Summary

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

Published: June 02, 2020
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Summary

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。

Abstract

マウス胚性幹細胞(mESC)の神経分化は、神経新生に関与する重要なメカニズムを解明し、再生医療に役立つ可能性のあるツールです。ここでは、組み合わせスクリーニングの戦略を用いて インビトロでのmESCからのニューロン分化のための効率的かつ低コストの方法を確立しました。ここで定義された条件の下で、2日間の胚体形成+6日間のレチノイン酸誘導プロトコルは、ネスチン陽性であるよく積み重ねられ、神経突起のようなA2loxおよび129誘導体の形成によって見られるように、mESCから神経前駆細胞(NPC)への迅速かつ効率的な分化を可能にする。胚体の健全な状態とレチノイン酸(RA)が適用される時点は、RA濃度と同様に、その過程で重要である。NPCからニューロンへのその後の分化において、N2B27培地II(神経基底培地によって補完される)は、神経細胞の長期的な維持および成熟をよりよく支えることができる。提示された方法は、高効率、低コスト、操作が容易であり、神経生物学や発生生物学の研究のための強力なツールとなり得る。

Introduction

胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、神経前駆細胞(NPC)に分化し、その後、特定の条件下でニューロンに分化することができる1。ESCベースの神経新生は、神経新生を模倣するための最良のプラットフォームを提供し、したがって、発生生物学研究のための有用なツールとして機能し、潜在的に再生医療2、3を支援する。過去数十年の間に、トランスジェニック法4のような胚性神経新生を誘導するための多くの戦略が報告されている、小分子5を用いて、3Dマトリックス微小環境6を用いて、および共培養技術7を用いた。しかし、これらのプロトコルのほとんどは、条件が制限されているか、操作が困難であるため、ほとんどの研究室での使用には適していません。

mESCからの効率的な神経分化を達成するために、操作が容易で低コストの方法を見つけるために、ここで組み合わせスクリーニング戦略を使用しました。図1に記載されているように、胚性神経新生の全過程を2相に分けた。フェーズIはmESCからNPCへの分化プロセスを指し、第II相はNPCからニューロンへのその後の分化に関連する。容易な操作、低コスト、容易に利用できる材料および高い分化効率の原則に基づいて、フェーズIの7つのプロトコルおよびフェーズIIの3つのプロトコルは、伝統的な付着単層培養システムまたは胚体形成システム8、9に基づいて選択された。両相におけるプロトコルの分化効率を、細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを用いて評価した。各フェーズの最も効率的なプロトコルを組み合わせることで、mESCからの神経分化のための最適化された方法を確立しました。

Protocol

1. マウス胚性幹細胞培養 0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養皿またはプレートを準備します。 滅菌した0.1%のゼラチン(水中0.1%w/v)を60mm細胞培養皿に2mL加えます。細胞培養皿のコーティングを確実にするために、穏やかにロックします。 37°Cで5%CO2インキュベーターに皿を入れ、1時間コーティングを行います。 細胞を播種する前に0.1%ゼラチン溶液を…

Representative Results

2日間の胚体形成+ 6日間のRA誘導は、MESCのNPCへの分化(フェーズI)を導くのに最適です。MESCsのNPCへの分化を最も促進する最適なプロトコル(フェーズI)を決定するために、A2loxと129 mESCsの両方で7つのプロトコルをテストし、各群の分化状況を光顕微鏡で監視した。 図3Aに示すように、ほとんどのA2loxおよび129誘導体は「2日間の胚体形成+6日間のRA誘導」処置(フェ…

Discussion

本研究では、低コストで容易に得られる物質を用いて、mESCからの神経細胞分化の簡便かつ効果的な方法を確立した。この方法では、2日間の胚体形成後に6日間のRA誘導が行われ、MESCsのNPCへの分化を効果的に促進することができる(フェーズI-プロトコル3)。第II相分化のために、N2B27培地II(フェーズII-プロトコル3)は、NPCからニューロンへの分化を最も効果的に誘導する。成功を確実にするため?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(No. 31501099)と中国湖北省教育部の中高年と若者(No.Q20191104)。そして、武漢科学技術大学のウェンシェン・デン教授が、マウス胚性幹細胞株A2loxを提供してくれたことに感謝します。

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401] Abcam Ab11306 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit Sigma Aldrich T2200 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044 stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021) Selleck S1263 stored at -20 °C
Coverslips NEST 801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x) HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy Olympus CKX53
Gelatin Gibco CM0635B stored at room temperature
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12 Gibco 12660012 stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human Sigma L5283 stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield Abcam ab104139 stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution Gibco 11140076 stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum Jackson 005-000-121 stored at -20 °C
Neurobasal Medium Gibco 21103049 stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish Corning 3262
Phosphate Buffered Saline (1X) HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution HyClone SV30010 stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib) Selleck S1036 stored at -20 °C
Retinoic acid Sigma R2625 stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells Cyagen MUAES-01001 Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free) ZENOAQ stem cellbanker DMSO free stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution HyClone SH30042.01 stored at 4 °C
Triton X-100 Sigma T8787
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
6 – well plate Corning 3516
60 mm cell culture dish Corning 430166
15 ml centrifuge tube NUNC 339650

References

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Cite This Article
Mao, X., Zhao, S. Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro. J. Vis. Exp. (160), e61190, doi:10.3791/61190 (2020).

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