon plakayı tamamen kaplar şekilde döndürün. Sonra bir tarafa eğin ve sıvıyı plakadan çıkarın ve hayvanları plakadan yıkayın.
  9. 3.7 adımını üç kez veya tüm hayvanlar plakadan yıkanana kadar tekrarlayın.
  10. 1 mL M9 tampon ekleyin ve yumurtaları plakadan serbest bırakmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
  11. Yumurtaları içeren M9 tamponu plakalardan toplayın.
  12. Yumurtaları içeren M9 tamponu 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin.
  13. Üst katmanı çıkarın ve 1 mL'lik bir hacme ulaşmak için M9 arabelleği ekleyin.
  14. Yumurta ve bakteri parçalarını bozmak için yumurtaları yeniden diri açın.
  15. 3.11-3.13 adımlarında açıklanan yıkama prosedürünü beş kez tekrarlayın. Yumurta peleli beyaz görünmelidir. Hala sarı/kahverengiyse, beyaz bir pelet elde edilene kadar yıkamayı tekrarlayın.
    NOT: Yumurtaların üzerinde kalan bakteriler dsRNA eksprese edici bakterileri kirletebilir.
  16. Yaklaşık 200 μL bırakarak süpernatantın çoğunu çıkarın, senkronize yumurtalar RNAi ekranlar için kullanılabilir.

4. Yaygın fenotipik tahliller

  1. Deneyler sırasında hayvanların yetiştirilmesi
    1. Her RNAi tohumlu tabağa bakteri çimlerine yakın bir damla ~ 30 yumurta yerleştirin. Referans olarak, boş vektör içeren (L4440) bakterilerle tohumlanmış plakalara ~ 30 yumurta yerleştirin.
    2. NGM RNAi tohumlu tabaklarda yaş senkronize hayvanlar yetiştirin. Deneyin süresi, hayvanların hangi aşamada izleneceğine ve ekim sıcaklığına bağlı olacaktır. Sıcaklığa duyarlı mutant hayvanları kullanırken ekim sıcaklığını ayarlayın. Gelişimsel olarak gecikmiş mutant hayvanları kullanırken ekim süresini ayarlayın.
      NOT: Zamanlama değişebilirken, hayvanlar yetişkinliğe ulaştığında, yumurtlama (ve ortaya çıkan hızlı gıda tüketimi) ve yaşa bağlı proteostsis çökmesi28, sonuçları etkileyebilir. Bu nedenle, yumurtlama başlamadan önce hayvanları puanlamak önerilir (yetişkinliğin 1. günü). Yabani tip hayvanlar bu aşamaya 15 °C'de 4,5 gün, 20 °C'de 3 gün veya 25 °C'de 2 gün sonra ulaşır.
    3. Kullanılan tekrar sayısı incelenen gen kümesinin büyüklüğüne bağlı olacaktır. Refakatçi kütüphanesi (97 gen) için deneyleri en az dört kez tekrarlayın. Nüfusun büyüklüğü kullanılan teste bağlıdır. Burada tartışılan davranışsal tahlillerde, her tekrarda deneysel durum başına >15 hayvan puanlayın. Veriler ve istatistiksel analizler de kullanılan tahlil türüne bağlıdır. Burada tartışılan tahlillerdeki veriler SEM ± araç olarak sunulabilir.
    4. RNAi ve boş vektör kontrolü ile tedavi edilen hayvanları bağımsız popülasyonlar olarak karşılaştırın. P değerleri, incelenen değişikliklere bağlı olarak tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanabilir, yani tek başına veya her ikisini de ağırlaştırabilir veya hafifletebilir. Tek bir RNAi tedavisi ve kontrol incelendiğinde, P değerleri tek yönlü veya iki yönlü Mann-Whitney rütbe toplamı testi kullanılarak hesaplanabilir. İstatistiksel önemin dışında, fenotip üzerindeki etki derecesine göre isabetler için bir eşik düşünün.
  2. Gelişimsel tutuklama/gecikme
    1. Boş vektör içeren kontrol bakterileri üzerinde yetiştirilen hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar ancak yumurtlama başlamadan önce 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanlar yetiştirin.
    2. Stereomikroskop kullanarak hayvanları izleyin ve gelişimsel olarak gecikmiş hayvanların yüzdesini puanlamak için larva ve yetişkin sayısını sayın. Referans olarak, boş vektör içeren kontrol bakterileri üzerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın. hsp-1 veya hsp-90 RNAi tedavisi vahşi tip hayvanların gelişimsel olarak tutuklanmasına neden olur ve pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
    3. Zaman içinde gelişimsel olarak geciken hayvanların yüzdesini puanlamak için 4.2.2 adımını tekrarlayın.
      NOT: Tabakta yumurtlayan yetişkinler varsa, gelişimsel olarak geciken hayvanları, soyla karışıklığı önlemek için aynı hedef gen için etiketlenmiş yeni bir NGM-RNAi plakasına aktarın.
  3. Sterilite veya yumurtlama kusurları
    1. Boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetişen hayvanlar yumurta bırakmaya başlayana kadar 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanlar yetiştirin.
    2. Stereomikroskop kullanarak hayvanları izleyin ve rahimlerinde görünür yumurta olmayan hayvanların yüzdesini puanla. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterilerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın.
    3. Alternatif olarak, stereomikroskop kullanarak hayvanları izleyin ve EGg Döşeme kusurlu (Egl-d) fenotip29olarak tanımlanan yumurta dolu bir uterusa sahip hayvanların yüzdesini puanlar.
  4. Embriyonik öldürücülük
    1. Hayvanlar yumurta bırakmaya başlayana kadar 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanları yetiştirin.
    2. ~100 yumurtayı boş bir tabağa aktarın. Sayımı basitleştirmek için yumurtaları sıralara yayın.
    3. 24-48 saat sonra tabakta unhatched yumurta yüzde puan. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterileri ile tedavi edilen hayvanların yumurtalarıyla karşılaştırın.
  5. Felç tahlil
    1. 1. gün yetişkinler için, boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetişen hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar ancak yumurtlama başlamadan önce 4.1 adımda olduğu gibi yaş senkronize hayvanlar yetiştirin.
    2. İnce bir işaretleyici kullanarak normal bir NGM agar plakasının arkasına bir çizgi çizin.
    3. İşaretli çizgiye 5-10 hayvan yerleştirin.
    4. Bir zamanlayıcı ayarlayın ve 10 dakika bekleyin.
    5. Hatta kalan hayvanların yüzdesini felçli solucanlar olarak puanla. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterilerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın. Unc-45 RNAi ile tedavi edilen vahşi tip hayvanlar şiddetli felç fenotipi gösterir ve pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
      NOT: Bu test, orta ila şiddetli felç gösteren hayvanları vurgulamaktadır. Bu tür hayvanlar genellikle ortak kavisli şekli sunmak yerine doğrudan plakaya uzanır. Dahası, felçli solucanların kafalarının etrafında bakterilerden temizlenmiş bir yama görülebilir.
  6. Kırbaçlama tahlilleri
    1. Boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetişen hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar ancak yumurtlama başlamadan önce 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanları yetiştirin.
    2. Hayvanların ekim sıcaklığında 100 μL M9 tamponu 96 kuyulu bir plakaya boru.
    3. M9 tampon içeren kuyulara kuyu başına bir tane olmak üzere ~15 solucan yerleştirin.
    4. Hayvanların 5 dakika boyunca ayarlanmasına izin verin.
    5. Stereomikroskop altındaki her hayvanı inceleyin, 15 s'yi geri sayan bir zamanlayıcı başlatın ve her hayvanın bu zaman diliminde gerçekleştirdiği vücut bükümlerinin sayısını sayın. Sayılan değerler, gövde bükümlerine min başına normalleştirilebilir. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterilerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın.
      NOT: Bu hareketlilik tahlili çok hassastır ve tedaviler arasındaki çok hafif farklılıkları tespit edebilir. Bununla birlikte, sıvıdaki hareketlilik ve agar üzerindeki hareketlilik farklılık gösterebilir.

5. Protein devrilmesinin doğrulanması

  1. 250-300 senkronize yumurtayı ilgili dsRNA ifade eden veya boş vektör içeren (L4440) bakterilerle tohumlanmış 60 mm NGM-RNAi plaka üzerine yerleştirin.
    NOT: RNAi nakavt, embriyoların anormal birikmesine, embriyo eksikliğine veya gen ekspresyonını etkileyebilecek gelişimsel arreste neden olabilir. İncelenecek hayvanların yaşı belirlenirken bu göz önünde bulundurulmalıdır.
  2. 1. gün yetişkinler için, 15 ° C'de 4,5 gün, 20 ° C'de 3 gün veya 25 ° C'de 2 gün hayvan yetiştirin.
  3. Toplam 200 genç yetişkin hayvanı 200 μL PBS-T ile 1,5 mL tüp dolgusunun kapağına alın ve aktarın.
    NOT: Sıcaklığa duyarlı hayvanlar veya refakatçi mutantları kullanırken, protokolde kullanılan tamponların hayvanların ekim sıcaklığında tutulması en iyisidir.
  4. Kapağı dikkatlice kapatın ve 1 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.
  5. 800 μL PBS-T (Tablo 1) ve santrifüjü 1 dakika boyunca 1.000 x g'da ekleyin.
  6. Üst 900 μL'yi dikkatlice çıkarın.
  7. 5.4-5.6 arası adımları üç kez yineleyin.
  8. 900 μL'yi çıkarın, 200 solucanı içeren 100 μL çözelti bırakın.
  9. 25 μL 5x numune tamponu ekleyin (Tablo 1).
  10. 1000 rpm'de sallanırken numuneleri 92°C'de 10 dakika ısıtın. Numuneler daha sonra dondurulabilir ve -20 °C'de tutulabilir.
  11. Her numunenin 20 μL'liğini yükleyin ve bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın.
  12. Proteinin bağıl stabilitesini belirlemek için uygun antikorları kullanarak batı leke analizi yapın.
  13. Serbestçe kullanılabilen ImageJ jel modülü gibi densitometrik yazılımı kullanarak bantların yoğunluğunu belirleyin. Tüm değerleri denetim örneklerinde ölçülen değerlere normalleştirin.
    NOT: Ekranlarımızda RNAi nakavtının amacı, belirli bir refakatçinin/yardımcı refakatçinin protein seviyelerini düşürmektir. Bu nedenle, RNAi nakavtının verimliliğini değerlendirmenin en iyi yolu batı leke analizidir. Bu spesifik antikorlar gerektirir. Alternatif olarak, qPCR mRNA düzeylerini ölçmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UNC-45'te sıcaklığa duyarlı mutasyonların kullanılması, izin verilen veya kısıtlayıcı koşullar altında etkileşimlerin ağırlaştırılması veya hafifletilmesini taramak için
Kas montajı ve bakımı, dokuya özgü refakatçi etkileşimlerini incelemek için etkili bir sistem sunar. Kasıt kaslarının fonksiyonel birimi olan sarkom, yapısal ve düzenleyici proteinlerin kristal benzeri bir düzenlemesini sunar. Motor protein miyozinin stabilitesi ve kas kas sarkomlarının kalın filamentlerine dahil edilmesi, refakatçilerin ve UPS bileşenlerinin işbirliğine bağlıdır30. Bu tür bir refakatçiye örnek, esas olarak vücut duvar kası 31 , 32 ,33 , 34,35ile ifade edilen korunmuş ve özel miyozin refakatçisi UNC-45'tir. UNC-45'teki mutasyonların C'demiyozin dağınıklığına ve ciddi hareketlilik kusurlarına neden olduğu gösterilmiştir. elegans31,36. UNC-45 tandem modülleri, UNC-45, HSP-90 ve HSP-1 ile miyozin filament derlemesi25,36 ,37,38'dekidiğer refakatçiler ve yardımcı refakatçiler arasında işbirliğini zorlayan çok siteli bir yerleştirme platformu37'yemonte edilir. Bilinen UNC-45 etkileşimlerini doğrulamak ve kas proteostazındaki yeni genetik etkileşimleri tanımlamak için, dokuya özgü refakatçi etkileşimi taraması19,25 için hassas bir genetik arka plan olarak C. elegans sıcaklığa duyarlı unc-45 mutasyonlarını kullanarak bir strateji oluşturduk.

C. elegans UNC-45'te (sırasıyla e286 ve m94 alellerine karşılık gelen L822F ve E781K) tek amino asit ikameleri; unc-45(ts)) etkilenen hayvanlar kısıtlayıcı koşullar altında (>22 °C) yetiştirildiğinde sıcaklığa bağlı hareketlilik kusurlarından ve miyosin disorganizasyon fenotiplerinden sorumludur. Buna karşılık, bu unc-45(ts) mutantlar izin verilen sıcaklıkta (15 °C)31hareket veya miyozin organizasyon kusuru göstermez. Önerilen yaklaşımda, ilk larva aşamasında (L1) yaş senkronize unc-45(e286) hayvanlar RNAi (97 gen) tarafından farklı moleküler refakatçilerin tükendiği ve daha sonra izin verilen koşullar altında (15 °C) hareketlilik kusurları için izlendiği(Şekil 1). Unc-45 ve HSP-90 proteinlerinin genetik etkileşim ekranımızda bilinen etkileşimini doğruladık ve unc-45(ts) mutant hayvanlarda sentetik hareket kusuru olduğu gibi, ancak vahşi tip hayvanlarda değil,25. Yerleşik immün boyama tekniklerini kullanarak miyotin ağır zinciri A'nın(MYO-3) hücre altı düzenini izleyerek sti-1- , ahsa-1- veya daf-41 ilişkilisentetik fenotiplerin miyotin dağınıklığı nedeniyle olup olmadığını incelemeye devam ettik39. Vahşi tip hayvanların sti-1, ahsa-1 veya daf-41 RNAi ile tedavisi miyofilasyon organizasyonunu etkilemezken, bu genlerin unc-45(e286) mutant hayvanlarda tükenmesi sarkoerik yapıların tamamen bozulmasına ve MYO-3 yanlış saptanmasına neden oldu, hatta izin verilen koşullar altında (15 °C). Bu etki, kısıtlayıcı sıcaklıkta (25 °C) 25 yetişen unc-45 (e286) tek mutantlarla görülenlerle karşılaştırılabilirdi. Bu sonuçlar başka bir unc-45(ts)-allele, yani unc-45(m94) mutant hayvanlar25kullanılarak doğrulandı.

UNC-45'in dengesini bozan refakatçileri tanımlamak için, RNAi'nin gen devrilmesine dayanarak 25 °C'de UNC-45 (286) hayvanların hareketliliğini artıran refakatçileri taradık. UNC-45(e286) mutant hayvanlar 25 °C'de ciddi hareket kusurları gösterirken, RNAi ile tedavi edilen hayvanların taranan 97 refakatçiden dördünü kodlayan genlere karşı hareketliliği önemli ölçüde iyileştirildi. Burada da unc-45(m94) mutant hayvanlar kullanılarak sonuçlar doğrulandı. Böylece, sıcaklığa duyarlı mutasyonların kullanılması, ekranın yürütüldüğü sıcaklığa bağlı olarak hem ağırlaştırıcı hem de hafifletici ekranlar kurmaya izin verir.

Ağırlaştırıcı etkileşimleri taramak için bir refakatçinin dokuya özgü aşırı ifadesini kullanma
Daha sonra tarama amacıyla kas refakatçi ağının hafif bir pertürbasyonu olarak tek bir refakatçinin dokuya özgü aşırı ekspresyonunu kullandık. Özellikle, biz C. elegans vücut duvar kasında (DNJ-24M)Hsp40 protein DNAJB6 C. elegans homolog kodlama vahşi tip dnj-24 aşırı ifade hayvanları kullandı. Yukarıda olduğu gibi, L1 DNJ-24M hayvanları farklı refakatçiler için RNAi ile tedavi edildi ve hareketlilik kusurları (20 °C) için izlendi(Şekil 1). DNJ-24M hayvanları kayda değer bir hareketlilik kusuru göstermezken, üç gen (incelenen 48 refakatçi genden; %6), yani hsp-1, rme-8ve dnj-8, özellikle DNJ-24M ifade eden hayvanların hareketliliğini etkiledi, ancak vahşi tip hayvanların hareketliliğini etkilemedi. Farklı bir refakatçiyi, yani HSP-90'ı kasta (HSP90M) aşırı ifade eden hayvanlar kullanarak isabetlerin özgüllüğünü test etmenin, hsp-1, rme-8veya dnj-8 RNAi tedavisi40üzerinde HSP90M hareketliliği üzerinde hiçbir etki göstermediği not edilir. Birlikte ele alındığında, metastable mutant proteinlerin ekspresyosu veya dokuya özgü aşırı ifade gibi refakatçi ağına hafif pertürbasyon kullanan tarama platformu, son derece spesifik bir vuruş oranına (normalde ~ % 5) neden oldu.

Dokuya özgü genetik etkileşimleri taramak için dokuya özgü RNAi kullanma
Dokuya özgü RNAi'ye duyarlı suşlar, dsRNA doğumu için bakteriyel beslemeyi kullanmaya devam ederken genlerin dokuya özgü devrilmesine izin verir. Bu suşlar, etkili gen susturma için gerekli RNAi yolunda önemli bir bileşen olan RDE-1 argonaute proteini içinmutanttır 21. Bununla birlikte, dokuya özgü bir promotörün kontrolü altında yabani tip RDE-1'i ifade etmek, dokuya özgü gen devrilmesine yol açtı41,42. Bu araç böylece UNC-45 veya DNAJ-24M gibi dokuya özgü refakatçiler kullanmadan genetik etkileşim ekranlarına izin verir. Örneğin, geliştirme sırasında vahşi tip hayvanlarda hsp-6 (mortalin) nakavt güçlü bir gelişimsel arreste neden oldu (RNAi ile tedavi edilen hayvanların% 96±1'i). Aynı zamanda, kaslarda yabani tip RDE-1'i ifade eden bir suşta hsp-6 nakavt gelişimsel arreste neden olmazken, bağırsak hücrelerinde vahşi tip RDE-1'i ifade etmek güçlü bir gelişimsel arrest fenotipi (%90±3; Şekil 2). Bu nedenle, normal gelişim için bağırsak hücrelerinde HSP-6 fonksiyonu gereklidir. HSP-6'da (mg585) hafif bir büyüme gecikmesine neden olan bir mutasyon, bu mutasyona uğramış geni bağırsaklara özgü bir RNAi suşuna geçirerek ve refakatçi RNAi kütüphanesini tarayarak refakatçi etkileşimlerini ağırlaştırma veya hafifletme için taranabilir.

Genetik etkileşimler kullanılarak katlanır ortamda yaşa bağlı değişikliklerin izlenmesi
Hayvanlar sarkolerik düzensizlik ile ilişkili hareketlilikte yaşa bağlı bir düşüş gösterir43,44,45. Protein katlama kapasitesindeki değişiklikler, hücresel proteostaz makinelerinin değiştirilmiş regülasyonu ve bileşimi ile çakışıyor28, UNC-45, CHN-1 ve UFD-2'nin değiştirilmiş seviyeleri de dahil olmak üzere, kas kalite kontrol makinelerinin proteinleri46. Buna göre, miyosin katlanması ve bozulması, yetişkinliğe geçişte proteostatik kapasitedeki değişikliklerden etkilenir47. Bu nedenle, bu tür değişikliklerin refakatçi etkileşimlerini etkileyip etkileyemeyeceğini sorduk. Örneğin, sti-1, ahsa-1 ve daf-41 nakavtlarının zaman içinde hareketlilik üzerindeki etkisini izledik. Sti-1-, ahsa-1- ve daf-41-RNAi tedavi edilen hayvanların larva gelişimi sırasında daha az hareketlilik göstermesine rağmen, unc-45(ts) yetişkin solucanlarında hareketliliğin güçlü bir şekilde azaldığını gördük. Ayrıca, unc-45(ts) mutant hayvanlarda MYO-3 organizasyonu sti-1, ahsa-1 veya daf-41 RNAi dördüncü larva aşamasında (L4) vahşi tip solucanlarınkine benzerdi, ancak mutantlar hayvanlar yetişkinliğe ulaştıktan sonra bozulmuş sarkomlar sergilediler (Şekil 3). Buna karşılık, hem unc-45(ts) mutant hayvanlar boş bir vektör kontrolü ile tedavi edildi hem de vahşi tip hayvanlar etkilenmedi (Şekil 3). Bu nedenle, yaş veya çevresel koşulların bir fonksiyonu olarak proteostaz dinamikleri27,45,46,48,49 refakatçi etkileşimlerini kritik derecede etkileyebilir.

Figure 1
Şekil 1: İlgi çekici bir refakatçiyi kodlayan bir gende mutasyon taşıyan C. elegans kullanılarak RNAi sentetik etkileşim ekranlarının kurulumu. (A) Hedeflenen refakatçi etkileşim ekranlarının temel kurulumunun şematik gösterimi. (B) İsaki doğrulama, başka bir refakatçi mutant kullanılarak genetik etkileşimin onaylanmasını ve RNAi nakavtının belirtilmesini gerektirir. (C-D) Hareketlilik kusurları gibi basit okumalar, sırasıyla felç veya hırpalama tahlilleri kullanılarak, etkileşimleri ağırlaştırıcı veya hafifletici belirlemek için ölçülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mitokondriyal refakatçi hsp-6'nın dokuya özgü RNAi'si bir dokudaki genetik etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. Yabani tip bağırsak ve kas spesifik RNAi suşları hsp-6 RNAi ile tedavi edildi ve (A) gelişimsel gecikme puanlandı veya (B) görüntüleri yetişkinliğin ilk gününde çekildi. Veriler SEM, N=6± ortalamadır. Ölçek çubuğu 1 mm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: RNAi'nin yaşa bağlı etkileri. (A) Yaşla birlikte hareketlilik. Yabani tip veya unc-45(e286) embriyoları 15 °C'de sti-1, ahsa-1 veya daf-41 RNAi tohumlu plakalara yerleştirildi ve her gelişim aşamasında, L1-L4, genç yetişkin ve yetişkinliğin 1. Veriler SEM, N=15 ± ortalamadır. (B) Vücut duvar kasının konfokal görüntüleri. Hayvanlar A'da olduğu gibi tedavi edildi ve L4'te, genç yetişkin ve yetişkinlik evrelerinin 1. gününde sabitlendi ve anti-MYO-3 antikorları ile immün lekelendi. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çözüm Hazırlık talimatları Depolama
1 M CaCl2 (1 L) 147,01 g CaCl2·2H2O ekle RT'de Mağaza
1 L'ye dH2O ekleyin
Otoklav veya filtre (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6.0 (1 L) Ekle 136.09 g KH2PO4 RT'de Mağaza
800 mL dH2O ekleyin
Çözünene kadar manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın
KOH kullanarak titrat pH
1 L'ye dH2O ekleyin
Otoklav veya filtre (0,22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) Ekle 248.58 g MgSO4·7H2O RT'de Mağaza
1 L'ye dH2O ekleyin
Otoklav veya filtre (0,22 μm)
Kolesterol çözeltisi (50 mL) 50 mL Falcon tüpüne 250 mg kolesterol ekleyin -20 °C'de depolayın
40 mL etanolde tamamen çözün
50 mL'ye etanol ekleyin
1 M IPTG (50 mL) 50 mL Falcon tüpe 11,9 g IPTG (izopropil-β-D-tiyogalactopyranoside) ekleyin -20 °C'de karanlıkta saklayın
40 mL dH2O'da tamamen çözün
50 mL'ye dH2O ekleyin
Filtre (0,22 μm), aliquot 1mL tüpler
Ampisilin stoğu (50 mL) 50 mL Falcon tüpüne 5 g ampisilin ekleyin -20 °C'de depolayın
40 mL dH2O'da tamamen çözün
50 mL'ye dH2O ekleyin
Filtre (0,22 μm), Eppendorf tüplerine 1 mL aliquot dağıtın
Tetrasiklin stoku (50 mL) 50 mL Falcon tüpüne 250 mg tetrasiklin ekleyin -20 °C'de depolayın
40 mL etanolde tamamen çözün
50 mL'ye etanol ekleyin
Aliquot 1 mL tüpler
M9 arabelleği (1 L) 5.8 g Na2HPO4·7H2O Ekle RT'de Mağaza
3 g KH2PO4 Ekle
5 g NaCl Ekle
Ekle 0.25 g MgSO4·7H2O
1 L'ye dH2O ekleyin
Filtre (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 L) 8 g NaCl ekleyin RT'de Mağaza
200 mg KCl ekle
1,44 g Na2HPO4·7H2O ekle
Ekle 240 mg KH2PO4
800 mL dH2O'da tamamen çözün
KOH tp pH 7.4 kullanarak titrat pH
500 μL Ara-20 ekleyin
1 L'ye dH2O ekleyin
5x örnek arabellek 6,8 mL dH2O ekleyin -20 °C'de depolayın
2 mL 0,5M Tris pH 6,8 ekleyin
3.2 mL Gliserol Ekle
1,6 mL %20 SDS ekleyin
0.8 mL ß-mercaptoethanol ekle
%1 bromofenol mavisi

Tablo 1: Çözüm Tarifleri

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Proteostaz ağının nasıl düzenlendiğini ve farklı metazoan hücre ve dokularda nasıl çalıştığını yansıtan entegre bir resmi eksik kalır. Bu eksikliği gidermek için, gelişim ve yaşlanma sırasında belirli dokularda moleküler refakatçiler gibi bu ağın çeşitli bileşenlerinin etkileşimleri hakkında özel bilgiler gereklidir. Burada, dokuya özgü pertürbasyonların kullanımının belirli bir dokudaki refakatçi ağını incelememizi nasıl sağladığını gösterdik. Dokuya özgü refakatçi genetik etkileşimlerini araştırmak için üç farklı yaklaşım göz önünde bulunduruldu. İlk yaklaşımda, kas hücrelerinde yüksek oranda ifade edilen bir refakatçi olan UNC-45, besleme-RNAi25aracılığıyla refakatçi etkileşimlerini taramak için kullanıldı. Özel bir refakatçinin kullanımı doku özgüllüğünün ayırt edilebilir olmasına izin verirken, yalnızca katkıda bulunduğu yüksek odaklı alt ağ hakkında rapor verebilir. Çoğu C. elegans nöronunun beslenme tabanlı RNAi doğum50'ye karşı dirençli olduğunu ve bu nedenle nöronal hücrelerdeki genetik etkileşimleri tanımlamak için bu yaklaşımın kullanılmasının RNAi ile geliştirilmiş bir suşla incelenen mutant refakatçiyi geçmeyi gerektirdiğini unutmayın51. İkinci bir yaklaşımda, kastaki bir refakatçinin aşırı ekspresyonunu sürmek ve böylece özellikle kas katlama ortamını etkilemek için dokuya özgü bir promotör kullanıldı40. Bununla birlikte, tek bir refakatçiyi aşırı ifade etmek genellikle katlanır ortama ve dolayısıyla iki refakatçinin birlikte neden olduğu maske bozulmasına faydalı olabilir. Üçüncü yaklaşım, belirli bir dokudaki refakatçi etkileşimlerini incelemek için dokuya özgü RNAi nakavt41'edayanıyordu. Bu yaklaşımın bir avantajı, beslenme yoluyla RNAi doğumuna dirençli nöronal hücrelerin hedeflenerek hedeflenerek42. Yine de, bu yaklaşım hafif bir mutantın (uzman olmasa da) kullanılmasını ve bu mutantın dokuya özgü bir rde-1 kurtarma geni taşıyan bir rde-1 boş mutantına geçmesini gerektirir. Daha da önemlisi, bu yaklaşımlar tek bir dokuda ve hatta tek bir hücrede chaperone fonksiyonunu modüle etmek için birleştirilebilir.

Kalite kontrol makineleri, proteostazı perturbing ederek birçok gen ürününün işlevini etkileyebilir. Bu, kalite kontrol ağını keşfetmek için genetik etkileşimleri kullanırken büyük bir zorluktur18. Örneğin, yaşlanmada toplama eğilimli proteinlerin veya proteostaz çöküşünün kronik ekspresyonu, C. elegans ve maya45 , 52,53'tebirçok ilgisiz metastable proteinin fenotipik ağırlaşmasına neden oldu. Ayrıca, memeli hücrelerinde clathrin aracılı endositoz, Hsc70'in protein agregalarına fonksiyonel olarak inzyonu üzerine inhibe edildi. Yine de, endositozun Hsc70 aşırı ekspresyonu ile kurtarılabileceği, toplamanın ise54,55. Aynı şekilde, Drosophila'da ısı şoku tepkisinin düzenleyicilerini ortaya çıkarmak için tasarlanmış genetik bir ekran, uçuş kası aktisinde ısı şoku tepkisini titizlikle aktive eden bir yanlış algı mutasyonu tanımladı56. Birlikte ele alındığında, proteostaz ağının pertürbasyonu metastable proteinleri açığa çıkarabilir veya sonuç özgüllüğünü etkileyebilecek strese neden olabilir. Bununla birlikte, genetik etkileşimleri analiz etmek son derece spesifik ve işlevsel içgörüler sağlayabilir. Örneğin, endoplazmik retikülünde katlama için gerekli maya genlerinin epistatik analizleri, moleküler refakatçiler arasında daha sonra doğrulanan spesifik genetik etkileşimleri tanımlamıştır19. Aynı şekilde, iki toplama eğilimli modelin toksisitesini artıran refakatçiler için ağırlaştırıcı bir ekran (hareketlilik ile ölçüldüğü gibi), insan hücrelerinde Huntingtin toplamasını etkileyen ortologların belirli bir alt kümesini tanımladı26. Burada, proteostaz ağının çeşitli pertürbasyonlarının belirli ve işlevsel refakatçi etkileşimlerini ortaya çıkarabileceğini gösterdik.

RNAi besleme tabanlı genetik etkileşim ekranlarını kullanmanın temel avantajı, yöntemin göreceli basitliğidir. Hareketlilik gibi genel bir davranışsal çıktı kullanmak bile yeni genetik etkileşimleri ortaya çıkarabilir (Şekil 3). Bununla birlikte, ifadenin değişkenliği ve kısmi etkileri, sonuçların sağlamlığını ve özgüllüğünü sınırlayabilir57. Ayrıca, genetik etkileşimler fiziksel etkileşimlerin göstergesi değildir ve iki gen arasındaki ilişki bu nedenle dolaylı olabilir. Etkileşimlerin doğasını keşfetmek ve spesifik olmayan etkileşimleri atmak zaman alıcı olabilir57,58,59. Bu, ekran kurulumunda ve doğrulamasında ele alınması gereken bir endişedir. Örneğin, genetik taramada boş alellerin kullanılması, bu genlerin belirli bir biyolojik süreçte aynı veya farklı yollarda çalışıp çalışmadığını belirlemeye izin verir. Bununla birlikte, kısmi gen fonksiyon kaybı, sıcaklığa duyarlı aleller gibi hipomorfik aleller veya RNAi'ye bağımlı ifadenin aşağı regülasyonu kullanılarak, genlerin aynı veya paralel yollarda hareket edip etmediğine bakılmaksızın fenotipleri ağırlaştırabilecek veya hafifletebilecek artık aktivitelerle sonuçlanır59. Bu nedenle, herhangi bir etkileşimin doğası daha fazla analiz gerektirir. Bununla birlikte, hipomorfik aleller ve RNAi kullanarak, aynı protein kompleksindeki veya yolundaki veya gereksiz bir yol59'dakigenler de dahil olmak üzere çok çeşitli etkileşimcileri tanımlayabilir. Olası etkileşimlerin bu daha geniş kapsamı genetik bir ekranda daha fazla isabet sağlayabilirken, örneğin proteostaz çökmesinde sıcaklığa duyarlı alellerin spesifik olmayan maruziyeti gibi spesifik olmayan etkileşimlere de yol açabilir45,53.

İsat doğrulama ve spesifik olmayan etkileşimler çeşitli şekillerde incelenebilir. İsabet sayısı düşük olmalıdır. Örneğin, unc-45 mutant arka plandaki refakatçi ifadesinin aşağı regülasyonu, çoğu refakat geni aşağı regülasyonunun hareketlilik üzerinde herhangi bir etki göstermemesiyle birlikte küçük bir isabet yüzdesi (%4) ile sonuçlandı. Benzer bir oran DNJ-24M aşırı ifade edildiğinde de gözlendi (%6). Yukarıda belirtildiği gibi, toplama eğilimli proteinlerle refakatçi etkileşimleri için bir ekran, taranmış 219'un 18 refakatçisi (%8) tanımladı.

Birkaç mutant alel, aşırı ekspresyon çizgileri veya hastalık modelleri kullanılmalıdır. Refakatçi fonksiyonu üzerinde farklı etkileri olan farklı mutant alellerin yanı sıra farklı genetik geçmişlere sahip farklı suşların kullanılması, herhangi bir ekran isabetinin özgüllüğünü destekleyebilir. Alternatif olarak, benzer pertürbasyona yol açmayan farklı bir refakatçinin mutasyonu veya aşırı ekspresyosu kullanmak olumsuz bir kontrol görevi görebilebilir. Örneğin, hem unc-45(e286) hem de unc-45(m94) sti-1, ahsa-1 veya daf-41 aşağı regüle edildiğinde ağırlaştırıcı davranışlar gösterdi. Ayrıca, ahsa-1 (ok3501) silme mutantını taşıyan hayvanlar hsp-90 RNAi25ile tedavi edildiğinde benzer bir etkileşim gözlenmiştir.

Refakatçi vuruşlarının kimliği ve bilinen etkileşimleri incelenmelidir. Örneğin, unc-45 ağırlaştırıcı ekranda tanımlanan refakatçiler, HSP-90 ATPase döngüsü için gereken, bir istemci işe alım uzmanını (STI-1), bir tadilat yardımcı refakatçisini (AHSA-1) ve bir istemci olgunlaşma yardımcı refakatçisini (DAF-41) kodlayanlar da dahil olmak üzere son derece spesifik bir refakatçi kümesidir. Aslında, bu yardımcı refakatçi seti tam bir HSP-90 katlama döngüsüoluşturur 60. Aynı şekilde, bir DNJ-24M ekranı HSP-1'i tanımladı, Hsp40s40'ınana refakatçi ortağı .

Hayvanın ömrü üzerindeki etkileşimlerdeki değişiklikler de incelenmelidir. Örneğin, unc-45 ağırlaştırıcı ekranda tanımlanan refakatçiler yetişkinlikte hareketliliği ve miyozin organizasyonuni güçlü bir şekilde etkilemiş, ancak gelişim sırasında daha hafif bir etkiye sahipti. Bunun nedeni yetişkinlik28'de proteostaz ağında meydana gelen değişiklikler veya miyo-fiber katlama ve bakım arasındaki miyosin katlama gereksinimlerindeki değişiklikler olabilir.

Proteinler arasındaki etkileşimleri ve hücredeki lokalizasyonlarını doğrudan incelemek için tamamlayıcı biyokimyasal yaklaşımları kullanın. Örneğin, HSP-90 yardımcı refakatçileri, STI-1, AHSA-1 ve DAF-41, myosin25ile etkileşime girdikleri sarkağa yerelleştirilir.

C. elegans, kalite kontrolünü izlemek için iyi kurulmuş bir metazoan modelidir. Hücre biyolojisi, biyokimyasal ve genetik yaklaşımların değişken bir araç seti kullanılarak hücresel ve organizmasal proteostazları izlemek için sıklıkla kullanılır. Burada, gelişim ve yaşlanma sırasında canlı bir hayvandaki refakatçi etkileşimlerini izlemek için genetik tarama yaklaşımlarını ve mevcut araçlar57 , 58 , 59, mutant bankası, mevcut RNAi kütüphaneleri22, 23 ve dokuya özgü RNAi suşları 41,42' yi kullandık. Hareketlilik gibi basit davranışsal tahlillerin kullanılması, yeni genetik etkileşimleri keşfetmek için birçok olası gen çiftinin ekranını basitleştirir. Bu daha sonra, potansiyel etkileşimlerini makinesel olarak vivo ve in vitro olarak incelemek için biyokimyasal araçları kullanarak refakatçi lokalizasyonunu ve fiziksel etkileşimleri daha fazla keşfetmek için bir platform görevi görebilirsiniz. Burada açıklanan protokol, C. elegans vücut duvar kası25,40'ta yeni refakatçi etkileşimlerini tanımlamak içinbaşarıylakullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne bazı nematod suşları için teşekkür ederiz. H.F. Epstein tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası'ndan elde edildi. Bu araştırma İsrail Bilim Vakfı'nın (278/18 sayılı hibesi) ve İsrail Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ile Dışişleri ve Uluslararası İşbirliği Bakanlığı, Ülke Tanıtım Genel Müdürlüğü, İtalya Cumhuriyeti'nin (3-14337 sayılı hibe) hibesi ile desteklendi. Ben-Zvi laboratuvarı üyelerine bu makalenin hazırlanmasında yardımcı olanlara teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Biyoloji Sayı 160 Caenorhabditis elegans,refakatçi genetik etkileşimler proteostaz RNAi ekran sıcaklığa duyarlı
Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için <em>Caenorhabditis elegans'ı</em> Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter