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Biology

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Abstract

Die korrekte Faltung und Montage von Proteinen und Proteinkomplexen ist für die Zellfunktion unerlässlich. Zellen verwenden Qualitätskontrollwege, die beschädigte Proteine korrigieren, sequestrieren oder eliminieren, um ein gesundes Proteom zu erhalten, wodurch die zelluläre Proteostase sichergestellt und weitere Proteinschäden verhindert werden. Aufgrund redundanter Funktionen innerhalb des Proteostase-Netzwerks führt das Screening auf nachweisbare Phänotypen mittels Knockdown oder Mutationen in Chaperon-kodierenden Genen im Vielzellorganismus Caenorhabditis elegans in den meisten Fällen zum Nachweis von geringfügigen oder keinen Phänotypen. Wir haben eine gezielte Screening-Strategie entwickelt, um Chaperone zu identifizieren, die für eine bestimmte Funktion benötigt werden, und so die Lücke zwischen Phänotyp und Funktion zu schließen. Insbesondere überwachen wir neuartige Chaperon-Interaktionen mit RNAi-synthetischen Interaktionsbildschirmen, die die Chaperonexpression nacheinander bei Tieren niederschlagen, die eine Mutation in einem Chaperon-kodierenden Gen tragen oder ein Chaperon von Interesse überexpressieren. Indem wir zwei Chaperone stören, die einzeln keinen groben Phänotyp aufweisen, können wir Chaperone identifizieren, die einen bestimmten Phänotyp verschlimmern oder freilegen, wenn beide gestört sind. Wir zeigen, dass dieser Ansatz bestimmte Gruppen von Chaperonen identifizieren kann, die zusammen funktionieren, um die Faltung eines Proteins oder von Proteinkomplexen zu modulieren, die mit einem bestimmten Phänotyp assoziiert sind.

Introduction

Zellen bewältigen Proteinschäden durch den Einsatz von Qualitätskontrollmaschinen, die beschädigte Proteine reparieren, sequestrieren oder entfernen1,2. Die Faltung und Montage von Proteinkomplexen wird durch molekulare Chaperone unterstützt, eine vielfältige Gruppe hochkonservierter Proteine, die beschädigte Proteine reparieren oder sequestrieren können3,4,5,6,7. Die Entfernung geschädigter Proteine wird durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)8 oder durch die Autophagie-Maschinerie9 in Zusammenarbeit mit den Chaperonen10,11,12vermittelt. Die Protein-Homöostase (Proteostase) wird daher durch Qualitätskontrollnetzwerke aufrechterhalten, die aus Falt- und Abbaumaschinen bestehen3,13. Die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten des Proteostase-Netzwerks in vivo zu verstehen, ist jedoch eine große Herausforderung. Während Protein-Protein-Interaktionsscreens wichtige Informationen über physikalische Interaktionen und Chaperonkomplexe14,15beisteuern, fehlt es an einem Verständnis der Organisation und der kompensatorischen Mechanismen innerhalb gewebespezifischer Chaperonnetzwerke in vivo.

Genetische Interaktionen werden oft als leistungsfähiges Werkzeug verwendet, um die Beziehung zwischen Genpaaren zu untersuchen, die an gemeinsamen oder kompensatorischen biologischen Signalwegen beteiligt sind16,17,18. Solche Beziehungen können gemessen werden, indem Mutationspaare kombiniert und der Einfluss einer Mutation in einem Gen auf den phänotypischen Schweregrad, der durch eine Mutation im zweiten Gen verursacht wird, quantifiziertwird 16. Während die meisten dieser Kombinationen keine Wirkung in Bezug auf den Phänotyp zeigen, können einige genetische Interaktionen die Schwere des gemessenen Phänotyps entweder verschlimmern oder lindern. Erschwerende Mutationen werden beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelslektionsmutante schwerwiegender ist als der erwartete Phänotyp, der bei der Kombination der einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wird, was bedeutet, dass die beiden Gene in parallelen Signalwegen funktionieren und zusammen eine bestimmte Funktion beeinflussen. Im Gegensatz dazu werden lindernde Mutationen beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelsleerationsmutante weniger schwerwiegend ist als der Phänotyp, der bei den Einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wurde, was bedeutet, dass die beiden Gene zusammen als Komplex wirken oder am gleichen Weg teilnehmen16,18. Dementsprechend wurden verschiedene Phänotypen, die quantifiziert werden können, einschließlich breiter Phänotypen wie Letalität, Wachstumsraten und Brutgröße, sowie spezifischer Phänotypen wie Transkriptionsreporter verwendet, um genetische Interaktionen zu identifizieren. Zum Beispiel stützten sich Jonikas et al. auf einen ER-Stressreporter, um die Interaktionen des Saccharomyces cerevisiae ER entfalteten Proteinantwort-Proteostase-Netzwerks mit paarweisen Gen-Deletionsanalysen zu untersuchen19.

Genetische Interaktionsscreens beinhalten die systematische Kreuzung paarweiser Deletionsmutationen, um einen umfassenden Satz von Doppelmutanten zu erzeugen20. In Tiermodellen und speziell bei C. elegansist dieser groß angelegte Ansatz jedoch nicht durchführbar. Stattdessen können mutierte Stämme auf ihre genetischen Interaktionsmuster getestet werden, indem die Genexpression mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) herunterreguliert wird21. C. elegans ist ein leistungsfähiges System für Bildschirme auf Basis von RNAi22,23. Bei C. eleganswird die doppelsträngige RNA-Abgabe (dsRNA) durch bakterielle Fütterung erreicht, was zur Ausbreitung von dsRNA-Molekülen auf zahlreiche Gewebe führt. Auf diese Weise wirken die eingebrachten dsRNA-Moleküle über ein schnelles und einfaches Verfahren auf das Tier21. Ein genetisches Interaktionsscreening mit RNAi kann daher die Auswirkungen der Downregulierung einer Reihe von Genen oder der meisten C. elegans-kodierenden Gene unter Verwendung von RNAi-Bibliothekenaufdecken 24. In einem solchen Bildschirm sind Treffer, die das Verhalten der mutanten von Interesse beeinflussen, aber nicht des Wildtypstamms, potenzielle Modifikatoren des zu überwachenden Phänotyps25. Hier wenden wir eine Kombination aus Mutationen und RNAi-Screening an, um gewebespezifische Chaperon-Interaktionen bei C. elegans systematisch abzubilden.

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Protocol

1. Herstellung von Nematoden-Wachstumsmedienplatten für RNAi

  1. Zu einer 1 L Flasche 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g Agar und destilliertes Wasser bis 1 L und Autoklav geben.
  2. Flasche auf 55 °C abkühlen.
  3. Fügen Sie 25 ml 1 MKH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4und 1 ml Cholesterinlösung (Tabelle 1) hinzu, um Nematodenwachstumsmedien (NGM) herzustellen.
  4. Fügen Sie 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 0,5 ml 1 M IPTG(Tabelle 1)hinzu, um NGM-RNAi-Lösung herzustellen.
    HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli-Bakterien enthalten eine IPTG-induzierbare T7-DNA-Polymerase, die zur Exprimierung der dsRNA-kodierenden Plasmide verwendet wird. Diese Plasmide kodieren auch für die Ampicillinresistenz.
  5. Mischen Sie die warme Lösung, indem Sie die Flasche schwenken.
  6. In der Haube oder mit sterilen Verfahren die NGM-Lösung in Platten gießen oder mit einer Peristaltikpumpe die Lösung in Platten dosieren. Verwenden Sie für diesen Bildschirm 6-Well-, 12-Well-, 40-mm- oder 60-mm-Platten. Agar sollte etwa 2/3 der Plattentiefe füllen.
  7. Lassen Sie die Platten über Nacht auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen und halten Sie die Platten bedeckt. NGM-Platten für RNAi können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.

2. RNAi-Bakterien züchten und Platten aussäen

  1. In der Haube oder mit sterilen Verfahren 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 2,5 ml Tetracyclin (5 mg/ml)(Tabelle 1)zu einer vor autoklavierten 1 L LB-Lösung geben und mischen.
    HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli Bakterien sind tetracyclinresistent.
  2. In der Haube oder mit sterilen Verfahren 600 μL LB-Lösung in jeder Vertiefung in 2 ml tiefen 96-Well-sterilen Platten hinzufügen. Für die Dosierung der Medien verwenden Sie am besten eine Mehrkanalpipet.
  3. Mit sterilen Verfahren werden Vertiefungen mit HT115(DE3) E. coli-Bakterien geimpft, die mit einem dsRNA-kodierenden Plasmid transformiert wurden, das auf ein interessantes Gen oder ein leeres Plasmid abzielt, um ein Gen oder ein leeres Plasmid als Kontrolle zu kontrollieren. Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Bibliotheken, die aus bakteriellen Klonen bestehen, die dsRNA exprimieren, was ~ 94% der vorhergesagten C. elegans-Gene entspricht,wurden zuvor22,23 konstruiert und sind kommerziell erhältlich. Die hier verwendete Chaperon-Bibliothek wurde vom Dr. Richard Morimoto Labor26gebaut.
  4. Mit sterilen Verfahren 75, 150 oder 250 μL Bakterien auf die 12-Well-, 40-mm- und 6-Well- bzw. 60-mm-NGM-RNAi-Platten aussäen. Markieren Sie deutlich den Namen des Zielgens auf der Platte. Bakterien sollten 30-50% der Agaroberfläche bedecken und die Ränder der Platte nicht berühren.
  5. Lassen Sie die Platten mindestens 2 Tage auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen und halten Sie die Platten bedeckt.
    HINWEIS: Platten können über Nacht bei 37 °C inkubiert werden. Stellen Sie sicher, dass die inneren Vertiefungen trocken sind, bevor Sie die Platten verwenden oder lagern. Für alle langfristigen Zwecke (z. B. Trocknen oder Lagern) halten Sie die Platten im Dunkeln. Getrocknete, ausgesäte Platten können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.

3. Stressfreie Synchronisation von Embryonen

  1. Verwenden Sie einen Wurmpickel, um etwa 100 Eier von einer unsynchronisierten Wurmplatte auf eine neu ausgesäte NGM-Platte zu bewegen.
  2. Tiere 5 Tage bei 15 °C, 3,5 Tage bei 20 °C oder 2,5 Tage bei 25 °C kultivieren. Tiere sollten den ersten Tag der Eiablage erreichen.
    HINWEIS: Würmer werden üblicherweise bei 20 °C kultiviert. Verschiedene Chaperon-Mutantenstämme können jedoch spezifische Kultivierungstemperaturen erfordern. Zum Beispiel werden viele temperaturempfindliche Stämme bei 15 °C kultiviert, aber auf 25 °C verschoben, um ihren Phänotyp freizulegen.
  3. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer (Tabelle 1) langsam und weg vom Bakterien rasen hinzu. Drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Dann kippen Sie es zur Seite und entfernen Sie die Flüssigkeit vom Teller und waschen Sie die Tiere vom Teller.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von temperaturempfindlichen Tieren oder Chaperonmutanten ist es am besten, die im Protokoll verwendeten Puffer auf der Kultivierungstemperatur der Tiere zu halten.
  4. Wiederholen Sie Schritt 3.3 dreimal oder bis alle Tiere vom Teller gewaschen sind.
  5. Schneiden Sie mit einer Standard-Kunststoffspitze ein Quadrat Agar aus dem gewaschenen Teller, auf dem die Eier konzentriert sind, und legen Sie das Stück Agar auf eine neu ausgesäte NGM-Platte.
    HINWEIS: ~ 200 Eier sind erforderlich, um genügend eierlegende Tiere zu produzieren; zu viele Tiere verbrauchen die Bakterien zu schnell. Niedrige Nahrungswerte können die Proteostase beeinflussen27.
  6. Kultivieren Sie die Tiere für 5 Tage bei 15 °C, 3,5 Tage bei 20 °C oder 2,5 Tage bei 25 °C. An dieser Stelle sollten die Platten mit synchronisierten Eiern bedeckt werden.
    HINWEIS: Tiere können für kurze Zeit auf eine neue Platte verschoben werden, um eine strengere Synchronisation zu erreichen. Es ist jedoch wichtig, erwachsene Erwachsene nur in den frühen Stadien der Eiablage zu verwenden, da Tiere Eier in ihrer Gebärmutter behalten können, was die Synchronisation beeinflusst.
  7. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer langsam und weg vom Bakterien rasen hinzu.
  8. Drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Dann kippen Sie es zur Seite und entfernen Sie die Flüssigkeit vom Teller und waschen Sie die Tiere vom Teller.
  9. Wiederholen Sie Schritt 3.7 dreimal oder bis alle Tiere vom Teller gewaschen sind.
  10. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Eier von der Platte zu lösen.
  11. Sammeln Sie den M9-Puffer mit den Eiern von den Platten.
  12. Zentrifugieren Sie den M9-Puffer mit den Eiern bei 3.000 x g für 2 min.
  13. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie den M9-Puffer hinzu, um ein Volumen von 1 ml zu erreichen.
  14. Resuspendieren Sie die Eier, um alle Brocken von Eiern und Bakterien zu stören.
  15. Wiederholen Sie den in den Schritten 3.11-3.13 beschriebenen Waschvorgang fünfmal. Das Eierpellet sollte weiß erscheinen. Wenn es immer noch gelb / braun ist, wiederholen Sie die Wäsche, bis ein weißes Pellet erreicht ist.
    HINWEIS: Bakterien, die auf den Eiern verbleiben, können die dsRNA-exprimierenden Bakterien kontaminieren.
  16. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands, so dass etwa 200 μL übrig bleiben. Synchronisierte Eier können für RNAi-Bildschirme verwendet werden.

4. Gängige phänotypische Assays

  1. Kultivierung von Tieren im Rahmen von Experimenten
    1. Legen Sie einen Tropfen von ~ 30 Eiern in die Nähe des Bakterien rasens in jede RNAi-samenete Platte. Als Referenz legen Sie auch ~ 30 Eier auf Teller, die mit leeren vektorhaltigen (L4440) Bakterien gesät sind.
    2. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere auf NGM RNAi-gesäten Platten. Die Dauer des Experiments hängt von der Phase ab, in der die Tiere überwacht werden sollen, und von der Temperatur des Anbaus. Passen Sie die Kultivierungstemperatur an, wenn Temperaturempfindliche mutierte Tiere verwendet werden. Passen Sie die Kultivierungsdauer an, wenn entwicklungsverzögerte mutierte Tiere verwendet werden.
      HINWEIS: Während das Timing variieren kann, könnten die Eiablage (und der daraus resultierende schnelle Nahrungskonsum) sowie der altersabhängige Proteostsiskollaps28die Ergebnisse beeinflussen, sobald die Tiere das Erwachsenenalter erreicht haben. Es wird daher empfohlen, Tiere vor Beginn der Eiablage (Tag 1 des Erwachsenenalters) zu bewerten. Wildtyptiere erreichen dieses Stadium nach 4,5 Tagen bei 15 °C, 3 Tagen bei 20 °C oder 2 Tagen bei 25 °C.
    3. Die Anzahl der verwendeten Wiederholungen hängt von der Größe des untersuchten Gensatzes ab. Für die Chaperon-Bibliothek (97 Gene) wiederholen Sie Experimente mindestens viermal. Die Größe der Population hängt vom verwendeten Assay ab. In den hier diskutierten Verhaltenstests werden bei jeder Wiederholung >15 Tiere pro Versuchsbedingung bewertet. Daten und statistische Analysen hängen auch stark von der Art des verwendeten Assays ab. Die Daten in den hier besprochenen Assays können als Mittel ± SEM dargestellt werden.
    4. Vergleichen Sie die RNAi- und Empty Vector Control-behandelten Tiere als unabhängige Populationen. P-Werte können mit Einweg- oder Zwei-Wege-ANOVA berechnet werden, abhängig von den untersuchten Veränderungen, nämlich verschlimmernd oder lindernd allein oder beides. Bei der Untersuchung einer einzelnen RNAi-Behandlung im Vergleich zur Kontrolle können P-Werte mit einem einseitigen oder zweiseitigen Mann-Whitney-Rangsummentest berechnet werden. Abgesehen von der statistischen Signifikanz sollten Sie einen Schwellenwert für Treffer in Betracht ziehen, der auf dem Grad der Auswirkungen auf den Phänotyp basiert.
  2. Entwicklungsarrest/-verzögerung
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren vektorhaltigen Kontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.
    2. Überwachen Sie Tiere mit einem Stereomikroskop und zählen Sie die Anzahl der Larven und Erwachsenen, um den Prozentsatz der entwicklungsverzögerten Tiere zu bewerten. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren vektorhaltigen Kontrollbakterien gezüchtet wurden. Die Behandlung mit hsp-1 oder hsp-90 RNAi führt zu einem Entwicklungsstillstand von Wildtyptieren und kann als Positivkontrolle eingesetzt werden.
    3. Um den Prozentsatz der entwicklungsverzögerten Tiere im Laufe der Zeit zu bewerten, wiederholen Sie Schritt 4.2.2.
      HINWEIS: Wenn sich eilegende Erwachsene auf dem Teller befinden, übertragen Sie die entwicklungsverzögerten Tiere auf eine neue NGM-RNAi-Platte, die für dasselbe Zielgen markiert ist, um Verwechslungen mit Nachkommen zu vermeiden.
  3. Sterilität oder Mängel bei der Eiablage
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, eierlegen.
    2. Überwachen Sie Tiere mit einem Stereomikroskop und bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere ohne sichtbare Eier in ihrer Gebärmutter. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden.
    3. Alternativ können Sie Tiere mit einem Stereomikroskop überwachen und den Prozentsatz der Tiere mit einer Gebärmutter voller Eier bewerten, definiert als EGg Laying defekter (Egl-d) Phänotyp29.
  4. Embryonale Letalität
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis die Tiere mit dem Eierlegen beginnen.
    2. ~100 Eier auf einen leeren Teller geben. Verteilen Sie die Eier in Reihen, um das Zählen zu vereinfachen.
    3. Bewerten Sie den Prozentsatz der ungeschlüpften Eier auf dem Teller nach 24-48 Stunden. Vergleichen Sie als Referenz mit Eiern von Tieren, die mit leeren Vektorkontrollbakterien behandelt wurden.
  5. Lähmungstest
    1. Kultivieren Sie für Erwachsene am Tag 1 alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die mit leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.
    2. Zeichnen Sie eine Linie auf der Rückseite einer normalen NGM-Agarplatte mit einem feinen Marker.
    3. Legen Sie 5-10 Tiere auf die markierte Linie.
    4. Stellen Sie einen Timer ein und warten Sie 10 Minuten.
    5. Bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere, die als gelähmte Würmer auf der Linie verbleiben. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden. Wildtyptiere, die mit unc-45 RNAi behandelt wurden, zeigen einen schweren Lähmungsphänotyp und können als Positivkontrolle verwendet werden.
      HINWEIS: Dieser Assay hebt Tiere hervor, die eine mittlere bis schwere Lähmung zeigen. Solche Tiere liegen normalerweise gerade auf dem Teller, anstatt die übliche gekrümmte Form zu präsentieren. Darüber hinaus ist ein von Bakterien befreites Pflaster um die Köpfe gelähmter Würmer sichtbar.
  6. Thrashing-Assay
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.
    2. Pipettieren Sie 100 μL M9-Puffer bei der Kultivierungstemperatur der Tiere in eine 96-Well-Platte.
    3. Legen Sie ~ 15 Würmer, einen pro Bohrung, in die M9-Pufferbrunnen.
    4. Lassen Sie die Tiere für 5 min einstellen.
    5. Untersuchen Sie jedes Tier unter dem Stereomikroskop, starten Sie einen Timer, der 15 s herunterzählt, und zählen Sie die Anzahl der Körperbiegungen, die jedes Tier in dieser Zeitspanne ausführt. Die gezählten Werte können auf Körperbiegungen pro Minute normalisiert werden. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden.
      HINWEIS: Dieser Motilitätstest ist sehr empfindlich und kann sehr leichte Unterschiede zwischen den Behandlungen erkennen. Die Motilität in der Flüssigkeit und die Motilität auf Agar können sich jedoch unterscheiden.

5. Validierung des Protein-Knockdowns

  1. 250-300 synchronisierte Eier werden auf eine 60 mm NGM-RNAi-Platte gesetzt, die mit den relevanten dsRNA-exprimierenden oder leeren vektorhaltigen (L4440) Bakterien gesät ist.
    HINWEIS: RNAi-Knockdown könnte zu einer aberranten Ansammlung von Embryonen, zu einem Mangel an Embryonen oder zu einem Entwicklungsstillstand führen, der die Genexpression beeinträchtigen könnte. Dies sollte bei der Bestimmung des Alters der zu untersuchenden Tiere berücksichtigt werden.
  2. Für Erwachsene am 1. Tag 4,5 Tage bei 15 °C, 3 Tage bei 20 °C oder 2 Tage bei 25 °C kultivieren.
  3. Insgesamt 200 junge erwachsene Tiere pflücken und in die Kappe einer 1,5 mL Röhrchenfüllung mit 200 μL PBS-T geben.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von temperaturempfindlichen Tieren oder Chaperonmutanten ist es am besten, die im Protokoll verwendeten Puffer auf der Kultivierungstemperatur der Tiere zu halten.
  4. Schließen Sie die Kappe vorsichtig und zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 1 min.
  5. 800 μL PBS-T (Tabelle 1) hinzufügen und bei 1.000 x g zentrifugieren für 1 min.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die oberen 900 μL.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.6 dreimal.
  8. 900 μL entfernen, wobei 100 μL Lösung mit den 200 Würmern übrig bleiben.
  9. Fügen Sie 25 μL 5x Probenpuffer hinzu (Tabelle 1).
  10. Erhitzen Sie die Proben für 10 min bei 92°C beim Schütteln bei 1000 U/min. Die Proben können dann eingefroren und bei -20 °C aufbewahrt werden.
  11. Laden Sie 20 μL jeder Probe und führen Sie sie mit einem SDS-PAGE-Gel aus.
  12. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit geeigneten Antikörpern durch, um die relative Stabilität des Proteins zu bestimmen.
  13. Bestimmen Sie die Intensität der Bänder mit einer densitometrischen Software, wie z.B. dem frei verfügbaren ImageJ Gelmodul. Normalisieren Sie alle Werte auf die in der/den Kontrollprobe(n) gemessenen Werte.
    HINWEIS: Das Ziel des RNAi-Knockdowns in unseren Bildschirmen ist es, den Proteinspiegel eines bestimmten Chaperons / Co-Chaperons zu senken. Daher ist der beste Weg, die Effizienz des RNAi-Knockdowns zu bewerten, die Western-Blot-Analyse. Dies erfordert spezifische Antikörper. Alternativ kann qPCR verwendet werden, um mRNA-Spiegel zu quantifizieren.

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Representative Results

Verwendung temperaturempfindlicher Mutationen in UNC-45 zum Screening auf verschlimmernde oder lindernde Wechselwirkungen unter freizügigen bzw. restriktiven Bedingungen
Muskelaufbau und -erhaltung bieten ein effektives System zur Untersuchung gewebespezifischer Chaperon-Interaktionen. Die Funktionelle Einheit der kontraktilen Muskeln, das Sarkomer, stellt eine kristalline Anordnung von strukturellen und regulatorischen Proteinen dar. Die Stabilität des Motorproteins Myosin und sein Einbau in die dicken Filamente kontraktiler Muskelsarkomere hängt von der Zusammenarbeit von Chaperonen und USK-Komponentenab 30. Ein Beispiel für ein solches Chaperon ist das konservierte und spezialisierte Myosin-Chaperon UNC-45, das hauptsächlich im Körperwandmuskel31,32,33,34,35exprimiert wird . Es wurde gezeigt, dass Mutationen in UNC-45 Myosin-Desorganisation und schwere Motilitätsdefekte in Cinduzieren. elegans31,36. UNC-45-Tandemmodule werden zu einer Multi-Site-Docking-Plattform37 zusammengefügt, die die Zusammenarbeit zwischen UNC-45, HSP-90 und HSP-1 und wahrscheinlich anderen Chaperonen und Co-Chaperonen in der Myosinfilamentbaugruppe25,36,37,38erzwingt. Um bekannte UNC-45-Interaktionen zu bestätigen und neue genetische Interaktionen in der Muskelproteostase zu identifizieren, haben wir eine Strategie entwickelt, die C. elegans temperaturempfindliche unc-45-Mutationen als sensibilisierten genetischen Hintergrund für gewebespezifisches Chaperon-Interaktionsscreeningverwendet 19,25.

Einzelaminosäuresubstitutionen in C. elegans UNC-45 (L822F und E781K, entsprechend den Allelen e286 bzw. m94; unc-45(ts)) sind verantwortlich für temperaturabhängige Motilitätsdefekte und Myosin-Desorganisationsphänotypen, wenn betroffene Tiere unter restriktiven Bedingungen (>22 °C) gezüchtet werden. Im Gegensatz dazu zeigen diese unc-45(ts)-Mutanten bei der permissiven Temperatur (15 °C)31keine Bewegungs- oder Myosinorganisationsfehler. In dem vorgeschlagenen Ansatz wurden alterssynchronisierte unc-45(e286)-Tiere im ersten Larvenstadium (L1) durch RNAi (97 Gene) von verschiedenen molekularen Chaperonen erschöpft und dann unter permissiven Bedingungen (15 °C) auf Motilitätsdefekte überwacht(Abbildung 1). Wir bestätigten die bekannte Wechselwirkung von UNC-45- und HSP-90-Proteinen in unserem Screening genetischer Interaktionen und identifizierten drei hsp-90-Co-Chaperone, sti-1, ahsa-1 und daf-41, als spezifisch verursachend für einen synthetischen Bewegungsfehler bei unc-45 (ts) mutierten Tieren, aber nicht bei Wildtyptieren25. Wir untersuchten weiter, ob sti-1-, ahsa-1- oder daf-41-assoziiertesynthetische Phänotypen durch Myosin-Desorganisation verursacht wurden, indem wir die subzelluläre Anordnung der myosinschweren Kette A (MYO-3) unter Verwendung etablierter Immunfärbungstechnikenüberwachten 39. Während die Behandlung von Wildtyptieren mit sti-1, ahsa-1 oder daf-41 RNAi die Myofilamentorganisation nicht beeinflusste, führte die Erschöpfung dieser Gene bei unc-45(e286)-mutierten Tieren zu einer vollständigen Störung der sarkomerischen Strukturen und einer MYO-3-Fehllokalisierung, selbst unter permissiven Bedingungen (15 °C). Dieser Effekt war vergleichbar mit dem, was bei unc-45(e286)-Einzelmutanten beobachtet wurde, die bei der restriktiven Temperatur (25 °C)25gezüchtet wurden. Diese Ergebnisse wurden mit einem anderen unc-45(ts)-Allel bestätigt, nämlich unc-45 (m94) mutierten Tieren25.

Um Chaperone zu identifizieren, die UNC-45 destabilisieren, haben wir als nächstes nach Chaperonen gesucht, die die Motilität von unc-45 (286) -Tieren bei 25 ° C verbesserten, wobei wir uns auf den Gen-Knockdown durch RNAi stützten. Während unc-45(e286)-mutierte Tiere bei 25 °C schwere Bewegungsfehler aufwiesen, wurde die Motilität von tieren, die mit RNAi behandelt wurden, gegen Gene, die für vier der 97 untersuchten Chaperone kodieren, signifikant verbessert. Auch hier wurden die Ergebnisse mit unc-45(m94) mutierten Tieren bestätigt. So ermöglicht die Verwendung von temperaturempfindlichen Mutationen die Einrichtung sowohl verschlimmernder als auch lindernder Bildschirme, abhängig von der Temperatur, bei der der Bildschirm durchgeführt wird.

Verwendung der gewebespezifischen Überexpression eines Chaperons zum Screening auf erschwerende Interaktionen
Als nächstes nutzten wir die gewebespezifische Überexpression eines einzelnen Chaperons als leichte Störung des Muskel-Chaperon-Netzwerks für Screening-Zwecke. Insbesondere verwendeten wir Tiere, die den Wildtyp dnj-24überexpressierten und den C. elegans-Homolog des Hsp40-Proteins DNAJB6 im Körperwandmuskel C. elegans (DNJ-24M) kodierten. Wie oben beschrieben, wurden L1 DNJ-24M-Tiere mit RNAi für verschiedene Chaperone behandelt und auf Motilitätsdefekte (20 °C) überwacht(Abbildung 1). Während DNJ-24M-Tiere keine nennenswerten Motilitätsdefekte zeigten, beeinflussten drei Gene (von den 48 untersuchten Chaperon-kodierenden Genen; 6%), nämlich hsp-1, rme-8und dnj-8, spezifisch die Motilität von DNJ-24M-exprimierenden Tieren, aber nicht von Wildtyptieren. Es ist bemerkenswert, dass die Prüfung der Spezifität der Treffer mit Tieren, die ein anderes Chaperon, nämlich HSP-90, im Muskel (HSP90M) überexpressieren, keinen Einfluss auf die HSP90M-Motilität bei hsp-1-, rme-8-oder dnj-8 RNAi-Behandlung 40zeigte. Zusammengenommen führte die Screening-Plattform, die leichte Störungen des Chaperon-Netzwerks wie die Expression metastabiler mutierter Proteine oder eine gewebespezifische Überexpression einsetzte, zu einer hochspezifischen Trefferrate (normalerweise ~ 5%).

Verwendung von gewebespezifischem RNAi zum Screening auf gewebespezifische genetische Interaktionen
Gewebespezifische RNAi-sensitive Stämme ermöglichen einen gewebespezifischen Knockdown von Genen bei gleichzeitiger Verwendung von Bakterienfütterung für die dsRNA-Abgabe. Diese Stämme sind mutiert für das RDE-1-Argonautenprotein, eine Hauptkomponente im RNAi-Signalweg, der für ein effektives Gen-Silencing erforderlich ist21. Die Exprimierung des Wildtyps RDE-1 unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors führte jedoch zu einem wirksamen gewebespezifischen Gen-Knockdown41,42. Dieses Tool ermöglicht somit genetische Interaktionsscreenings ohne Verwendung gewebespezifischer Chaperone wie UNC-45 oder DNAJ-24M. Zum Beispiel führte der Schlag gegen hsp-6 (Mortalin) bei Wildtyptieren während der Entwicklung zu einem starken Entwicklungsstillstand (96±1% der RNAi-behandelten Tiere). Gleichzeitig führte der hsp-6-Knockdown in einem Stamm, der den Wildtyp RDE-1 im Muskel exprimierte, nicht zu einem Entwicklungsstillstand, während die Exprimierung des Wildtyps RDE-1 in Darmzellen zu einem starken Entwicklungsstillstandsphänotyp führte (90±3%; Abbildung 2). Daher ist die HSP-6-Funktion in Darmzellen für eine normale Entwicklung erforderlich. Eine Mutation in hsp-6 (mg585), die eine leichte Wachstumsverzögerung verursacht, kann daher verwendet werden, um chaperon-Interaktionen zu verschlimmern oder zu lindern, indem dieses mutierte Gen in einen intestinalspezifischen RNAi-Stamm überführt und die Chaperon-RNAi-Bibliothek untersucht wird.

Überwachung altersabhängiger Veränderungen in der Faltungsumgebung mittels genetischer Interaktionen
Tiere zeigen einen altersabhängigen Rückgang der Motilität, der mit sarkomerischer Desorganisation verbunden ist43,44,45. Veränderungen der Proteinfaltungskapazität fallen mit einer veränderten Regulation und Zusammensetzung der zellulären Proteostasemaschinerie28zusammen, einschließlich veränderter Konzentrationen von UNC-45, CHN-1 und UFD-2, Proteinen der Muskelqualitätskontrollmaschinerie46. In Übereinstimmung sind Myosinfaltung und -abbau durch Veränderungen der proteostatischen Kapazität beim Übergang ins Erwachsenenalter beeinflusst47. Wir haben daher gefragt, ob solche Veränderungen die Chaperon-Interaktionen beeinflussen könnten. Zum Beispiel haben wir den Einfluss von sti-1, ahsa-1 und daf-41 Knockdown auf die Motilität im Laufe der Zeit überwacht. Wir fanden heraus, dass, obwohl sti-1-, ahsa-1- und daf-41-RNAi-behandelteTiere während der Larvenentwicklung eine reduzierte Motilität zeigten, die Motilität bei unc-45 (ts) erwachsenen Würmern stark abnahm. Darüber hinaus war die MYO-3-Organisation bei unc-45(ts)-mutierten Tieren, die mit sti-1, ahsa-1 oder daf-41 RNAi behandelt wurden, ähnlich wie bei Wildtypwürmern im vierten Larvenstadium (L4), obwohl die Mutanten nach Erreichen des Erwachsenenalters gestörte Sarkomere zeigten (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu blieben sowohl unc-45(ts)-mutierte Tiere, die mit einer leeren Vektorkontrolle behandelt wurden, als auch Wildtyptiere unberührt(Abbildung 3). So könnte die Proteostasedynamik in Abhängigkeit von Alter oder Umweltbedingungen27,45,46,48,49 die Chaperoninteraktionen kritisch beeinflussen.

Figure 1
Abbildung 1: Aufbau von synthetischen RNAi-Interaktionsscreens mit C. elegans, der eine Mutation in einem Gen trägt, das für ein Chaperon von Interesse kodiert. (A) Schematische Darstellung des grundlegenden Aufbaus von gezielten Chaperon-Interaktionsbildschirmen. (B) Die Treffervalidierung erfordert die Bestätigung der genetischen Interaktion mit einer anderen Chaperonmutante sowie die Validierung der Spezifizierung des RNAi-Knockdowns. (C-D) Einfache Auslesungen, wie z. B. Motilitätsfehler, können quantifiziert werden, um erschwerende oder lindernde Wechselwirkungen mithilfe von Lähmungs- bzw. Thrashing-Assays zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Gewebespezifische RNAi des mitochondrialen Chaperons hsp-6 können verwendet werden, um genetische Interaktionen in einem Gewebe zu untersuchen. Wildtyp-Darm- und Muskel-spezifische RNAi-Stämme wurden mit hsp-6 RNAi behandelt und (A) Entwicklungsverzögerung wurde erzielt oder (B) Bilder wurden am ersten Tag des Erwachsenenalters aufgenommen. Die Daten sind mittelwert ± SEM, N=6. Der Maßstabsbalken beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Altersabhängige Effekte von RNAi. (A) Motilität mit dem Alter. Wildtyp- oder unc-45(e286)-Embryonen wurden bei 15 °C auf sti-1, ahsa-1 oder daf-41 RNAi-samente Platten gelegt und mit einem Thrashing-Assay in jedem Entwicklungsstadium, L1-L4, junge Erwachsene und Tag 1 des Erwachsenenalters auf Motilität bewertet. Die Daten sind mittelwert ± SEM, N=15. (B) Konfokale Bilder des Körperwandmuskels. Die Tiere wurden wie in A behandelt und im L4-, Jungalters- und Tag 1 des Erwachsenenalters fixiert und mit Anti-MYO-3-Antikörpern immungefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lösung Zubereitungshinweise Lagerung
1 M CaCl2 (1 L) 147,01 g CaCl2·2H2O hinzufügen Store bei RT
dH2O zu 1 L hinzufügen
Autoklav oder Filter (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6,0 (1 L) 136,09 g KH2PO4 hinzufügen Store bei RT
800 ml dH2O hinzufügen
Mit Magnetrührer mischen, bis sie sich aufgelöst haben
Titrieren Sie den pH-Wert mit KOH
dH2O zu 1 L hinzufügen
Autoklav oder Filter (0,22 μm)
1 mMgSO4 (1 l) 248,58 g MgSO4·7H2 Ohinzufügen Store bei RT
dH2O zu 1 L hinzufügen
Autoklav oder Filter (0,22 μm)
Cholesterinlösung (50 ml) Fügen Sie 250 mg Cholesterin zu einem 50 ml Falcon-Röhrchen hinzu Bei -20 °C lagern
Vollständig in 40 ml Ethanol auflösen
Ethanol zu 50 ml hinzufügen
1 M IPTG (50 ml) 11,9 g IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) in ein 50 ml Falcon-Rohr geben Im Dunkeln bei -20 °C lagern
Vollständig auflösen in 40 mLdH2O
dH2O zu 50 ml hinzufügen
Filter (0,22 μm), aliquot 1mL Röhrchen
Ampicillin-Brühe (50 ml) 5 g Ampicillin in eine 50 ml Falcon Tube geben Bei -20 °C lagern
Vollständig auflösen in 40 mLdH2O
dH2O zu 50 ml hinzufügen
Filter (0,22 μm), 1 mL Aliquot in Eppendorf-Röhrchen verteilen
Tetracyclin-Schaft (50 ml) 250 mg Tetracyclin in ein 50 ml Falcon Röhrchen geben Bei -20 °C lagern
Vollständig in 40 ml Ethanol auflösen
Ethanol zu 50 ml hinzufügen
Aliquot 1 mL Röhrchen
M9 Puffer (1 L) 5,8 g Na2HPO4·7H2O hinzufügen Store bei RT
3 g KH2PO4 hinzufügen
5 g NaCl hinzufügen
0,25 g MgSO4·7H2 Ohinzufügen
dH2O zu 1 L hinzufügen
Filter (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7,4) ( 1 L) Fügen Sie 8 g NaCl hinzu Store bei RT
Fügen Sie 200 mg KCl hinzu
1,44 g Na2HPO4·7H2O hinzufügen
240 mg KH2PO4 hinzufügen
Vollständig auflösen in 800 mL dH2O
Titrieren Sie den pH-Wert mit KOH tp pH 7,4
500 μL Tween-20 hinzufügen
dH2O zu 1 L hinzufügen
5x Probenpuffer 6,8 mL dH2O hinzufügen Bei -20 °C lagern
Fügen Sie 2 ml 0,5 M Tris pH 6,8 hinzu
Fügen Sie 3,2 ml Glycerin hinzu
Fügen Sie 1,6 ml 20% SDS hinzu
0,8 ml ß-Mercaptoethanol hinzufügen
1% Bromphenolblau

Tabelle 1: Lösungsrezepte

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Discussion

Ein integriertes Bild des Proteostase-Netzwerks, das widerspiegelt, wie es in verschiedenen Metazoenzellen und -geweben organisiert ist und funktioniert, fehlt weiterhin. Um dieses Manko zu beheben, sind spezifische Informationen über die Wechselwirkungen verschiedener Komponenten dieses Netzwerks, wie z.B. molekulare Chaperone, in bestimmten Geweben im Laufe der Entwicklung und Alterung erforderlich. Hier zeigten wir, wie die Verwendung von gewebespezifischen Störungen es uns ermöglichte, das Chaperonnetzwerk in einem bestimmten Gewebe zu untersuchen. Um gewebespezifische Chaperon-genetische Interaktionen zu untersuchen, wurden drei verschiedene Ansätze in Betracht gezogen. Im ersten Ansatz wurde UNC-45, ein Chaperon, das in Muskelzellen stark exprimiert wird, verwendet, um Chaperon-Interaktionen über Fütterung-RNAi25zu untersuchen. Während die Verwendung eines spezialisierten Chaperons eine anspruchsvolle Gewebespezifität ermöglicht, kann es nur über das hochfokussierte Subnetzwerk berichten, zu dem es beiträgt. Beachten Sie, dass die meisten C. elegans-Neuronen resistent gegen die fütterungsbasierte RNAi-Abgabe50 sind und daher dieser Ansatz zur Identifizierung genetischer Interaktionen in neuronalen Zellen die Kreuzung des untersuchten mutierten Chaperons mit einem RNAi-verstärkten Stamm51erfordert. In einem zweiten Ansatz wurde ein gewebespezifischer Promotor verwendet, um die Überexpression eines Chaperons im Muskel zu steuern und damit spezifisch die Muskelfaltungsumgebung zu beeinflussen40. Die Überexpression eines einzelnen Chaperons könnte jedoch im Allgemeinen für die Faltungsumgebung von Vorteil sein und somit eine Beeinträchtigung maskieren, die durch die beiden Chaperone zusammen verursacht wird. Der dritte Ansatz stützte sich auf gewebespezifischen RNAi-Knockdown, um Chaperon-Interaktionen in einem gegebenen Gewebe zu untersuchen41. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass er es ermöglicht, neuronale Zellen, die gegen die RNAi-Abgabe resistent sind, über die Fütterung42anzusprechen. Dennoch erfordert dieser Ansatz die Verwendung einer milden Mutante (wenn auch nicht spezialisiert), sowie dass diese Mutante in eine rde-1-Nullmutante gekreuzt wird, die ein gewebespezifisches rde-1-Rettungsgen trägt. Wichtig ist, dass diese Ansätze kombiniert werden können, um die Chaperonfunktion in einem einzelnen Gewebe oder sogar einer einzelnen Zelle zu modulieren.

Die Qualitätskontrollmaschinerie kann die Funktion vieler Genprodukte beeinflussen, indem sie die Proteostase stört. Dies ist eine große Herausforderung bei der Verwendung genetischer Interaktionen zur Erforschung des Qualitätskontrollnetzwerks18. Zum Beispiel führte die chronische Expression von aggregationsanfälligen Proteinen oder der Proteostasekollaps beim Altern zu einer phänotypischen Verschlimmerung vieler nicht verwandter metastabiler Proteine in C. elegans und Hefe45,52,53. Darüber hinaus wurde die Clathrin-vermittelte Endozytose in Säugetierzellen durch funktionelle Sequestrierung von Hsc70 an Proteinaggregate gehemmt. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Endozytose durch Hsc70-Überexpression gerettet werden konnte, während die Aggregation nicht54,55 . Ebenso identifizierte ein genetischer Screen in Drosophila, der Regulatoren der Hitzeschockreaktion aufdecken sollte, eine Missense-Mutation im Flugmuskelaktin, die die Hitzeschockreaktion konstitutiv aktivierte56. Zusammengenommen kann eine Störung des Proteostase-Netzwerks metastabile Proteine freilegen oder Stress induzieren, der sich auf die Spezifität der Ergebnisse auswirken kann. Nichtsdestotrotz kann die Analyse genetischer Interaktionen zu hochspezifischen und funktionellen Erkenntnissen führen. Beispielsweise identifizierten epistatische Analysen von Hefegenen, die für die Faltung im endoplasmatischen Retikulum erforderlich sind, spezifische genetische Wechselwirkungen zwischen molekularen Chaperonen, die anschließend validiert wurden19. Ebenso identifizierte ein erschwerendes Screening auf Chaperone, die die Toxizität von zwei aggregationsanfälligen Modellen (gemessen an der Motilität) erhöhen, eine spezifische Untergruppe von 18 Chaperonen, deren Orthologe die Huntingtin-Aggregation in menschlichen Zellen beeinflussten26. Hier haben wir gezeigt, dass verschiedene Störungen des Proteostase-Netzwerks spezifische und funktionelle Chaperon-Interaktionen aufdecken können.

Der Hauptvorteil der Verwendung von RNAi-fütterungsbasierten genetischen Interaktionsbildschirmen ist die relative Einfachheit der Methode. Selbst die Verwendung eines allgemeinen Verhaltensoutputs, wie z. B. Motilität, kann neue genetische Interaktionen aufdecken (Abbildung 3). Variabilität und Teileffekte des Expressions-Knockdowns können jedoch die Robustheit und Spezifität der Ergebnisse einschränken57. Darüber hinaus sind genetische Interaktionen kein Hinweis auf physische Interaktionen, und die Beziehung zwischen zwei Genen könnte daher indirekt sein. Die Art der Interaktionen zu erforschen und unspezifische Interaktionen zu verwerfen, kann zeitaufwendig sein57,58,59. Dies ist ein Problem, das bei der Bildschirmeinrichtung und -validierung berücksichtigt werden muss. Zum Beispiel ermöglicht die Verwendung von Null-Allelen im genetischen Screening zu bestimmen, ob diese Gene in einem bestimmten biologischen Prozess auf den gleichen oder unterschiedlichen Wegen funktionieren. Unter Verwendung eines partiellen Verlusts der Genfunktion, hypomorpher Allele, wie temperaturempfindlicher Allele, oder RNAi-abhängiger Herunterregulierung der Expression, führt dies jedoch zu Restaktivitäten, die zu verschlimmernden oder lindernden Phänotypen führen können, unabhängig davon, ob die Gene auf dem gleichen oder in parallelen Signalwegen wirken59. Daher erfordert die Art jeder Interaktion eine weitere Analyse. Die Verwendung hypomorpher Allele und RNAi könnte jedoch eine breite Palette von Interaktoren identifizieren, einschließlich Gene im selben Proteinkomplex oder -signalweg oder in einem redundanten Signalweg59. Während dieser größere Umfang möglicher Interaktionen in einem genetischen Screen zu mehr Treffern führen kann, kann er auch zu unspezifischen Interaktionen führen, wie zum Beispiel der unspezifischen Exposition von temperaturempfindlichen Allelen beim Proteostasekollaps45,53.

Treffervalidierung und unspezifische Interaktionen können auf verschiedene Arten untersucht werden. Die Anzahl der Treffer sollte gering sein. Zum Beispiel führte die Herunterregulierung der Chaperonexpression in einem unc-45-mutierten Hintergrund zu einem kleinen Prozentsatz von Treffern (4%), wobei die meisten Chaperon-Gen-Down-Regulation keinen Einfluss auf die Motilität zeigten. Eine ähnliche Rate wurde beobachtet, wenn DNJ-24M überdeprimiert wurde (6%). Wie oben erwähnt, identifizierte ein Screening auf Chaperon-Interaktionen mit aggregationsanfälligen Proteinen 18 Chaperone von 219 gescreenten (8%).

Es sollten mehrere mutierte Allele, Überexpressionslinien oder Krankheitsmodelle verwendet werden. Die Verwendung verschiedener mutierter Allele, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Chaperonfunktion haben, sowie verschiedener Stämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund kann die Spezifität von Bildschirmtreffern unterstützen. Alternativ kann die Verwendung von Mutation oder Überexpression eines anderen Chaperons, das nicht zu einer ähnlichen Störung führt, als Negativkontrolle dienen. Zum Beispiel zeigten sowohl unc-45(e286) als auch unc-45(m94) ein erschwerendes Verhalten, wenn sti-1, ahsa-1 oder daf-41 herunterreguliert wurden. Darüber hinaus wurde eine ähnliche Wechselwirkung beobachtet, wenn Tiere, die die ahsa-1(ok3501)-Deletionsmutante trugen, mit hsp-90 RNAi25behandelt wurden.

Die Identität der Chaperontreffer und ihre bekannten Wechselwirkungen sollten untersucht werden. Zum Beispiel sind Chaperone, die in einem unc-45 verschlimmernden Bildschirm identifiziert werden, ein hochspezifischer Satz von Chaperonen, die für den HSP-90 ATPase-Zyklus erforderlich sind, einschließlich derjenigen, die einen Client-Recruiter (STI-1), einen Remodeling-Co-Chaperon (AHSA-1) und ein Client-Reifungs-Co-Chaperon (DAF-41) kodierieren. Tatsächlich bildet dieser Satz von Co-Chaperonen einen vollständigen HSP-90-Faltzyklus60. Ebenso identifizierte ein DNJ-24M-Bildschirm HSP-1, den Hauptbegleiter von Hsp40s40.

Veränderungen der Interaktionen über die Lebensdauer des Tieres sollten ebenfalls untersucht werden. Zum Beispiel beeinflussten Chaperone, die im unc-45 verschlimmernden Bildschirm identifiziert wurden, die Motilität und Myosinorganisation im Erwachsenenalter stark, hatten aber während der Entwicklung eine mildere Wirkung. Dies könnte auf Veränderungen im Proteostase-Netzwerk im Erwachsenenalter28 oder auf Veränderungen der Myosinfaltungsanforderungen zwischen Myofaserfaltung und Wartung zurückzuführen sein.

Verwenden Sie komplementäre biochemische Ansätze, um die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen sowie deren Lokalisation in der Zelle direkt zu untersuchen. Zum Beispiel sind die HSP-90-Co-Chaperone, STI-1, AHSA-1 und DAF-41, auf das Sarkomer lokalisiert, wo sie mit Myosin25interagieren.

C. elegans ist ein etabliertes Metazoenmodell zur Überwachung der Qualitätskontrolle. Es wird häufig verwendet, um die zelluläre und organismische Proteostase mit einem variablen Toolkit aus zellbiologischen, biochemischen und genetischen Ansätzen zu überwachen. Hier setzten wir genetische Screening-Ansätze und verfügbare Werkzeuge57,58,59, wie eine Mutantenbank, verfügbare RNAi-Bibliotheken22,23 und gewebespezifische RNAi-Stämme 41,42, ein, um Chaperon-Interaktionen ineinemlebenden Tier während der Entwicklung und Alterung zu überwachen. Die Verwendung einfacher Verhaltenstests wie Motilität vereinfacht das Screening vieler möglicher Genpaare, um neue genetische Interaktionen zu erforschen. Dies kann dann als Plattform dienen, um die Chaperonlokalisierung und physikalische Interaktionen mit biochemischen Werkzeugen weiter zu untersuchen, um ihre potenziellen Wechselwirkungen in vivo und in vitro mechanistisch zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um neuartige Chaperon-Interaktionen im C. elegans Körperwandmuskel25,40zu identifizieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird, für einige der Nematodenstämme. Monoklonale Antikörper, die von H.F. Epstein entwickelt wurden, wurden aus der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und vom Department of Biology der University of Iowa gepflegt wurde. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Israel Science Foundation (Stipendium Nr. 278/18) und durch ein Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Ministeriums für auswärtige Angelegenheiten und internationale Zusammenarbeit, Generaldirektion für Länderförderung, Italienische Republik (Zuschuss Nr. 3-14337) unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Ben-Zvi-Labors für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 160 Caenorhabditis elegans Chaperon genetische Interaktionen Proteostase RNAi Screen temperaturempfindlich
Verwendung von <em>Caenorhabditis elegans</em> zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen
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Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

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