Summary
本稿では、蚊中腸の品種微生物の単離と同定、蚊腸内細菌の抗生物質枯渇、特定の細菌種の再導入など、個々の蚊腸内細菌の影響を調査するためのプロトコルを提示する。
Abstract
蚊の中腸は宿主の代謝、生殖、適性およびベクトルの能力に影響を与える非常に動的なマイクロバイオームを収容する。腸内微生物全体の効果を調査するための研究が行われています。しかし、異なる微生物が宿主に対して明確な効果を発揮する可能性がある。本稿では、それぞれの特定の蚊の腸内微生物の効果と潜在的なメカニズムを研究するための方法論を提供する。
このプロトコルには 2 つの部分が含まれています。最初の部分では、蚊の中腸を解剖し、殺虫性細菌のコロニーを分離し、細菌種を同定する方法を紹介します。第2部は、抗生物質処理蚊を生成し、1つの特定の細菌種を再導入する手順を提供する。
Introduction
蚊は、ジカウイルス、デング熱ウイルス、および マラリア 原虫1を含む百の病原体を介して伝染する、ヒト病原性疾患の最も重要なベクターであると考えられている。蚊が卵子の栄養を得るために血液を摂取すると、感染した宿主から消化管2を介して誤って病原体を摂取する可能性がある。重要なことに、血液食事の消化と病原体の入り口の両方で重要な役割を果たす蚊の中腸は、非常にダイナミックなマイクロバイオーム3を抱えています。
いくつかの研究は、培養依存的な方法または細菌シーケンシングアッセイ44、5、65のいずれかを使用して、実験室で飼育され、フィールドに集められた蚊の微生物叢を特徴付けている。パントア、セラチア、クレブシエラ、エリザベスキンキヤ、エンテロコッカスなどの種は、一般的に様々な研究55、7、8、97,8,9で蚊から分離されています。興味深いことに、蚊の腸内微生物叢は、開発段階、種、地理的起源、および摂食行動4の影響を受ける、コミュニティの多様性と細菌種の量の両方で動的に変動する。研究は、血液供給が劇的に腸内細菌科からの種の急速な拡大と全体的な多様性の減少と総細菌負荷を増加することを示しています10,,11.さらに、幼虫期の蚊の腸内微生物叢は、通常、昆虫が子犬や分化の間に変態を受けると根絶される。したがって、新たに出現した成虫蚊は、微生物叢4を再移植する必要がある。
腸内微生物叢は、栄養吸収、免疫、発達、生殖、およびベクター能力12を含む様々な側面で昆虫生理学を調節する。無菌蚊の幼虫は、細菌の経口供給が発達を救う間、最初のインスターを超えて発達することができない、蚊の腸内微生物が幼虫の発達に不可欠であることを示す13、14。13,また、腸内細菌の枯渇は、血液の食事の消化と栄養吸収を遅らせる、卵母細胞の成熟に影響を与え、そして、卵子15を減少させる。さらに、腸内微生物叢を有する蚊は、抗生物質処理された蚊と比較してより高い免疫応答を引き出し、他の病原体に対して絶えず上昇した抗菌ペプチド発現を16に感染させる。抗生物質は通常、これらの研究でパン腸内細菌を除去するために経口投与され、その後、無菌蚊と蚊の違いを合成微生物と比較する実験が行われる。しかし、蚊の中腸は微生物の多様なコミュニティを収容し、各細菌種は宿主生理学に対して明確な効果を発揮する可能性があります。
蚊の微生物叢は、発散効果を持つベクター能力を調節します。デング熱流行地域のフィールド由来の蚊から分離されたプロテウスによる植民地化は、デング熱ウイルス感染に対する上駆除された抗菌ペプチド発現および耐性を与える。病原性真菌のボーベリア・バシアナは、アルボウイルス感染に対するトールおよびJAK-STAT免疫経路を活性化する。対照的に、Aedes aegypti midgutから単離された真菌タラロマイセスは、腸トリプシン活性18を調節することによってデング熱ウイルス感染を促進する。さらに、セラチア・マルセセンスは、蚊19の腸上皮上のムチン層を消化するSmコンハクチンと呼ばれる分泌タンパク質を介したアルボウイルス感染を促進する。
この手順は、蚊の中腸の解剖、品種細菌コロニーの分離、細菌種の同定、および経口摂食による再導入のための体系的かつ直感的な方法を提供する。これは、蚊の卵巣の発達と卵位に対する生来細菌、 菊えおろく髄膜炎菌との血液供給の代表的な結果を提供する。
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Protocol
1. 中腸の解剖と分節性細菌の分離
- 解剖のために蚊を準備します。
- アスピレーターで出現から7~9日後に蚊を集める。採取した蚊を4°Cの温度に3〜5分間加え、蚊を氷冷ペトリ皿で解剖するまで麻酔します。
- 実験室の器具および蚊の表面を殺菌する。
- 環境からの細菌による汚染を避けるために75%エタノールを噴霧することによって実験ベンチ、解剖顕微鏡、鉗子、およびガラススライドを殺菌する。
- 75%エタノールと滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を含む2つのペトリ皿を含む滅菌ペトリ皿を準備します。
- 3分間75%エタノールで蚊を浸して振って蚊を表面殺菌し、エタノールが解剖された腸内細菌叢に影響を与える場合に備えて1x PBSバッファーで2回リンスする。
- 蚊の中腸を解剖する。
- 表面滅菌された蚊を、滅菌1x PBSバッファーの滴でガラススライドに移します。解剖顕微鏡の下で解剖する。
- 解剖顕微鏡の下倍率の下で、慎重に脱出を防ぐために、蚊の脚、翼、および頭部を取り除きます。消化管が壊れないように、蚊を引っ張るのではなく直接切って蚊の最後の中ミテを取り除く。
- 蚊の胸郭と腹部の端を鉗子で締め付けます。蚊の消化管をそっと引き抜きます。獲得した消化管には通常、作物、前腸、中腸、後腸、およびマルピギ管が含まれています。
- 解剖顕微鏡を高倍率に調整します。解剖された消化管から作物、前腸、後腸、およびマルピギ管を取り除き、蚊の中腸を得る。
- 作物が膨らみ、蚊が砂糖の食事を取った後に中腸に似ているので、作物を取り除きながら注意してください。長くて薄い排泄管のグループであるマルピギアンチューブは、中腸と後腸の境界に位置しています。
- 腸内細菌を分離します。
- 解剖したミッドグットを、200 μLの無菌1x PBSバッファーを有する無菌1.5 mLチューブに移します。
- 滅菌用害虫で完全に中腸を粉砕し、腸内細菌を緩衝液に完全に放出できるようにします。
- 3つの10倍希釈にホモジュネートを連続希釈します。各希釈液を50μLずつLB(ルリアブロス)寒天プレートに加え、プレートに広げます。中腸に高濃度の腸内細菌叢が含まれている場合は、単一のコロニーを選ぶためにより多くの連続希釈を行う必要があります。
- 単一のコロニーが見えるまで1〜2日間、37°Cでプレートをインキュベートします。
- 種の識別
- 単一のコロニーを選び、それぞれ50 mLのLBスープ培地を含む150 mL円錐形フラスコに接種します。
- 一晩で37°Cで細菌を振ります。
- 細菌ゲノムDNA抽出キットにより全DNAを抽出します。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により16S rDNAを増幅します。
注:16S rDNAには、保存されている複数のセグメントがあります。これらの保存領域に基づいて、細菌のための普遍的なプライマーはすべての細菌の16S rDNA断片を増幅するように設計することができる。これらのプライマーは細菌に特異的であり、16S rDNAの可変領域の差は、異なる細菌を区別するために使用することができる。したがって、16S rDNAは細菌同定に広く使用されている。 - アガロースゲル電気泳動および市販のゲル回収キットにより、PCR産物からDNA断片を回収し精製します。
- 精製されたDNA断片に対してDNAシーケンシングを行い、細菌遺伝子配列を得る。
- 16S rRNA遺伝子配列とGenBankで利用可能な細菌配列を比較します。バクテリアと古細菌データベースを選択します。
注:種レベルへの同定は、最も近いGenBankエントリとの≥99%16S rDNA配列類似性として定義されました。16S rDNA配列の類似性が<99%および≥95%であった場合、分離株は対応する属に割り当てられた。
2. 抗生物質治療と細菌再導入
- 抗生物質溶液を準備します。
- 必要量のスクロース、ペニシリン、ストレプトマイシンを秤量し、ペニシリン20単位と1mL当たり20μgのストレプトマイシンを含む10%スクロース溶液を調製した。
- 抗生物質溶液で蚊を養う。
- 蚊を4°Cで3~5分間麻酔します。蚊を紙コップに移します。上にガーゼを覆い、蚊が逃げるのを防ぐためにガーゼをテープで包みます。
- 滅菌綿球を抗生物質溶液に浸し、蚊のカップに慎重に置きます。使用前に綿のボールを絞り、蚊が滴り落ちる綿のボールに溺れるのを防ぎます。
- 水分蒸発を防ぐために、綿のボールを10cmのペトリ皿で覆います。綿球を1日2回、連続して3日間交換してください。
- 抗生物質治療の有効性を確認する。
- 上記の方法によれば、抗生物質処理された蚊の中腸を解剖する。
- 解剖したミッドグズを、200 μLの無菌1x PBSバッファーを有する無菌1.5 mLチューブに移します。
- 滅菌用ペストルで完全に中腸を粉砕し、腸内細菌を緩衝液に完全に放出できるようにします。
- 細菌ゲノムDNA抽出キットにより腸内微生物DNAを抽出する。
- 汎用の真性細菌プライマー(16S rRNA F:TCCTACGGGAGGCGCGCCAGTおよびR:GGACTACCAGGGTATCTCTCCGtGtGtTTT)を用いて、ゲノムDNAに対するリアルタイム定量PCR(qPCR)による細菌定量化を行う。
- 細菌懸濁液の調製
- 分光光度計で細菌溶液を測定します。1 mL チューブに1 OD (OD600) の細菌懸濁液を加えます。4°Cで5分間5,000xggで懸濁液を遠心分離する。
- 上清を捨て、懸濁液沈殿のために1.5mLチューブに滅菌1x PBSバッファーの1 mLを加えます。
- 4 °Cで5分間5,000 x g で遠心分離機;上清を捨てる
- 手順 2.4.2 と 2.4.3 を繰り返します。
- 細菌沈殿に200μLの無菌1x PBSバッファーを加えます。
- 600 μLの10%スクロース溶液、200 μLの10mm ATP(10mmATP(吸刺激剤として機能)、細菌懸濁液200μLを無菌1.5 mLチューブに加えます。渦を混ぜます。あるいは、熱不活性化血液中にペレット化された細菌を懸濁させる。
- 熱不活化血液の調製
- 抗凝固管で新鮮な血液を収集します。
- 2~3mLの新鮮な血液を取る。遠心分離機は、血漿と血球gを分離するために4°Cで10分間1000xgで。遠心分離と洗浄プロセス中に血液が失われることに注意してください。事前に使用量を計算する必要があります。
- プラズマを新しい1.5 mLチューブに集め、56°Cで1時間熱不活性化します。
- 血液細胞の懸濁液のために1.5 mLの管に無菌1x PBSの緩衝液の500 μLを加える。遠心分離機を4°Cで10g分間10分間1000xgで、上清を捨てます。
- ステップ 2.4.7.4 を 2 回繰り返します。
- 熱不活性化血漿で血液細胞を再中断し、熱不活性化血液を得る。
- ステップ 2.4.1 から 2.4.4 に従って 1 つの OD 細菌ペレットを得る。
- 1 mLの熱不活性化血液をペレット化した細菌を再懸濁する。
- 蚊に細菌の懸濁液を与えます。
- 蚊を24時間飢えさせ、抗生物質が細菌に餌を与える前に代謝することを可能にする。
- 膜供給システムを組み立てます。
- 滅菌フィーダーユニットをパラフィルム、代わりにコラーゲン膜で密封します。
- プラスチック製のリングに入れ、パラフィルムで固定して、給餌中の摩擦による破損を避けます。
- 調製した細菌溶液をフィーダーユニットにゆっくりと加えます。なお、2ウェルフィーダーユニットの1つのウェルのみを溶液で充填し、試薬の滴下側からのみフィーダーユニットをカバーすることができます。
- フィーダーユニットを37°Cに予熱した給餌システムに接続し、人間の温度をシミュレートして蚊を引き付けます。餌付け装置を蚊で満たされた紙コップの上に置き、90分間給餌します。
- 餌を与えた後、蚊を4°Cの温度に3〜5分間加えて麻酔し、蚊を氷冷ペトリ皿に麻酔してください。
- さらなる研究のために完全に魅惑的な蚊を選んでください。
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Representative Results
抗生物質で治療された蚊の中腸と抗生物質なしでDNA抽出のために取り出され、qPCRは普遍的な細菌プライマーで行われた。 図1 は、対照群および抗生物質治療群における細菌16S rRNAの発現を示す。その結果、腸内細菌の約98%が除去され、ペニシリンとストレプトマイシンの腸管滅菌が成功した。
記載された方法により、細菌株を単離し、同定した。 C. 髄膜炎菌 は、非発酵性のオキシダーゼ陽性グラム陰性好気性バチルスであり、 クリセオバクテリウムに属する。 図 2 は、抗生物質処理蚊を C.メニンゴセプシスと共に血液供給した後に蚊1個につき産卵した平均卵を示している。 図 3 は 、C.メニンゴセプチカムを含む血液食後の卵巣発達関連遺伝子24の発現を示す。卵巣の発達関連遺伝子およびプライマー配列の概要を 表1に示す。
腸内細菌から分離された菌株から腸内細菌を除去し、その後、完全にエングレージされた蚊は3つのグループに分けられた。第1群及び第2群の5匹の雌を産卵量のカウントに用い、第3群の10匹の雌をそれぞれ、餌を与えた後の各雌蚊の24時間後に卵巣の発達に関連する遺伝子発現を検出するために用いた。結果は、対照群および摂食群の卵の生産に有意な変化がないことを示す。
図1:抗生物質治療後の16S rRNAの発現。 未治療の抗生物質を含む蚊は対照群として役立った。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:蚊の卵位に対する腸内微生物の影響 示された細菌株は血液と混合され、抗生物質処理された蚊に供給された。未治療の腸内微生物を含む蚊は、対照群として機能した。データは平均値 ±SEM として表示 されます。
図3:血液供給後の生殖関連遺伝子の発現カテプシンB(A)、ミトコンドリアATPase阻害剤(B)、リボソーム生物新生タンパク質brix(C)およびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼrio2(D)Dの発現を、示された細菌株で24時間の抗生物質処理蚊の摂食後に行う。C未治療の腸内微生物を持つ蚊は、対照群として機能した。各ドットは蚊を表し、各線はグループの中央値を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | 遺伝子番号 | プライマーシーケンス |
| カテプシンB | AAEL009642 | フォワードプライマーガグガーグトクトCGGTGGGGA |
| リバースプライマー-アカタカマッカッカッカクトカグタ | ||
| ミトコンドリアATPase阻害剤 | AAEL004284 | フォワードプライマー-カアクグカカアグクトガアガガガ |
| リバースプライマー-アクGTGCGCCTCtTTCGT | ||
| リボソームバイオジェネシスタンパク質ブリクス | AAEL001917 | フォワードプライマー-ガーカカアガアGCGAATGAA |
| リバースプライマー-TTGGCCTTガガGTクトクトクト | ||
| セリン/スレオニンプロテインキナーゼリオ2 | AAEL011114 | フォワードプライマーガガガガGCGCカカアACC |
| リバースプライマー-TCGAATGGCTTTCCATTTTTC |
表1:卵巣の発達関連遺伝子及びプライマー配列。
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Discussion
宿主と微生物の相互作用に関する研究は、異なる腸内微生物が発散メカニズムを介して宿主生理学に影響を与えることを発見した。本稿では、蚊の中腸を解剖し、培養可能な腸内細菌を培養し、抗生物質処理、関心のある細菌を再導入するなど、蚊の腸内微生物のそれぞれの役割を調査する方法を紹介する。
抗生物質治療を成功させるためには、実験を行う際に以下の詳細を考慮する必要があります。このプロトコルでは、蚊は、ペニシリンの20単位と3日間11、1616のmLあたり20μgのストレプトマイシンを含む10%スクロース溶液で湿らせた綿球を使用して処理した。ペニシリンはグラム陽性菌に対する広域スペクトル抗生物質として機能し、ストレプトマイシンはグラム陰性細菌20に対する広域スペクトル抗生物質として機能した。抗生物質の適切な保存は、効率的な抗生物質治療21のために不可欠です。−18°Cで保存した場合、ペニシリンGの安定性は少なくとも3mである。ストレプトマイシンは、4°C22で保存すると少なくとも1222m安定である。抗生物質のブランドや保存時間の違いは微生物クリアランスにわずかな違いを引き起こす可能性がありますが、各抗生物質治療後の効率を検証する必要があります。qPCRに加えて、プレートを広げるか、またはPCRを使用して、抗生物質治療23,24,24の効率を評価するために一般的に使用される。さらに、抗生物質処理後に蚊が他の細菌に汚染されるのを防ぐために、送り付けアッセイは超クリーンベンチの下に組み立てられた殺菌装置で行う必要があります。
細菌の経口摂食の前に、蚊は抗生物質を代謝することを可能にするために24時間飢えするべきである25.これは、蚊が細菌の液体を摂取するのに役立つだけでなく、抗生物質が細菌を殺すのを防ぎます。
確かに、このプロトコルは、主に、伝える細菌の効果を調査するためのものです。脊椎動物および無脊椎動物宿主の腸内微生物叢を研究するために、抗生物質処理された宿主への化学的細菌の再導入は、最近の研究88、26、2726,27で一般的に使用されている。また、培養腸内細菌の初期同定は、一般的にコロニーサイズ、形状、色、エッジ、不透明度、高さ、および一貫性28の特性に基づく。非化学的細菌に対して、高スループットシーケンシングベースのメタゲノムアプローチは、中腸内微生物叢,29、30、31,30の全組成に関する包括的な情報を提供する可能性が高い。31しかし、非カルト性細菌と宿主との相互作用はほとんど未踏のままである。
この記事では、蚊の卵位に対する腸内微生物の影響を研究し、熱不活性化血液または糖供給を介した細菌の移植と細菌を混合し、その後に血液供給を行う2つの代替オプションを提供します。この原稿の代表的な結果は最初の選択肢を採用し、後者の方法は同様の結果を生み出した。1つの特定の細菌株で経口給餌した後、様々な研究を行うことができる。その後のアッセイは、微生物因子が蚊の運動行動をどのように調節するかを調べるのに使用できる。タンパク質定量アッセイは、消化に対する異なる細菌の影響を研究するために従うことができる。わずかな変更を加えると、この方法は、栄養吸収、免疫、発達、生殖、およびベクター能力を含む蚊の生理学に対する様々な微生物のそれぞれの効果を研究するために使用することができる。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は中国国立自然科学財団(グラント81902094、81600497)と湖南省の科学技術計画プロジェクト(2019RS1036)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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