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Biology

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Abstract

A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.

Introduction

As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)8 ou pelo maquinário de autofagia9 em colaboração com acompanhantes10,11,12. A homeostase proteica (proteostase) é, portanto, mantida por redes de controle de qualidade compostas por máquinas dobráveis e degradantes3,13. No entanto, entender as interações entre os diversos componentes da rede de proteostasis in vivo é um grande desafio. Enquanto as telas de interação proteína-proteína contribuem com informações importantes sobre interações físicas e complexos de acompanhantes14,15, falta compreender a organização e mecanismos compensatórios dentro de redes de acompanhantes específicas do tecido in vivo.

As interações genéticas são frequentemente usadas como uma ferramenta poderosa para examinar a relação entre pares de genes que estão envolvidos em vias biológicas comuns ou compensatórias16,17,18. Tais relações podem ser medidas combinando pares de mutações e quantificando o impacto de uma mutação em um gene sobre a gravidade fenotípica causada por uma mutação no segundo gene16. Embora a maioria dessas combinações não demonstre efeito em termos de fenótipo, algumas interações genéticas podem agravar ou aliviar a gravidade do fenótipo medido. Mutações agravantes são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é mais grave do que o fenótipo esperado visto ao combinar os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes funcionam em caminhos paralelos, afetando juntos uma determinada função. Em contraste, mutações aliviadas são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é menos grave do que o fenótipo visto com os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes agem juntos como um complexo ou participam da mesma via16,18. Assim, diversos fenótipos que podem ser quantificados, incluindo fenótipos amplos, como letalidade, taxas de crescimento e tamanho de ninhadas, bem como fenótipos específicos, como repórteres transcricionais, têm sido usados para identificar interações genéticas. Por exemplo, Jonikas et al. contaram com um repórter de estresse do PS para examinar as interações do Saccharomyces cerevisiae ER desdobrado rede de proteostase de resposta à proteína usando análises de exclusão genética de pairwise19.

As telas de interação genética envolvem cruzar sistematicamente mutações de exclusão pares para gerar um conjunto abrangente de mutantes duplos20. No entanto, em modelos animais, e especificamente em C. elegans,essa abordagem em larga escala não é viável. Em vez disso, cepas mutantes podem ser testadas para seus padrões de interação genética através da expressão genética de baixa regulação usando a interferência de RNA (RNAi)21. C. elegans é um poderoso sistema para telas baseados em RNAi22,23. Em C. elegans,a entrega de RNA (dsRNA) de duplar encalha é alcançada pela alimentação bacteriana, levando à disseminação de moléculas de dsRNA para numerosos tecidos. Dessa forma, as moléculas de dsRNA introduzidas impactam o animal através de um procedimento rápido e simples21. Uma tela de interação genética usando RNAi pode, portanto, revelar o impacto da regulação de um conjunto de genes ou da maioria dos genes codificadores C. elegans usando bibliotecas RNAi24. Em tal tela, hits que impactam o comportamento do mutante de interesse, mas não a cepa do tipo selvagem são modificadores potenciais do fenótipo sendomonitorados 25. Aqui, aplicamos uma combinação de mutações e triagem RNAi para mapear sistematicamente interações de acompanhantes específicas de tecidos em C. elegans.

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Protocol

1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi

  1. A uma garrafa de 1 L, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de ágar e água destilada até 1 L e autoclave.
  2. Frie a 55 °C.
  3. Adicione 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4e 1 mL de solução decolesterol (Tabela 1) para fazer mídia de crescimento nematode (NGM).
  4. Adicione 1 mL de ampicilina (100 mg/mL) e 0,5 mL de 1 M IPTG(Tabela 1) para fazer a solução NGM-RNAi.
    NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli comumente utilizadas contêm uma polimerase de DNA T7 indutível pelo IPTG usada para expressar os plasmídeos codificadores de dsRNA. Estes plasmídeos também codificam para resistência à ampicilina.
  5. Misture a solução quente girando a garrafa.
  6. No capô ou usando procedimentos estéreis, despeje a solução NGM em placas ou usando uma bomba peristáltica, dispense a solução em placas. Use placas de 6 poços, 12, 40 mm ou 60 mm para esta tela. O ágar deve encher cerca de 2/3 da profundidade da placa.
  7. Deixe as placas secarem durante a noite no banco em temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas. As placas de NGM para RNAi podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.

2. Cultivar bactérias RNAi e semear as placas

  1. No capô ou utilizando procedimentos estéreis, adicione 1 mL de ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL de tetraciclina (5 mg/mL)(Tabela 1) a uma solução e mistura pré-autoclaved 1 L de LB.
    NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli são resistentes à tetraciclina.
  2. No capô ou usando procedimentos estéreis, adicione 600 μL de solução LB a cada poço em placas estéreis de 2 mL de profundidade. É melhor usar um pipet multicanal para dispensar a mídia.
  3. Usando procedimentos estéreis, inoculam poços com bactérias HT115(DE3) E. coli transformadas com um plasmídeo codificador de dsRNA visando um gene de interesse ou um plasmídeo vazio, como controle. Cubra as placas e incubar a 37 °C durante a noite. Bibliotecas que consistem em clones bacterianos expressando dsRNA, correspondendo a ~94% dos genes C. elegans previstos foram previamente construídos22,23 e estão comercialmente disponíveis. A biblioteca de acompanhantes utilizada aqui foi construída pelo Laboratório Dr. Richard Morimoto26.
  4. Utilizando procedimentos estéreis, sementes 75, 150 ou 250 μL de bactérias nas placas de 12 poços, 40 mm e 6-well ou 60 mm NGM RNAi, respectivamente. Marque claramente o nome do gene alvo na placa. As bactérias devem cobrir 30-50% da superfície do ágar e não devem tocar nas bordas da placa.
  5. Deixe as placas secarem por pelo menos 2 dias no banco à temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas.
    NOTA: As placas podem ser incubadas a 37 °C durante a noite. Certifique-se de que os poços internos estão secos antes de usar ou armazenar as placas. Para todos os fins de longo prazo (ou seja, secagem ou armazenamento) mantenha as placas no escuro. As placas secas e semeadas podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.

3. Sincronização não estressante de embriões

  1. Use uma picareta de vermes para mover cerca de 100 ovos de uma placa de vermes não sincronizada para uma placa de NGM recém-semeada.
  2. Cultivar animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Os animais devem chegar ao primeiro dia de colocação de ovos.
    NOTA: Os vermes são comumente cultivados a 20 °C. No entanto, diferentes cepas mutantes de acompanhantes podem exigir temperaturas específicas de cultivo. Por exemplo, muitas cepas sensíveis à temperatura são cultivadas a 15 °C, mas deslocadas para 25 °C para expor seu fenótipo.
  3. Adicione 1 mL de tampão M9(Tabela 1)lentamente e longe do gramado bacteriano. Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa.
    NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.
  4. Repita o passo 3.3 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.
  5. Usando uma ponta de plástico padrão, corte um quadrado de ágar da placa lavada onde os ovos estão concentrados e coloque o pedaço de ágar em uma placa de NGM recém-semeada.
    NOTA: ~200 ovos são necessários para produzir animais suficientes que pomentem ovos; muitos animais consomem as bactérias muito rapidamente. Baixos níveis de alimentos podem impactar a proteostase27.
  6. Cultive os animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Neste ponto, as placas devem ser cobertas com ovos sincronizados.
    NOTA: Os animais podem ser deslocados para uma nova placa por uma curta duração para uma sincronização mais rigorosa. No entanto, é importante usar apenas adultos nos estágios iniciais da colocação de ovos, pois os animais podem reter ovos em seu útero impactando a sincronização.
  7. Adicione 1 mL de tampão M9 lentamente e longe do gramado bacteriano.
  8. Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa.
  9. Repita o passo 3,7 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.
  10. Adicione 1 mL de tampão M9 e use um raspador de células para liberar os ovos da placa.
  11. Colete o tampão M9 contendo os ovos das placas.
  12. Centrifugar o tampão M9 contendo os ovos a 3.000 x g por 2 min.
  13. Remova o supernatante e adicione o tampão M9 para atingir um volume de 1 mL.
  14. Resuspenda os ovos para interromper quaisquer pedaços de ovos e bactérias.
  15. Repita o procedimento de lavagem descrito nas etapas 3.11-3.13 cinco vezes. A pelota de ovo deve parecer branca. Se ainda estiver amarelo/marrom, repita a lavagem até que uma pelota branca seja atingida.
    NOTA: Bactérias que permanecem nos ovos podem contaminar as bactérias que expressam dsRNA.
  16. Remova a maior parte do supernatante, deixando cerca de 200 μL. Ovos sincronizados podem ser usados para telas RNAi.

4. Ensaios fenotípicos comuns

  1. Cultivo de animais durante experimentos
    1. Coloque uma gota de ~30 ovos perto do gramado bacteriano em cada prato semeado rnai. Para referência, coloque também ~30 ovos em placas semeadas com bactérias contendo vetores vazios (L4440).
    2. Cultivar animais sincronizados com a idade em placas semeadas por NGM RNAi. A duração do experimento dependerá do estágio em que os animais devem ser monitorados e da temperatura do cultivo. Ajuste a temperatura do cultivo ao usar animais mutantes sensíveis à temperatura. Ajuste a duração do cultivo ao usar animais mutantes atrasados em desenvolvimento.
      NOTA: Embora o tempo possa variar, uma vez que os animais atingem a idade adulta, a colocação de ovos (e o consequente consumo rápido de alimentos), bem como o colapso da proteose dependente da idade28,podem impactar os resultados. Recomenda-se, portanto, pontuar animais antes do início da colocação de ovos (dia 1 da idade adulta). Animais do tipo selvagem chegam a esta fase após 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.
    3. O número de repetições utilizadas dependerá do tamanho do conjunto genético examinado. Para a biblioteca de acompanhantes (97 genes), repita experimentos pelo menos quatro vezes. O tamanho da população depende do ensaio utilizado. Nos ensaios comportamentais aqui discutidos, escore >15 animais por condição experimental em cada repetição. Os dados e análises estatísticas também dependem fortemente do tipo de ensaio utilizado. Os dados nos ensaios aqui discutidos podem ser apresentados como meios ± SEM.
    4. Compare os animais tratados com controle de vetores RNAi e vazios como populações independentes. Os valores P podem ser calculados utilizando-se ANOVA unidirecional ou bidirecional, dependendo das alterações examinadas, ou seja, agravando ou aliviando sozinho ou ambos. Ao examinar um único tratamento RNAi versus controle, os valores P podem ser calculados usando um teste de soma de classificação mann-whitney de uma forma ou de duas vias. Além da significância estatística, considere um limiar para acertos com base no grau de impacto no fenótipo.
  2. Prisão/atraso do desenvolvimento
    1. Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.
    2. Monitore animais usando um estereótipo e conte o número de larvas e adultos para pontuar a porcentagem de animais atrasados no desenvolvimento. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios. hsp-1 ou hsp-90 RNAi tratamento resulta em detenção de desenvolvimento de animais do tipo selvagem e pode ser usado como um controle positivo.
    3. Para pontuar o percentual de animais atrasados ao longo do tempo, repita a etapa 4.2.2.
      NOTA: Se houver adultos que poem ovos na placa, transfira os animais atrasados em desenvolvimento para uma nova placa NGM-RNAi rotulada para o mesmo gene alvo para evitar confusão com prole.
  3. Defeitos de esterilidade ou de colocação de ovos
    1. Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores comecem a colocar ovos.
    2. Monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais sem ovos visíveis em seu útero. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores.
    3. Alternativamente, monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais com útero cheio de ovos, definido como fenótipo defeituoso de EGg (Egl-d)29.
  4. Letalidade embrionária
    1. Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais comecem a colocar ovos.
    2. Transfira ~100 ovos para um prato vazio. Espalhe os ovos em fileiras para simplificar a contagem.
    3. Marque a porcentagem de ovos não esquecidos na placa após 24-48 horas. Para referência, compare-se aos ovos de animais tratados com bactérias vazias de controle de vetores.
  5. Ensaio de paralisia
    1. Para adultos do primeiro dia, cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.
    2. Desenhe uma linha na parte de trás de uma placa de ágar NGM regular usando um marcador fino.
    3. Coloque 5-10 animais na linha marcada.
    4. Estabeleça um temporizador e espere por 10 minutos.
    5. Marque a porcentagem de animais que permanecem na linha como vermes paralisados. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores. Animais do tipo selvagem tratados com unc-45 RNAi apresentam fenótipo de paralisia grave e podem ser usados como controle positivo.
      NOTA: Este ensaio destaca animais com paralisia média a grave. Esses animais geralmente ficam retos na placa, em vez de apresentar a forma curva comum. Além disso, um remendo limpo de bactérias é visível ao redor das cabeças de vermes paralisados.
  6. Ensaio de espancamento
    1. Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação de ovos.
    2. Pipet 100 μL de tampão M9 na temperatura de cultivo dos animais em uma placa de 96 poços.
    3. Coloque ~15 worms, um por poço, nos poços contendo tampão M9.
    4. Deixe os animais se ajustarem por 5 minutos.
    5. Examine cada animal sob o estereótipo, inicie um temporizador contando 15 s, e conte o número de curvas corporais que cada animal realiza nesse período de tempo. Os valores contados podem ser normalizados para dobras corporais por minuto. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores.
      NOTA: Este ensaio de motilidade é muito sensível e pode detectar diferenças muito leves entre os tratamentos. No entanto, a motilidade em líquido e motilidade no ágar pode diferir.

5. Validação do knockdown de proteínas

  1. Coloque 250-300 ovos sincronizados em uma placa NGM-RNAi de 60 mm semeada com as bactérias relevantes que expressam dsRNA ou esvaziam as bactérias contendo vetores (L4440).
    NOTA: O knockdown rnai pode resultar em acúmulo aberrante de embriões, na falta de embriões ou em prisão de desenvolvimento que poderia impactar a expressão genética. Isso deve ser considerado ao determinar a idade dos animais a serem examinados.
  2. Para o dia 1 adultos, cultivar animais por 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.
  3. Escolha e transfira um total de 200 animais adultos jovens para a tampa de um tubo de 1,5 mL com 200 μL de PBS-T.
    NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.
  4. Feche a tampa cuidadosamente e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.
  5. Adicione 800 μL de PBS-T (Tabela 1) e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.
  6. Remova cuidadosamente a parte superior de 900 μL.
  7. Repita as etapas 5.4-5.6 três vezes.
  8. Remova 900 μL, deixando 100 μL de solução contendo os 200 worms.
  9. Adicione 25 μL de tampão de amostra de 5x(Tabela 1).
  10. Aqueça as amostras por 10 min a 92°C enquanto treme a 1000 rpm. As amostras podem então ser congeladas e mantidas a -20 °C.
  11. Carregue 20 μL de cada amostra e execute em um gel SDS-PAGE.
  12. Realize a análise de manchas ocidentais usando anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína.
  13. Determine a intensidade das bandas usando software densitométrico, como o módulo de gel ImageJ livremente disponível. Normalize todos os valores para aqueles medidos na amostra de controle(s).
    NOTA: O objetivo do knockdown RNAi em nossas telas é diminuir os níveis proteicos de um acompanhante/co-acompanhante específico. Assim, a melhor maneira de avaliar a eficiência do knockdown rnai é pela análise de manchas ocidentais. Isso requer anticorpos específicos. Alternativamente, o qPCR pode ser usado para quantificar os níveis de mRNA.

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Representative Results

Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamente
A montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos espessos de sarcomeres musculares contratuais depende da cooperação de acompanhantes e componentes ups30. Um exemplo de um desses acompanhantes é a mísamia conservada e especializada acompanhante UNC-45 que é expressa principalmente no músculo da parede corporal31,32,33,34,35. Mutações no UNC-45 têm sido demonstradas para induzir a desorganização da miosina e defeitos graves de motilidade em C. elegans31,36. Os módulos tandem UNC-45 se reúnem em uma plataforma de acoplamento multi-local37 que reforça a colaboração entre UNC-45, HSP-90 e HSP-1 e provavelmente outros acompanhantes e co-acompanhantes na montagem de filamentos de miosina25,36,37,38. Para confirmar as interações conhecidas do UNC-45 e identificar novas interações genéticas na proteostase muscular, estabelecemos uma estratégia usando mutações unc-45 sensíveis à temperatura de C. elegans como um fundo genético sensibilizado para o rastreamento de interação de acompanhantes específicos do tecido19,25.

Substituições de aminoácidos únicos em C. elegans UNC-45 (L822F e E781K, correspondentes aos alelos e286 e m94, respectivamente; unc-45(ts)) são responsáveis por defeitos de motilidade dependentes da temperatura e fenótipos de desorganização da mosina quando os animais afetados são cultivados em condições restritivas (>22 °C). Em contraste, esses mutantes unc-45(ts) não mostram defeitos de movimento ou organização de miosina na temperatura permissiva (15 °C)31. Na abordagem proposta, os animais unc-45(e286) sincronizados por idade no primeiro estágio larval (L1) foram esgotados de diferentes acompanhantes moleculares pela RNAi (97 genes) e, em seguida, monitorados por defeitos de motilidade sob condições permissivas (15 °C)(Figura 1). Confirmamos a interação conhecida das proteínas UNC-45 e HSP-90 em nossa tela de interações genéticas e identificamos três co-acompanhantes hsp-90, sti-1, ahsa-1 e daf-41,como especificamente causando um defeito de movimento sintético em animais mutantes unc-45(ts), mas não em animais do tipo selvagem25. Passamos a examinar se os fenótipos sintéticos associadosà miosinaforam causados pela desorganização da miosina, monitorando o arranjo subcelular da cadeia pesada de miosina A (MYO-3), utilizando técnicas de imuno-coloração estabelecidas39. Considerando que o tratamento de animais do tipo selvagem com sti-1, ahsa-1 ou daf-41 RNAi não afetou a organização do miofilamento, o esgotamento desses genes em animais mutantes não f-45(e286) resultou em completa interrupção das estruturas sarcomericas e dalocalização myo-3, mesmo sob condições permissivas (15 °C). Este efeito foi comparável ao que foi visto com mutantes únicos unc-45(e286) cultivados à temperatura restritiva (25 °C)25. Estes resultados foramconfirmadosutilizando-se outro alelo unc-45,ou seja, animais mutantes unc-45(m94) 25.

Para identificar acompanhantes que desestabilizam a UNC-45, em seguida, examinamos acompanhantes que melhoraram a motilidade dos animais unc-45(286) a 25 °C, contando com o knockdown genético da RNAi. Enquanto os animais mutantes unc-45(e286) apresentaram graves defeitos de movimento a 25 °C, a motilidade dos animais tratados com RNAi contra genes que codificam quatro dos 97 acompanhantes examinados foi significativamente melhorada. Aqui também, os resultados foram confirmados usando animais mutantes unc-45(m94). Assim, o uso de mutações sensíveis à temperatura permite estabelecer telas agravantes e aliviadas, dependendo da temperatura em que a tela é conduzida.

Usando a superexpressão específica do tecido de um acompanhante para testar para agravar as interações
Em seguida, utilizamos a superexpressão específica do tecido de um único acompanhante como uma leve perturbação da rede de acompanhantes musculares para fins de triagem. Especificamente, utilizamos animais super-expressando tipo selvagem dnj-24,codificando o cojeto C. elegans do DNA de proteína Hsp40JB6 no músculo da parede corporal C. elegans (DNJ-24M). Como acima, os animais L1 DNJ-24M foram tratados com RNAi para diferentes acompanhantes e monitorados por defeitos de motilidade (20 °C) (Figura 1). Enquanto os animais do DNJ-24M não apresentaram defeitos notáveis de motilidade, três genes (dos 48 genes codificadores de acompanhantes examinados; 6%), ou seja, hsp-1, rme-8e dnj-8, afetaram especificamente a motilidade de animais expressos do DNJ-24M, mas não animais do tipo selvagem. Vale ressaltar que testar a especificidade dos hits utilizando animais super-expressando um acompanhante diferente, ou seja, HSP-90, em músculo (HSP90M), não mostrou efeito sobre hsp90M motilidade sobre hsp-1, rme-8, ou dnj-8 RNAi tratamento40. Em conjunto, a plataforma de triagem, empregando leve perturbação à rede de acompanhantes, como a expressão de proteínas mutantes metastíveis ou sobreexpressão específica do tecido, resultou em uma taxa de acerto altamente específica (normalmente ~5%).

Usando RNAi específico para testar interações genéticas específicas do tecido
As cepas sensíveis ao RNAi específicas do tecido permitem a derrubada de genes específicos do tecido enquanto ainda usam alimentação bacteriana para a entrega de dsRNA. Estas cepas são mutantes para a proteína de argonaute RDE-1, um componente importante na via RNAi necessária para o silenciamento genético eficaz21. No entanto, expressar o tipo selvagem RDE-1 sob o controle de um promotor específico do tecido levou a um eficaz knockdown genético específico do tecido41,42. Esta ferramenta permite, assim, telas de interação genética sem o uso de acompanhantes específicos do tecido, como UNC-45 ou DNAJ-24M. Por exemplo, o knockdown hsp-6 (mortalin) em animais do tipo selvagem durante o desenvolvimento resultou em uma forte prisão de desenvolvimento (96±1% dos animais tratados com RNAi). Ao mesmo tempo, o knockdown hsp-6 em uma cepa expressando rde-1 tipo selvagem no músculo não causou prisão de desenvolvimento, enquanto expressar o tipo selvagem RDE-1 em células intestinais resultou em um forte fenótipo de detenção de desenvolvimento (90±3%; Figura 2). Assim, a função HSP-6 nas células intestinais é necessária para o desenvolvimento normal. Uma mutação no hsp-6(mg585) que causa um leve atraso no crescimento pode, portanto, ser usada para testar para agravar ou aliviar interações de acompanhantes, cruzando esse gene mutado em uma cepa RNAi específica do intestino e rastreando a biblioteca RNAi de acompanhantes.

Monitoramento de mudanças dependentes da idade no ambiente dobrável usando interações genéticas
Os animais apresentam um declínio dependente da idade na motilidade associada à desorganização sarcomeric43,44,45. Mudanças na capacidade de dobramento de proteínas coincidem com a regulação alterada e a composição do maquinário de proteostase celular28, incluindo níveis alterados de UNC-45, CHN-1 e UFD-2, proteínas do maquinário de controle de qualidade muscular46. De acordo com a dobra de minonsa e a degradação são afetadas por alterações na capacidade proteostática na transição para a idade adulta47. Perguntamos, portanto, se tais mudanças poderiam impactar as interações de acompanhantes. Por exemplo, monitoramos o impacto do knockdown sti-1, ahsa-1 e daf-41 sobre motilidade ao longo do tempo. Descobrimos que, embora os animais tratados sti-1-, ahsa-1- e daf-41-RNAi tenham mostrado motilidade reduzida durante o desenvolvimento larval, a motilidade diminuiu fortemente em vermes adultos unc-45(ts). Além disso, a organização MYO-3 em animais mutantes unc-45(ts) tratada com sti-1, ahsa-1 ou daf-41 RNAi foi semelhante à dos vermes do tipo selvagem na quarta fase larval (L4), embora os mutantes exibissem sarcomeres interrompidos depois que os animais atingiram a idade adulta(Figura 3). Em contraste, ambos os animais mutantes unc-45(ts) tratados com controle de vetores vazios e animais do tipo selvagem permaneceram inalterados(Figura 3). Assim, a dinâmica da proteostase em função da idade ou das condições ambientais27,45,46,48,49 poderia impactar criticamente as interações de acompanhantes.

Figure 1
Figura 1: Instalação de telas de interação sintética RNAi usando C. elegans carregando uma mutação em um gene codificando um acompanhante de interesse. (A) Representação esquemática da configuração básica de telas de interação de acompanhantes direcionadas. (B) A validação do hit requer a confirmação da interação genética usando outro mutante acompanhante, bem como validar a especificação do knockdown RNAi. (C-D) Leituras simples, como defeitos de motilidade, podem ser quantificadas para determinar interações agravantes ou aliviantes, usando ensaios de paralisia ou desarmes, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: RNAi específico do tecido da acompanhante mitocondrial hsp-6 pode ser usado para examinar interações genéticas em um único tecido. As cepas rnai específicas do intestino e músculos foram tratadas com hsp-6 RNAi e (A) foram pontuadas imagens de desenvolvimento ou (B) imagens foram tiradas no primeiro dia da vida adulta. Os dados são médios ± SEM, N=6. A barra de escala é de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Efeitos dependentes da idade do RNAi. (A) Motilidade com a idade. Embriões do tipo selvagem ou unc-45(e286) foram colocados em placas sti-1, ahsa-1 ou daf-41 RNAi-semeadas a 15 °C e pontuados por motilidade usando um ensaio de thrashing em cada estágio de desenvolvimento, L1-L4, adulto jovem e dia 1 da idade adulta. Os dados são médios ± SEM, N=15. (B) Imagens confocal do músculo da parede corporal. Os animais foram tratados como em A e fixados na L4, adulto jovem e 1º dia de estágios adultos e imuno-manchados com anticorpos anti-MYO-3. A barra de escala é de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução Instruções de preparação Armazenamento
1 M CaCl2 (1 L) Adicionar 147.01 g CaCl2·2H2O Loja na RT
Adicionar dH2O a 1 L
Autoclave ou filtro (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6.0 (1 L) Adicionar 136.09 g KH2PO4 Loja na RT
Adicionar 800 mL dH2O
Misture usando agitador magnético até dissolver
PH titrate usando KOH
Adicionar dH2O a 1 L
Autoclave ou filtro (0,22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) Adicionar 248,58 g MgSO4·7H2O Loja na RT
Adicionar dH2O a 1 L
Autoclave ou filtro (0,22 μm)
Solução de colesterol (50 mL) Adicione 250 mg de colesterol a um tubo falcão de 50 mL Armazenar a -20 °C
Dissolver completamente em 40 mL de etanol
Adicione etanol a 50 mL
1 M IPTG (50 mL) Adicione 11,9 g IPTG (isopropílico-β-D-thiogalactopyranoside) a um tubo Falcon de 50 mL Armazenar no escuro a -20 °C
Dissolver completamente em 40 mL dH2O
Adicionar dH2O a 50 mL
Filtro (0,22 μm), tubos aliquot 1mL
Estoque de ampicillina (50 mL) Adicione 5 g de ampicillina a um tubo falcon de 50 mL Armazenar a -20 °C
Dissolver completamente em 40 mL dH2O
Adicionar dH2O a 50 mL
Filtro (0,22 μm), distribua 1 mL aliquot em tubos Eppendorf
Ações de tetraciclina (50 mL) Adicione 250 mg de tetraciclina a um tubo Falcon de 50 mL Armazenar a -20 °C
Dissolver completamente em 40 mL de etanol
Adicione etanol a 50 mL
Tubos aliquot 1 mL
Tampão M9 (1 L) Adicionar 5.8 g Na2HPO4·7H2O Loja na RT
Adicionar 3 g KH2PO4
Adicionar 5 g NaCl
Adicionar 0,25 g MgSO4·7H2O
Adicionar dH2O a 1 L
Filtro (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 L) Adicionar 8 g de NaCl Loja na RT
Adicionar 200 mg de KCl
Adicionar 1.44 g Na2HPO4·7H2O
Adicionar 240 mg KH2PO4
Dissolver completamente em 800 mL dH2O
PH titrate usando KOH tp pH 7.4
Adicionar 500 μl Tween-20
Adicionar dH2O a 1 L
Tampão de amostra de 5x Adicionar 6,8 mL dH2O Armazenar a -20 °C
Adicionar 2 mL 0.5M Tris pH 6.8
Adicionar 3,2 mL de Glicerol
Adicionar 1,6 mL 20% SDS
Adicionar 0,8 mL ß-mercaptoethanol
1% azul bromofenol

Tabela 1: Receitas de Solução

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Discussion

Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado tecido. Para explorar interações genéticas específicas de acompanhantes, foram consideradas três abordagens diferentes. Na primeira abordagem, o UNC-45, um acompanhante altamente expresso em células musculares, foi usado para testar interações de acompanhantes via alimentação-RNAi25. Embora o uso de um acompanhante especializado permita discernir a especificidade tecidual, ele só pode relatar aquela sub-rede altamente focada à qual contribui. Observe que a maioria dos neurônios C. elegans são resistentes ao parto RNAi baseado em alimentação50 e, portanto, usar essa abordagem para identificar interações genéticas em células neuronais requer cruzar o acompanhante mutante examinado com uma cepa51aumentada pela RNAi . Em uma segunda abordagem, um promotor específico do tecido foi usado para conduzir a superexpressão de um acompanhante no músculo e, portanto, afetar especificamente o ambiente de dobra muscular40. No entanto, expressar demais um único acompanhante pode ser geralmente benéfico para o ambiente dobrável e, assim, mascarar a interrupção causada pelos dois acompanhantes juntos. A terceira abordagem contou com o knockdown RNAi específico para examinar interações de acompanhantes em um determinado tecido41. Uma vantagem dessa abordagem é que permite direcionar células neuronais resistentes à entrega de RNAi através da alimentação42. Ainda assim, essa abordagem requer o uso de um mutante leve (embora não especializado), bem como que este mutante seja atravessado em um mutante nulo rde-1 carregando um gene de resgate rde-1 específico para tecidos. É importante ressaltar que essas abordagens podem ser combinadas de modo a potencialmente modular a função de acompanhante em um único tecido ou mesmo em uma única célula.

O maquinário de controle de qualidade pode impactar a função de muitos produtos genéticos, perturbando a proteostase. Este é um grande desafio ao usar interações genéticas para explorar a rede de controle de qualidade18. Por exemplo, a expressão crônica de proteínas propensas à agregação ou o colapso da proteostase no envelhecimento resultou em agravamento fenotípico de muitas proteínas metastíveis não relacionadas em C. elegans eleveduras 45,52,53. Além disso, a endocitose mediada pela clathrin em células mamíferas foi inibida após o sequestro funcional de Hsc70 para agregados proteicos. No entanto, foi demonstrado que a endócitose poderia ser resgatada pelo excesso de expressão do Hsc70, enquanto a agregação não poderia54,55. Da mesma forma, uma tela genética em Drosophila projetada para descobrir os reguladores da resposta ao choque térmico identificou uma mutação missense em ato muscular de voo que ativou constitutivamente a resposta ao choque térmico56. Em conjunto, a perturbação da rede de proteostase pode expor proteínas metátáveis ou induzir estresse que pode impactar a especificidade do resultado. No entanto, analisar interações genéticas pode produzir uma visão altamente específica e funcional. Por exemplo, análises epistáticas de genes de leveduras necessárias para dobramento no ânticulo endoplasmático identificaram interações genéticas específicas entre acompanhantes moleculares que foram posteriormente validadas19. Da mesma forma, uma tela agravante para acompanhantes que aumentam a toxicidade de dois modelos propensos à agregação (medidos pela motilidade) identificou um subconjunto específico de 18 acompanhantes, ortologs dos quais impactou a agregação de Huntingtin em células humanas26. Aqui, mostramos que várias perturbações da rede de proteostase podem descobrir interações específicas e funcionais de acompanhantes.

A principal vantagem do uso de telas de interação genética baseadas em alimentação RNAi é a relativa simplicidade do método. Mesmo empregando uma saída comportamental geral, como a motilidade, pode revelar novas interações genéticas(Figura 3). No entanto, a variabilidade e os efeitos parciais do knockdown de expressão podem limitar a robustez e especificidade dos resultados57. Além disso, as interações genéticas não são indicativas de interações físicas e a relação entre dois genes pode, portanto, ser indireta. Explorar a natureza das interações e descartar interações não específicas pode ser demorado57,58,59. Essa é uma preocupação que precisa ser abordada na configuração e validação da tela. Por exemplo, o uso de alelos nulos na triagem genética permite determinar se esses genes funcionam nas mesmas ou distintas vias em um determinado processo biológico. No entanto, o uso da perda parcial da função genética, alelos hipomórficos, como alelos sensíveis à temperatura, ou baixa regulação de expressão dependentes da RNAi, resulta em atividades residuais que podem produzir fenótipos agravantes ou aliviantes, independentemente de os genes agirem no mesmo ou em vias paralelas59. Assim, a natureza de qualquer interação requer uma análise mais aprofundada. No entanto, o uso de alelos hipomórficos e RNAi poderia identificar uma ampla gama de interagidores, incluindo genes no mesmo complexo proteico ou via ou em uma via redundante59. Embora esse escopo maior de possíveis interações possa produzir mais acessos em uma tela genética, também pode levar a interações não específicas, como, por exemplo, a exposição não específica de alelos sensíveis à temperatura no colapso da proteostase45,53.

A validação do hit e interações não específicas podem ser examinadas de várias maneiras. O número de acessos deve ser baixo. Por exemplo, a baixa regulação da expressão de acompanhante em um fundo mutante unc-45 resultou em uma pequena porcentagem de acertos (4%), com a maioria dos genes de parodiação não mostrando nenhum efeito sobre a motilidade. Taxa semelhante foi observada quando o DNJ-24M foi super expresso (6%). Como observado acima, uma tela para interações de acompanhantes com proteínas propensas à agregação identificou 18 acompanhantes de 219 selecionados (8%).

Vários alelos mutantes, linhas de expressão excessiva ou modelos de doenças devem ser usados. O uso de diferentes alelos mutantes que têm diferentes impactos na função acompanhante, bem como diferentes cepas com diferentes origens genéticas, pode suportar a especificidade de qualquer acerto de tela. Alternativamente, o uso de mutação ou superexpressão de um acompanhante diferente que não leva a perturbação semelhante pode servir como um controle negativo. Por exemplo, tanto o unc-45(e286) quanto o unc-45(m94) apresentaram comportamento agravante quando sti-1, ahsa-1 ou daf-41 foram regulados. Além disso, observou-se interação semelhante quando animais portadores do mutante de exclusão ahsa-1(ok3501) foram tratados com hsp-90 RNAi25.

A identidade dos hits de acompanhante e suas interações conhecidas devem ser examinadas. Por exemplo, acompanhantes identificados em uma tela agravante unc-45 são um conjunto altamente específico de acompanhantes necessários para o ciclo ATPase HSP-90, incluindo aqueles que codificam um recrutador cliente (STI-1), um co-acompanhante de remodelação (AHSA-1) e um co-acompanhante de maturação do cliente (DAF-41). Na verdade, este conjunto de co-acompanhantes forma um ciclo de dobramento HSP-90 completo60. Da mesma forma, uma tela DNJ-24M identificou o HSP-1, o principal parceiro de acompanhante do Hsp40s40.

Mudanças nas interações ao longo da vida útil do animal também devem ser examinadas. Por exemplo, acompanhantes identificados na tela agravante unc-45 impactaram fortemente a motilidade e a organização da minoina na idade adulta, mas tiveram um efeito mais suave durante o desenvolvimento. Isso pode ser devido a mudanças na rede de proteostase na idade adulta28 ou a alterações nos requisitos de dobramento de mosina entre dobramento e manutenção de fibras mio.

Utilize abordagens bioquímicas complementares para examinar diretamente as interações entre as proteínas, bem como sua localização na célula. Por exemplo, os co-acompanhantes HSP-90, STI-1, AHSA-1 e DAF-41, são localizados no sarcomere onde interagem com a minodã25.

C. elegans é um modelo metazoano bem estabelecido para monitorar o controle de qualidade. É frequentemente usado para monitorar proteostase celular e organismo usando um kit de ferramentas variável de biologia celular, abordagens bioquímicas e genéticas. Aqui, utilizamos abordagens de triagem genética e ferramentas disponíveis57,58,59, como um banco mutante, bibliotecas RNAi disponíveis22,23 e cepas RNAi específicas de tecido41,42, para monitorar as interações de acompanhantes em um animal vivo durante o desenvolvimento e envelhecimento. O uso de ensaios comportamentais simples, como a motilidade, simplifica a tela de muitos possíveis pares genéticos para explorar novas interações genéticas. Isso pode, então, servir como uma plataforma para explorar ainda mais a localização de acompanhantes e interações físicas usando ferramentas bioquímicas para estudar mecanicamente suas interações potenciais in vivo e in vitro. O protocolo aqui descrito foi usado com sucesso para identificar novas interações de acompanhantes em C. elegans músculo da parede corporal25,40.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado pelo Nih National Center for Research Resources (NCRR), por algumas das cepas de nematoides. Anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação de Ciência de Israel (bolsa nº 278/18) e por uma bolsa do Ministério da Ciência & Tecnologia de Israel, e do Ministério das Relações Exteriores e Cooperação Internacional, Direção Geral de Promoção de Países, República Italiana (bolsa nº 3-14337). Agradecemos aos membros do laboratório Ben-Zvi pela ajuda na preparação deste manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

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Biologia Edição 160 Caenorhabditis elegans,acompanhante interações genéticas proteostase RNAi tela sensível à temperatura
Usando <em>elegans caenorhabditis</em> para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido
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