Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.
De mug midgut herbergt een zeer dynamisch microbioom dat het metabolisme van de gastheer, reproductie, fitness en vectorcompetentie beïnvloedt. Er zijn studies uitgevoerd om het effect van darmmicroben als geheel te onderzoeken; verschillende microben kunnen echter verschillende effecten op de host uitoefenen. Dit artikel biedt de methodologie om het effect van elke specifieke mug gut microbe en het potentiële mechanisme te bestuderen.
Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel introduceert hoe de mug midgut te ontleden, cultivable bacteriën kolonies te isoleren, en bacteriën soorten te identificeren. Het tweede deel biedt de procedure om met antibiotica behandelde muggen te genereren en één specifieke bacteriesoort opnieuw in te voeren.
Muggen worden beschouwd als de belangrijkste vectoren van menselijke pathogene ziekten, die meer dan honderd ziekteverwekkers overbrengen, waaronder het Zika-virus, het Dengue-virus en Plasmodium-parasieten 1. Wanneer muggen een bloedmaaltijd nemen om voedingsstoffen te verkrijgen voor ovipositie, kunnen ze per ongeluk ziekteverwekkers van een geïnfecteerde gastheer binnenkrijgen via het spijsverteringskanaal2. Belangrijk is dat de mug midgut, die een centrale rol speelt in zowel bloedmeel spijsvertering en pathogene ingang, herbergt een zeer dynamische microbioom3.
Verschillende studies hebben gekenmerkt lab-gefokte en veld-verzamelde mug microbiota met behulp van een cultuur-afhankelijke methode of een bacteriën sequencing test4,5,6. Soorten zoals Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaen Enterococcus worden vaak geïsoleerd van muggen in verschillende studies5,7,8,9. Interessant is dat muggendarmmicrobiota dynamisch fluctueert in zowel de diversiteit van de gemeenschap als de hoeveelheid bacteriesoorten, beïnvloed door het ontwikkelingsstadium, soorten, geografische oorsprong en voedingsgedrag4. Studies tonen aan dat bloedvoeding de totale bacteriële belasting drastisch verhoogt met een snelle expansie van soorten uit Enterobacteriaceae en een vermindering van de totale diversiteit10,11. Bovendien wordt muggenonderbuismicrobiota van het larvestadium meestal uitgeroeid wanneer het insect een metamorfose ondergaat tijdens verpopping en eclosie; dus, nieuw opgedoken volwassen muggen moeten hun microbiota4opnieuw bevolken .
Gut microbiota moduleert insectenfysiologie in verschillende aspecten, waaronder opname van voedingsstoffen, immuniteit, ontwikkeling, voortplanting en vectorcompetentie12. Axenic mug larven niet te ontwikkelen dan de eerste instar, terwijl een bacterie orale aanbod redt ontwikkeling, wat aangeeft dat de mug gut microbe is essentieel voor larve ontwikkeling13,14. Bovendien vertraagt uitputting van darmbacteriën de spijsvertering van de bloedmaaltijd en de opname van voedingsstoffen, beïnvloedt de rijping van de eicel en vermindert de ovipositie15. Bovendien lokken muggen met darmmicroflora hogere immuunresponsen uit in vergelijking met met antibiotica behandelde muggen, met voortdurend verhoogde antimicrobiële peptide-expressie tegen andere ziekteverwekkers om16te infecteren. Antibiotica worden meestal oraal toegediend om pan gut bacteriën te verwijderen in deze studies, en vervolgens experimenten worden uitgevoerd om het verschil tussen axenic muggen en muggen te vergelijken met commensale microben. Echter, de mug midgut herbergt een diverse gemeenschap van microben, en elke bacterie soort kan een duidelijk effect uitoefenen op de gastheer fysiologie.
Mosquito microbiota reguleert vector competentie met uiteenlopende effecten. Kolonisatie door Proteus geïsoleerd van veld-afgeleide muggen van dengue-endemische gebieden verleent upregulated antimicrobiële peptide expressie en resistentie tegen dengue virus infectie16. De entomopathogene schimmel Beauveria bassiana activeert de Toll en JAK-STAT immuunroute tegen arbovirusinfectie17. Daarentegen, de schimmel Talaromyces geïsoleerd van Aedes aegypti midgut vergemakkelijkt dengue virus infectie door moduleren gut trypsine activiteit18. Bovendien bevordert Serratia marcescens de overdracht van arbovirus via een secretoir eiwit genaamd SmEnhancin, dat de mucinlaag op het darmeptheel van muggen vertelt19.
Deze procedure biedt een systematische en intuïtieve methode voor dissectie van de mug midgut, isolatie van cultivable bacteriën kolonies, identificatie van de bacteriesoorten, en herintroductie via orale voeding. Het biedt representatieve resultaten van bloedvoeding met een commensale bacterie, Chryseobacterium meningosepticum, op mug eierstokontwikkeling en ovipositie.
Onderzoek naar gastheer-microbe interacties hebben aangetoond dat verschillende darmmicroben hun gastheerfysiologie beïnvloeden via uiteenlopende mechanismen. Dit artikel introduceert de methode om de respectieve rol van mug gut microbe te onderzoeken, met inbegrip van ontleden mug midgut, culturing cultivable darmbacteriën, behandeling met antibiotica, en herinvoering van de bacteriën van belang.
Voor een succesvolle behandeling met antibiotica moeten de volgende details worden overwogen b…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) en het Science and Technology Plan Project van de provincie Hunan (2019RS1036).
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
Cotton balls | |||
Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g; Agar 15.0 g. |
LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g. |
Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
Paper cup | Place mosquito | ||
Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
Single Channal Pipettor | Gilson | ||
Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |