Summary
Bu makalede, izole ve sivrisinek midgut kültlenebilir mikropların belirlenmesi, sivrisinek bağırsak bakterilerin antibiyotik tükenmesi de dahil olmak üzere bireysel sivrisinek bağırsak bakterilerin etkisini araştırmak için bir protokol sunuyor ve belirli bir bakteri türleri yeniden tanıtmak.
Abstract
Sivrisinek midgut konak metabolizmasını etkileyen son derece dinamik bir mikrobiyom barındırır, üreme, fitness, ve vektör yeterlilik. Bir bütün olarak bağırsak mikroplarının etkisini araştırmak için çalışmalar yapılmıştır; ancak, farklı mikroplar ana bilgisayara karşı farklı etkiler uygulayabilir. Bu makalede, her belirli sivrisinek bağırsak mikrobu ve potansiyel mekanizmanın etkisini incelemek için metodoloji sağlar.
Bu protokol iki bölümden oluşur. İlk bölümde sivrisinek midgut diseksiyon, kültleştirilebilir bakteri kolonileri izole ve bakteri türlerini tanımlamak nasıl tanıttı. İkinci bölüm antibiyotik tedavi sivrisinek oluşturmak ve belirli bir bakteri türlerini yeniden tanıtmak için prosedür sağlar.
Introduction
Sivrisinekler zika virüsü, Dang virüsü ve Plazmodium parazitleri1 dahil olmak üzere yüzden fazla patojenilen insan patojenik hastalıkların en önemli vektörleri olarak kabul edilir. Sivrisinekler oviposition için besin elde etmek için bir kan yemek almak, yanlışlıkla sindirimsistemi2 yoluyla enfekte bir konak tan patojenleri yutabilir . Daha da önemlisi, sivrisinek midgut, hangi kan yemek sindirim ve patojen girişinde hem3de önemli bir rol oynar, son derece dinamik mikrobiyom 3 limanlar .
Çeşitli çalışmalar da bir kültüre bağlı yöntem ya da bir bakteri sıralama tsay4,5,,6kullanarak laboratuvar yetiştirilen ve alan toplanan sivrisinek mikrobiyota karakterize var. Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiave Enterococcus gibi türler genellikle çeşitli çalışmalarda sivrisinek izole5,7,8,9. İlginçtir, sivrisinek bağırsak mikrobiyota dinamik olarak hem toplum çeşitliliği ve bakteri türlerinin miktarı, geliştirme aşamasından etkilenen, türler, coğrafi kökeni ve beslenme davranışı4dalgalanmalar . Çalışmalar kan besleme önemli ölçüde Enterobacteriaceae türlerin hızlı genişleme ve genel çeşitlilik bir azalma ile toplam bakteri yükünü artırır göstermektedir10,11. Buna ek olarak, larva evresinin sivrisinek bağırsağı mikrobiyotası genellikle böcek pupasyon ve klozyon sırasında metamorfoz geçirdiğinde ortadan kalkar; böylece, yeni ortaya çıkan yetişkin sivrisinekmikrobiyotayenidengerekir 4 .
Gut mikrobiyota besin emilimi, bağışıklık, geliştirme, üreme ve vektör yeterlilik12dahil olmak üzere çeşitli yönleriyle, böcek fizyolojisi modüle. Bir bakteri oral kaynağı gelişimi kurtarır iken Axenic sivrisinek larvaları ilk instar ötesinde geliştirmek için başarısız, sivrisinek bağırsak mikrobu larva gelişimi için gerekli olduğunu belirten13,14. Ayrıca, bağırsak bakterilerin tükenmesi kan yemek sindirim ve besin emilimini geciktirir, yumurta olgunlaşmaetkiler, ve oviposition azalır15. Buna ek olarak, bağırsak mikroflorası ile sivrisinekler antibiyotik tedavi sivrisineklere göre daha yüksek bağışıklık yanıtları ortaya çıkarmak, diğer patojenlere karşı sürekli yüksek antimikrobiyal peptit ekspresyonu ile16. Antibiyotikler genellikle sözlü olarak bu çalışmalarda pan bağırsak bakterileri kaldırmak için uygulanır, ve daha sonra deneyler kommensal mikroplar ile axenic sivrisinek ve sivrisinek arasındaki farkı karşılaştırmak için yapılır. Ancak, sivrisinek midgut mikropların çeşitli bir topluluk limanlar, ve her bakteri türleri konak fizyolojisi doğru farklı bir etki uygulayabilir.
Sivrisinek mikrobiyota farklı etkileri ile vektör yetkinliğini düzenler. Dang humması endemik bölgelerin alan kaynaklı sivrisineklerden izole proteus tarafından kolonizasyon upregulated antimikrobiyal peptit ekspresyonu ve dang virüsü enfeksiyonuna karşı direnç verir16. Entomopatojenik mantar Beauveria bassiana arbovirüsenfeksiyonu17karşı Toll ve JAK-STAT bağışıklık yolu aktive . Buna karşılık, mantar Talaromyces Aedes aegypti midgut izole gut tripsin aktivitesimodüleederek dang virüsü enfeksiyonu kolaylaştırır 18 . Buna ek olarak, Serratia marcescens smEnhancein adlı bir salgı proteini ile arbovirüs iletimi teşvik, sivrisinek bağırsak epitel üzerinde müsin tabakası sindirir19.
Bu prosedür, sivrisinek midgut diseksiyon, kültleştirilebilir bakteri kolonilerinin izolasyon, bakteri türlerinin belirlenmesi ve oral beslenme yoluyla yeniden giriş için sistematik ve sezgisel bir yöntem sağlar. Bu bir kommensal bakteri ile kan besleme temsili sonuçlar sağlar, Chryseobacterium meningosepticum, sivrisinek yumurtalık gelişimi ve oviposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Midgut diseksiyon ve kültleştirilebilir bakteri izolasyonu
- Sivrisineği diseksiyona hazırla.
- Bir aspiratör ile ortaya çıktıktan 7-9 gün sonra sivrisinek toplamak. Toplanan sivrisinekleri 3-5 dakika boyunca 4 °C'lik bir sıcaklığa maruz bırakarak anestezi yapın ve sivrisinekleri buz gibi bir Petri kabında diseksiyona kadar anestezi yedirin.
- Laboratuvar aletlerini ve sivrisinek yüzeyini sterilize edin.
- Çevredeki bakterilerin kirlenmesini önlemek için %75 etanol püskürterek mikroskop, forceps ve cam kaydırağı inceleyerek deney tezgahını sterilize edin.
- %75 etanol içeren steril petri kabı ve steril 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içeren iki Petri kabı hazırlayın.
- Yüzey-daldırma ve 3 dakika için% 75 etanol onları sallayarak sivrisinek sterilize, ve etanol diseksiyon gut florasını etkiler durumda 1x PBS tampon ile iki kez durulayın.
- Sivrisinek midgut incelemek.
- Yüzeysterilize edilmiş sivrisineği steril 1x PBS tamponu damlasıyla cam kaydırağa aktarın. Kesişen mikroskop altında kesip.
- Diseksiyon mikroskobun alt büyütme altında, dikkatle kaçış önlemek için bacaklar, kanatlar ve sivrisinek baş kaldırın. Sindirim sisteminin kırılmasını önlemek için sivrisinekleri doğrudan keserek, çekmek yerine doğrudan keserek son somite'yi çıkarın.
- Sivrisineğin göğüs kafesini ve karın ucunu büşralarla sıkıştırın. Yavaşça sivrisinek sindirim sistemi çekin. Edinilen sindirim sistemi genellikle ekin, foregut, midgut, hindgut ve Malpighian tüpleri içerir.
- Diseksiyon mikroskobu daha yüksek bir büyütmeye ayarlayın. Sivrisinek midgut almak için parçalanmış sindirim sisteminden kırpma, foregut, hindgut ve Malpighian tüpleri çıkarın.
- Sivrisinek bir şeker yemek alır sonra ürün şişirer ve midgut benzer gibi, ürün çıkarırken dikkat edin. Malpighian tüpleri, uzun ve ince boşaltım tüpleri bir grup, midgut ve hindgut arasındaki sınırda yer almaktadır.
- Bağırsak bakterilerini izole et.
- Diseksiyonlu midgut'u 200 μL steril 1x PBS tamponu ile steril 1,5 mL tüpe aktarın.
- Tampon bağırsak bakterilerin tam serbest bırakmak için steril bir tezgah üzerinde iyice steril bir tezgah üzerinde midgut Grind.
- Seri üç 10 kat seyreltme homojenate seyreltin. LB (Luria suyu) agar plakaya her seyreltme 50 μL ekleyin ve sonra plaka üzerine yayıldı. Midgut bağırsak florasının yüksek konsantrasyoniçeriyorsa, tek koloniler almak için daha fazla seri seyreltme yapmak esastır.
- Tek koloniler görünene kadar plakayı 37 °C'de 1-2 gün kuluçkaya yatırın.
- Tür tanımlama
- Tek kolonileri seçin ve sırasıyla 50 mL LB et suyu orta içeren 150 mL konik şişe içine aşılayın.
- Bir gecede bakterileri 37 °C'de sallayın.
- Bakteriyel genomik DNA çıkarma kiti ile toplam DNA ayıklayın. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile 16S rDNA'yı yükseltin.
NOT: 16S rDNA'da korunan birden fazla segment vardır. Bu korunmuş bölgelere dayanarak, bakteriler için evrensel astarlar tüm bakterilerin 16S rDNA parçalarını yükseltmek için tasarlanabilir. Bu astarlar bakterilere özgü, ve 16S rDNA değişken bölgede fark farklı bakterileri ayırt etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, 16S rDNA yaygın bakteriyel tanımlama için kullanılır. - Agarose jel elektroforezi ve ticari jel geri kazanım kiti ile PCR ürünlerindeki DNA parçalarını kurtarın ve arındırın.
- Bakteriyel gen dizilerini elde etmek için saflaştırılmış DNA parçaları üzerinde DNA dizilimi yapın.
- 16S rRNA gen dizisini GenBank'taki bakteri dizilimi ile karşılaştırın. Bakteri ve Arkea veritabanını seçin.
NOT: Tür düzeyine tanımlama , en yakın GenBank girişine ≥99% 16S rDNA dizisi benzerliği olarak tanımlanmıştır. İzole, 16S rDNA dizisi benzerliği <%99 ve ≥%95 olduğunda ilgili cinse atandı.
2. Antibiyotik tedavisi ve bakteri reintroduction
- Antibiyotik çözeltisini hazırlayın.
- 20 ünite penisilin ve mL başına 20 g streptomisin içeren %10 sakaroz çözeltisi hazırlamak için gerekli miktarda sakaroz, penisilin ve streptomisin tartın.
- Antibiyotik çözeltisi ile sivrisinek beslemek.
- Sivrisinekleri 4 °C'de 3-5 dakika süreyle anestetize edin. Sivrisinekleri kağıt bir bardağa aktarın. Üzerini gazlı bezle örtün ve sivrisineklerin kaçmasını önlemek için gazlı bezi bantla gıyabında dolayın.
- Antibiyotik çözeltisi içine daldırma steril pamuk topları ve sivrisinek fincan dikkatlice yerleştirin. Damlama pamuk topları boğulma sivrisinek önlemek için kullanmadan önce pamuk topları sıkın.
- Nem buharlaşmasını önlemek için pamuk toplarını 10 cm Petri kabıile kaplayın. Üç gün üst üste pamuk topları günde iki kez değiştirin.
- Antibiyotik tedavisinin etkinliğini doğrulayın.
- Yukarıdaki yönteme göre, antibiyotik tedavi sivrisinek midgut incelemek.
- Diseksiyonlu midgutları 200 μL steril 1x PBS tamponu ile steril 1,5 mL tüpe aktarın.
- Tampon bağırsak bakterilerin tam serbest bırakılması sağlamak için steril bir haşere ile iyice steril bir tezgahta grind midguts.
- Bakteriyel genomik DNA çıkarma kiti ile bağırsak mikrobiyal DNA ayıklayın.
- Evrensel eubacteria astarları (16S rRNA F: TCCTACTACGGGAGGCAGGT ve R: GGACTACCAGGGTGTTAATTTGTT) kullanarak genomik DNA üzerinde gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ile bakteriyel nicel niceleme gerçekleştirin.
- Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması
- Bakteriyel çözeltiyi spektrofotometre ile ölçün. 1 mL tüp içine 1 OD (OD600) bakteriyel süspansiyon ekleyin. Süspansiyonu 5000 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya santrifüj edin.
- Supernatant atın ve süspansiyon yağış için 1,5 mL tüp steril 1x PBS tampon 1 mL ekleyin.
- 4 °C'de 5 dk için 5.000 x g santrifüj; supernatant atın.
- 2.4.2 ve 2.4.3 adımlarını tekrarlayın.
- Bakteriyel yağış için steril 1x PBS tampon 200 μL ekleyin.
- Steril 1,5 mL tüpe %10 sakaroz çözeltisi, 200 mm ATP (fagosisans görevi görür) ve 200 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin. Girdap ile karıştırın. Alternatif olarak, ısı yakan kanda peletlenmiş bakteriyel askıya.
- Isı yalıtılmış kanın hazırlanması
- Bir antikoagülan tüp ile taze kan toplamak.
- 2-3 mL taze kan alın. Plazma ve kan hücrelerini ayırmak için 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj. Santrifüj ve yıkama işlemi sırasında kanın kaybolacağını unutmayın; kullanımı önceden hesaplamak için bir ihtiyaç vardır.
- Plazmayı yeni bir 1,5 mL tüpe toplayın ve 56 °C'de 1 saat boyunca ısı yada etkisiz hale getirin.
- Kan hücrelerinin süspansiyonu için 1,5 mL tüpe 500 μL steril 1x PBS tampon ekleyin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin ve sonra süpernatantı atın.
- Adımı 2.4.7.4'u iki kez tekrarlayın.
- Isı-inaktive kan elde etmek için ısı-inaktive plazma ile kan hücrelerini resuspend.
- 1 OD bakteriyel peleted almak için adımları 2.4.1 için 2.4.4 izleyin.
- 1 mL ısı yalıtımlı kan ile peletlenmiş bakterileri yeniden askıya alın.
- Sivrisinekleri bakteri süspansiyonuyla besleyin.
- 24 saat için sivrisinek açlıktan, antibiyotikler bakterileri beslemeden önce metabolize izin.
- Membran besleme sistemini birleştirin.
- Sterilize besleyici üniteyi alternatif olarak kollajen membran olan parafilm ile kapatın.
- Plastik bir halka tonulayın ve besleme sırasında sürtünme nedeniyle kırılmasını önlemek için parafilm ile düzeltin.
- Hazırlanan bakteriyel solüsyonu yavaş yavaş besleyici ünitesine ekleyin. İki kuyulu besleyici ünitenin yalnızca bir kuyusu çözümle doldurulabilir ve besleyici ünitesini yalnızca reaktif bırakan taraftan kaplayabilir.
- Besleyici ünitesini önceden ısıtılmış 37 °C'ye kadar ısıtılmış bir besleme sistemine bağlayın, bu da sivrisinekleri çekmek için insan sıcaklığını simüle eder. Besleme cihazını sivrisineklerle dolu bir kâğıt kabın üzerine yerleştirin ve 90 dk yemle.
- Beslendikten sonra sivrisinekleri 3-5 dk boyunca 4 °C'lik bir sıcaklığa maruz bırakarak anestezi yapın ve sivrisinekleri buz gibi bir Petri kabında anesteziye tabi tutun.
- Daha fazla çalışma için tam tıkanmış sivrisinek seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antibiyotik le tedavi edilen ve antibiyotiksiz sivrisineklerin orta gutları DNA ekstraksiyonu için çıkarıldı ve qPCR evrensel bakteriyel astarlarla yapıldı. Şekil 1 kontrol grubu ve antibiyotik tedavi grubunda bakteriyel 16S rRNA ekspresyonu gösterir. Sonuçlar bağırsak bakterilerinyaklaşık% 98 kaldırıldı ve penisilin ve streptomisin bağırsak sterilizasyonu başarılı olduğunu göstermektedir.
Açıklanan yöntemlerle bakteri suşları izole edilip tespit edilmiştir. C. meningosepticum bir nonfermenting, oksidaz-pozitif gram-negatif aerobik basil, Chryseobacteriumait . Şekil 2 C. meningosepticumile antibiyotik tedavi sivrisinek kan beslenmesonra sivrisinek başına yatırılen ortalama yumurta gösterir. Şekil 3 c. meningosepticumiçeren kan unu sonra 24 saat yumurtalık gelişimi ile ilgili genlerin ekspresyonu gösterir. Yumurtalık gelişimi ile ilgili genlere ve astar dizilerine genel bir bakış Tablo 1'delistelenmiştir.
Bağırsak bakterilerinin uzaklaştırıldığı bağırsak bakterilerinden izole edilen suş ve daha sonra tamamen tıkanmış sivrisinekler üç gruba ayrıldı. Birinci grupta beş, ikinci grupta ise yumurtlama miktarını saymak için beş dişi, üçüncü grupta ise 10 dişi, her dişi sivrisinek ten sonra yumurtalık gelişimine bağlı gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanıldı. Sonuçlar, kontrol grubunun ve beslenme grubunun yumurta üretiminde önemli bir değişiklik olmadığını göstermektedir.
Şekil 1: Antibiyotik tedavisinden sonra 16S rRNA ekspresyonu. Tedavi edilmeyen antibiyotiklerile sivrisinekler kontrol grubu olarak görev yaptı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2:Bağırsak mikrobunun sivrisinek ovipozisyonu üzerine etkisi. Belirtilen bakteri suşları kan ile karıştırılır ve antibiyotik tedavi sivrisinek beslenen. İşlenmemiş bağırsak kommensal mikroplarile sivrisinek kontrol grubu olarak görev yaptı. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur.
Şekil 3: Kan dansonra üremeile ilgili genlerin ekspresyonu. Cathepsin B(A),Mitokondriyal ATAz inhibitörü(B),Ribozom biyogenez protein brix (C),ve Serine/Threonin-protein kiazaz rio2 (D) ifadesi antibiyotik le tedavi edilen sivrisineklerin kanla beslenmesi sonrası 24 saat boyunca belirtilen bakteri suşları ile. İşlenmemiş bağırsak kommensal mikrobu ile sivrisinekkontrol grubu olarak görev yaptı. Her nokta bir sivrisineği ve her satır grubun ortanca değerini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | gen numarası | astar dizisi |
| Cathepsin B | AAEL009642 | İleri astar-GAGGGAAAAGTTCGATGTGGA |
| Ters astar-AATCCCACATCCACCCAGTA | ||
| Mitokondriyal ATPaz inhibitörü | AAEL004284 | İleri astar-CAACTGCACAAGCTGAAGGA |
| Ters primer-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT | ||
| Ribozom biyogenez protein brix | AAEL001917 | İleri astar-GAACAGCACAAGCGAATGAA |
| Ters primer-TTGGCCTTGAGAGTCGTCTT | ||
| Serine/Treonin-protein kiazrio2 | AAEL011114 | İleri astar-GAGGAGAAAGCAGCACAACC |
| Ters primer-TCGAATGGCTTTTTTCCATTTC |
Tablo 1: Yumurtalık gelişimi ile ilgili genler ve astar dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konak-mikrop etkileşimleri üzerine yapılan araştırmalar, farklı bağırsak mikroplarının farklı mekanizmalar aracılığıyla konak fizyolojilerini etkilediğini ortaya koydu. Bu makalede sivrisinek bağırsak mikrobu ilgili rolünü araştırmak için yöntem tanıttı, sivrisinek midgut diseksiyon dahil, kültleştirilebilir bağırsak bakterileri kültüre, antibiyotik tedavisi, ve ilgi bakterilerin yeniden tanıtılması.
Başarılı antibiyotik tedavisi için, deney icrasında aşağıdaki ayrıntılar göz önünde bulundurulmalıdır. Bu protokolde sivrisinekler , 20 ünite penisilin ve 20 g streptomisin olmak üzere %10 sakaroz çözeltisi ile nemlendirilmiş pamuk topları kullanılarak 3 gün boyunca tedavi edilmiştir11,16. Penisilin gram-pozitif bakterilere karşı geniş spektrumlu antibiyotik olarak görev yaptı, ve streptomisin gram-negatif bakterilere karşı geniş spektrumlu antibiyotik olarak görev yaptı20. Antibiyotiklerin uygun korunması etkili antibiyotik tedavisi için hayati önem taşımaktadır21. -18 °C'de depolandığında penisilin G'nin stabilitesi en az 3 m'dir. Streptomisin 4 °C22'dedepolandığında en az 12 m stabildir. Antibiyotik marka veya depolama süresi farklılıkları mikrobiyal açıklık hafif farklılıklara neden olsa da, her antibiyotik tedavisi sonrası verimliliği doğrulamak için gereklidir. QPCR ek olarak, plaka yayılan veya PCR kullanarak yaygın antibiyotik tedavisinin verimliliğini değerlendirmek için kullanılır23,24. Ayrıca, antibiyotik tedavisi sonrası sivrisineklerin diğer bakterilerle kontamine olmasını önlemek için, besleme testinin süper temiz bir tezgahın altında bir araya getirilmiş steril ekipmanlarla yapılması gerekmektedir.
Bakteriyel oral beslenme önce, sivrisinekler için açlıktan olmalıdır 24 saat antibiyotikler metabolize izinvermek için 25. Bu sadece sivrisinekler bakteri sıvı yutmak yardımcı olur, ama aynı zamanda bakterileri öldürme antibiyotik önler.
Kuşkusuz, bu protokol esas olarak kültleştirilebilir bakterilerin etkisini araştırmak içindir. Omurgalı ve omurgasız konak bağırsak mikrobiyota sı çalışmak için, antibiyotik tedavi konak için külteable bakterilerin reintroduction yaygın olarak son araştırmalarda kullanılır8,26,27. Buna ek olarak, kültürlü bağırsak bakterilerinin ilk tanımlama genellikle koloni boyutu, şekil, renk, kenar, opaklık, yükseklik ve tutarlılık28özelliklerine dayanmaktadır. Olmayan culturable bakteriler için, yüksek iş bölümü esaslı metagenomik yaklaşımlar midgut mikrobiyota29,,30,,31toplam bileşimi hakkında kapsamlı bilgi sağlamak olasıdır. Ancak, olmayan culturable bakteri ve konak arasındaki etkileşim büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır.
Bu makalede, sivrisinek oviposition üzerinde bağırsak mikrobu etkisini incelemek için iki alternatif seçenek sunuyor, ısı-inaktive kan veya şeker besleme yoluyla bakteri implantasyonu ile bakteri karışımı kan besleme takip. Bu el yazmasındaki temsili sonuçlar ilk seçeneği kabul ederken, ikinci yöntem benzer sonuçlar elde etti. Belirli bir bakteri türü ile oral beslenme den sonra çeşitli çalışmalar yapılabilir. Daha sonraki test, mikrobiyal faktörün sivrisinek lokomotor davranışını nasıl modüle ettigini araştırmak için kullanılabilir. Protein niceliği testi sindirim farklı bakterilerin etkilerini incelemek için takip edilebilir. Küçük değişikliklerle, bu yöntem çeşitli mikropların sivrisinek fizyolojisine yönelik etkilerini incelemek için kullanılabilir, besin emilimi, bağışıklık, gelişim, üreme ve vektör yeterliliği de dahil olmak üzere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81902094, 81600497) ve Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2019RS1036) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
