Summary
Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.
Abstract
Die Mücke Midgut beherbergt ein hochdynamisches Mikrobiom, das den Wirtsstoffwechsel, die Fortpflanzung, die Fitness und die Vektorkompetenz beeinflusst. Es wurden Studien durchgeführt, um die Wirkung von Darmmikroben als Ganzes zu untersuchen; jedoch könnten verschiedene Mikroben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt ausüben. Dieser Artikel enthält die Methodik, um die Wirkung jeder spezifischen Mückendarmmikrobe und den potenziellen Mechanismus zu untersuchen.
Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil stellt vor, wie man das Mückenmittelgut seziert, kultivierbare Bakterienkolonien isoliert und Bakterienarten identifiziert. Der zweite Teil sieht das Verfahren zur Erzeugung von antibiotikabehandelten Mücken und zur Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart vor.
Introduction
Mücken gelten als die wichtigsten Vektoren menschlicher pathogener Krankheiten, die über hundert Krankheitserreger übertragen, darunter das Zika-Virus, das Dengue-Virus und die Plasmodium-Parasiten 1. Wenn Mücken eine Blutmahlzeit nehmen, um Nährstoffe für die Oviposition zu erhalten, können sie versehentlich Krankheitserreger von einem infizierten Wirt über den Verdauungstrakt2aufnehmen. Wichtig ist, dass das Mückenmittelgut, das sowohl bei der Blutmahlzeit als auch beim Eintritt von Krankheitserregern eine zentrale Rolle spielt, ein hochdynamisches Mikrobiom3beherbergt.
Mehrere Studien haben labor- und feldgesammelte Mückenmikrobiota entweder mit einer kulturabhängigen Methode oder einem Bakteriensequenzierungstest4,5,6charakterisiert. Arten wie Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaund Enterococcus sind häufig von Mücken in verschiedenen Studienisoliert 5,7,8,9. Interessanterweise schwankt die Moskitodarmmikrobiota dynamisch sowohl in der Vielfalt der Gemeinschaft als auch in der Menge der Bakterienarten, die von der Entwicklungsphase, der Art, der geografischen Herkunft und dem Fütterungsverhalten betroffen sind4. Studien zeigen, dass die Blutfütterung die gesamte bakterielle Belastung mit einer schnellen Ausdehnung der Arten von Enterobacteriaceae und einer Verringerung der Gesamtvielfalt10,11dramatisch erhöht. Darüber hinaus wird Mückendarmmikrobiota des Larvenstadiums in der Regel ausgerottet, wenn das Insekt während der Pupation und Scheidung einer Metamorphose unterzogen wird; Daher müssen neu entstandene erwachsene Mücken ihre Mikrobiota4wieder bevölkern.
Gut mikrobiota moduliert Insektenphysiologie in verschiedenen Aspekten, einschließlich Nährstoffaufnahme, Immunität, Entwicklung, Reproduktion und Vektorkompetenz12. Axenic Mückenlarven nicht über den ersten Instar entwickeln, während ein Bakterium orale Versorgung rettet Entwicklung, was darauf hindeutet, dass die Mücke Darm Mikrobe ist wichtig für die Larvenentwicklung13,14. Außerdem, Erschöpfung der Darmbakterien verzögert Blutmehl Verdauung und Nährstoffaufnahme, wirkt sich auf die Oozytenreifung, und verringert oviposition15. Darüber hinaus lösen Mücken mit Darmmikroflora höhere Immunantworten im Vergleich zu antibiotikabehandelten Mücken aus, mit ständig erhöhter antimikrobieller Peptidexpression gegen andere Krankheitserreger, um16zu infizieren. Antibiotika werden in der Regel oral verabreicht, um Pan-Darm-Bakterien in diesen Studien zu entfernen, und dann werden Experimente durchgeführt, um den Unterschied zwischen axtischen Mücken und Mücken mit commenalen Mikroben zu vergleichen. Allerdings beherbergt die Mücke Midgut eine vielfältige Gemeinschaft von Mikroben, und jede Bakterienart könnte eine deutliche Wirkung auf die Wirtphysiologie ausüben.
Mückenmikrobiota reguliert Vektorkompetenz mit divergierenden Effekten. Die Kolonisation durch Proteus, isoliert von feldabgeleiteten Mücken von Dengue-endemischen Gebieten, verleiht eine hochregulierte antimikrobielle Peptidexpression und Resistenz gegen Dengue-Virusinfektionen16. Der entomopathogene Pilz Beauveria bassiana aktiviert den Toll- und JAK-STAT-Immunweg gegen eine Arbovirus-Infektion17. Im Gegensatz dazu erleichtert der aus Aedes aegypti midgut isolierte Pilz Talaromyces die Infektion des Dengue-Virus, indem er die Darmtrypsin-Aktivitätmoduliert 18. Darüber hinaus fördert Serratia marcescens die Arbovirus-Übertragung durch ein sekretorisches Protein namens SmEnhancin, das die Mucin-Schicht auf dem Darmepithel von Mückenverdaut 19.
Dieses Verfahren bietet eine systematische und intuitive Methode zur Zerlegung des Mückenmittelguts, zur Isolierung von kulturierbaren Bakterienkolonien, zur Identifizierung der Bakterienarten und zur Wiedereinführung durch orale Fütterung. Es liefert repräsentative Ergebnisse der Blutfütterung mit einem commensal Bakterium, Chryseobacterium Meningosepticum, auf Mücken EierstockEntwicklung und Oviposition.
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Protocol
1. Midgut-Sektion und kultivierbare Bakterienisolierung
- Bereiten Sie die Mücke für die Zerlegung vor.
- Sammeln Sie die Mücken 7-9 Tage nach der Entstehung mit einem Aspirator. Anästhesisieren Sie die gesammelten Mücken, indem Sie sie 3-5 min einer Temperatur von 4 °C unterziehen und die Mücken in einer eiskalten Petrischale bis zur Zerlegung anbesäufen.
- Sterilisieren Sie Laborinstrumente und die Mückenoberfläche.
- Sterilisieren Sie die Experimentierbank, sezieren Sie Mikroskop, Zange und Glasschlitten, indem Sie 75% Ethanol sprühen, um eine Kontamination durch Bakterien aus der Umwelt zu vermeiden.
- Bereiten Sie eine sterile Petrischale mit 75% Ethanol und zwei Petrischalen mit steriler 1x Phosphatgepufferte Saline (1x PBS) zu.
- Die Mücke durch Tauchen und Schütteln in 75% Ethanol für 3 min oberflächensterilisieren und zweimal mit 1x PBS-Puffer abspülen, falls das Ethanol die sezierte Darmflora beeinflusst.
- Sezieren Sie die Mücke Midgut.
- Übertragen Sie die oberflächensterilisierte Mücke mit einem Tropfen sterilem 1x PBS Puffer auf die Glasrutsche. Sezieren Sie unter dem Sezieren des Mikroskops.
- Entfernen Sie unter der unteren Vergrößerung des Sezierens mikroskops vorsichtig die Beine, Flügel und den Kopf der Mücke, um eine Flucht zu verhindern. Entfernen Sie die letzte Sobe der Mücke, indem Sie sie direkt schneiden, anstatt sie zu ziehen, um zu verhindern, dass der Verdauungstrakt bricht.
- Klemmen Sie den Thorax der Mücke und das Ende des Bauches mit Zange. Ziehen Sie vorsichtig den Verdauungstrakt der Mücke heraus. Der erworbene Verdauungstrakt enthält in der Regel die Ernte, Vorgut, Midgut, Hinterdarm, und die Malpighian Röhren.
- Stellen Sie das Sezieren des Mikroskops auf eine höhere Vergrößerung ein. Entfernen Sie die Ernte, Dasvorgut, Dasbauch, und die Malpighian Rohre aus dem sezierten Verdauungstrakt, um das Mittelgut der Mücke zu bekommen.
- Achten Sie beim Entfernen der Ernte darauf, da sich die Ernte aufbläht und dem Mittelgut ähnelt, nachdem die Mücke eine Zuckermahlzeit zu sich nimmt. Die Malpighian-Rohre, eine Gruppe von langen und dünnen Ausscheidungsrohren, befinden sich an der Grenze zwischen dem Mittelgut und dem Hintergut.
- Isolieren Sie Darmbakterien.
- Übertragen Sie das sezierte Mittelgut in ein steriles 1,5 ml-Rohr mit 200 l sterilem 1x PBS-Puffer.
- Schleifen Sie das Midgut auf einer sterilen Bank gründlich mit einem sterilen Stößel, um eine vollständige Freisetzung von Darmbakterien in den Puffer zu ermöglichen.
- Das Homogenat wird seriell auf drei 10-fache Verdünnungen verdünnt. Fügen Sie 50 l jeder Verdünnung in die LB (Luria-Brühe) Agarplatte, und verteilen Sie es dann auf der Platte. Wenn das Mittelgut eine hohe Konzentration von Darmflora enthält, ist es wichtig, mehr serielle Verdünnungen zu machen, um einzelne Kolonien herauszupicken.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1-2 Tage, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.
- Artenidentifikation
- Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen Sie sie jeweils in einen 150 ml kegelförmigen Kolben mit 50 ml LB-Brühemedium.
- Schütteln Sie die Bakterien bei 37 °C über Nacht.
- Extrahieren Sie die gesamte DNA durch bakterielle genomische DNA-Extraktionkit. Verstärken Sie 16S rDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
HINWEIS: Es gibt mehrere Segmente in 16S rDNA, die konserviert werden. Basierend auf diesen konservierten Regionen können universelle Primer für Bakterien entwickelt werden, um 16S rDNA-Fragmente aller Bakterien zu verstärken. Diese Primer sind spezifisch für Bakterien, und der Unterschied in der variablen Region von 16S rDNA kann verwendet werden, um verschiedene Bakterien zu unterscheiden. Daher ist 16S rDNA weit verbreitet für die bakterielle Identifizierung verwendet. - Wiederherstellen und Reinigen von DNA-Fragmenten aus PCR-Produkten durch Agarose-Gel-Elektrophorese und ein kommerzielles Gel-Recovery-Kit.
- Führen Sie eine DNA-Sequenzierung der gereinigten DNA-Fragmente durch, um bakterielle Gensequenzen zu erhalten.
- Vergleichen Sie die 16S rRNA-Gensequenz mit der in GenBank verfügbaren bakteriellen Sequenz. Wählen Sie die Datenbank Bakterien und Archaea aus.
ANMERKUNG: Die Identifizierung auf Artenebene wurde definiert als eine Ähnlichkeit mit der Sequenz ähnlichkeitsweise 99 % 16S rDNA mit dem nächsten GenBank-Eintrag. Das Isolat wurde der entsprechenden Gattung zugewiesen, als seine 16S-rDNA-Sequenzähnlichkeit <99% und 95% betrug.
2. Antibiotika-Behandlung und Wiedereinführung des Bakteriums
- Bereiten Sie die Antibiotikum-Lösung vor.
- Wiegen Sie die erforderliche Menge an Saccharose, Penicillin und Streptomycin, um eine 10%ige Saccharoselösung mit 20 Einheiten Penicillin und 20 g Streptomycin pro ml vorzubereiten.
- Füttern Sie Mücken mit der Antibiotikalösung.
- Anästhesisieren Sie die Mücken in 4 °C für 3-5 min. Übertragen Sie die Mücken in eine Papiertasse. Bedecken Sie die Oberseite mit Gaze und wickeln Sie die Gaze mit Klebeband auf, um mückenverhindern zu entkommen.
- Tauchen Sie sterile Baumwollkugeln in die Antibiotikalösung und legen Sie sie vorsichtig auf die Mücke-Tasse. Drücken Sie die Baumwollkugeln vor dem Gebrauch, um zu verhindern, dass Mücken in den tropfenden Baumwollkugeln ertrinken.
- Bedecken Sie die Baumwollkugeln mit einer 10 cm Petrischale, um Feuchtigkeitsverdunstung zu verhindern. Ersetzen Sie die Baumwollkugeln zweimal täglich für drei aufeinanderfolgende Tage.
- Bestätigen Sie die Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung.
- Nach der oben genannten Methode, sezieren Sie das Mittelgut von antibiotikabehandelten Mücken.
- Übertragen Sie die sezierten Mittelguts in ein steriles 1,5 ml-Rohr mit 200 l sterilem 1x PBS-Puffer.
- Schleifen Midguts in einer sterilen Bank gründlich mit einem sterilen Stößel, um die vollständige Freisetzung von Darmbakterien in den Puffer zu ermöglichen.
- Extrahieren Sie die mikrobielle DNA des Darms durch bakterielle genomische DNA-Extraktionskit.
- Durchführung der bakteriellen Quantifizierung durch quantitative PcR (qPCR) in Echtzeit auf genomische DNA mit universellen Eubakterienprimern (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT und R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
- Herstellung der bakteriellen Suspension
- Messen Sie die bakterielle Lösung mit einem Spektralphotometer. Fügen Sie 1 OD (OD600) bakterielle Suspension in ein 1 ml Rohr. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml sterilen 1x PBS-Puffer zu 1,5 ml Rohr für Suspensionsfällung hinzu.
- Zentrifuge bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C; den Überstand zu entsorgen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4.2 und 2.4.3.
- Fügen Sie dem bakteriellen Niederschlag 200 l sterilen 1x PBS-Puffer hinzu.
- Fügen Sie 600 l 10% Saccharoselösung, 200 l 10 mm ATP (die als Phagostimulans wirkt) und 200 l bakterielle Suspension in ein steriles 1,5 ml-Rohr geben. Mix durch Wirbel. Alternativ können Sie bakterielle Pellets in hitzeinaktiviertem Blut aussetzen.
- Zubereitung von wärmeinaktiviertem Blut
- Sammeln Sie frisches Blut mit einem gerinnungshemmenden Rohr.
- Nehmen Sie 2-3 ml frisches Blut. Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Plasma und Blutzellen zu trennen. Beachten Sie, dass das Blut während der Zentrifugation und Waschprozess verloren gehen; es ist notwendig, die Nutzung im Voraus zu berechnen.
- Das Plasma in ein neues 1,5 ml-Rohr einsammeln und bei 56 °C für 1 h wärmeinaktivieren.
- Fügen Sie 500 l sterilen 1x PBS-Puffer zu 1,5 ml Röhrchen für die Suspension von Blutzellen hinzu. Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann den Überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.7.4 zweimal.
- Resuspend Blutzellen mit wärmeinaktiviertem Plasma, um wärmeinaktiviertes Blut zu erhalten.
- Befolgen Sie die Schritte 2.4.1 bis 2.4.4, um 1 OD-Bakteriengranat zu erhalten.
- Setzen Sie die mit 1 ml hitzeinaktiviertem Blut granulierten Bakterien wieder aus.
- Füttern Sie die Mücke mit Bakteriensuspension.
- Verhungern Sie die Mücken für 24 h, so dass Antibiotika verstoffwechseln, bevor Bakterien zu füttern.
- Montieren Sie das Membran-Zuführsystem.
- Versiegeln Sie die sterilisierte Feedereinheit mit einem Parafilm, alternativ einer Kollagenmembran.
- Setzen Sie einen Kunststoffring auf und fixieren Sie ihn mit Parafilm, um Reibungsbrüche während der Fütterung zu vermeiden.
- Fügen Sie die vorbereitete bakterielle Lösung langsam in die Feedereinheit ein. Beachten Sie, dass nur ein Brunnen der Zwei-Well-Feeder-Einheit mit der Lösung gefüllt werden kann und die Feedereinheit nur von der Reagenz-Abwurfseite abdeckt.
- Schließen Sie die Zuführeinheit an ein auf 37 °C vorgeheiztes Fütterungssystem an, das die menschliche Temperatur simuliert, um Mücken anzulocken. Legen Sie das Fütterungsgerät auf einen mit Mücken gefüllten Papierbecher und füttern Sie ihn 90 min.
- Nach der Fütterung die Mücken anästhesieren, indem Sie sie 3-5 min einer Temperatur von 4 °C unterziehen und die Mücken in einer eiskalten Petrischale anbesen.
- Wählen Sie die vollständig engorged Mücken für weitere Studien.
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Representative Results
Die Mittelguts von Mücken, die mit Antibiotika und ohne Antibiotika behandelt wurden, wurden zur DNA-Extraktion herausgenommen, und qPCR wurde mit universellen bakteriellen Primern durchgeführt. Abbildung 1 zeigt die Expression von bakteriellen 16S rRNA in der Kontrollgruppe und der Antibiotika-Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass etwa 98% der Darmbakterien entfernt wurden, und die Darmsterilisation von Penicillin und Streptomycin war erfolgreich.
Mit den beschriebenen Methoden wurden Bakterienstämme isoliert und identifiziert. C. Meningosepticum ist ein nicht fermentierender, oxidase-positiver gramnegativer aeroben Bacillus, der zu Chryseobacteriumgehört. Abbildung 2 zeigt das durchschnittliche Ei, das pro Mücke nach der Blutfütterung von antibiotikabehandelten Mücken mit C. meningosepticumgelegt wurde. Abbildung 3 zeigt die Expression von ovarialen Entwicklungsgenen 24 h nach bluthaltigem C. Meningosepticum. Eine Übersicht über die mit der Eierstockentwicklung zusammenhängenden Gene und Primersequenzen ist in Tabelle 1aufgeführt.
Der Stamm, der von Darmbakterien isoliert wurde, aus denen Darmbakterien entfernt wurden, und dann die vollständig engorged Mücken wurden in drei Gruppen unterteilt. Fünf Weibchen in der ersten und zweiten Gruppe wurden verwendet, um die Laichmenge zu zählen, und 10 Weibchen in der dritten Gruppe wurden verwendet, um die Genexpression im Zusammenhang mit der Eierstockentwicklung nach 24 h jeder weiblichen Mücke nach der Fütterung zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Eiproduktion der Kontrollgruppe und der Fütterungsgruppe nicht wesentlich verändert.
Abbildung 1: Expression von 16S rRNA nach antibiotika-Behandlung. Die Mücken mit unbehandelten Antibiotika dienten als Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wirkung der Darmmikrobe auf dieMückenoviposition. Die angegebenen Bakterienstämme wurden mit Blut vermischt und an antibiotikabehandelte Mücken verfüttert. Die Mücken mit unbehandelten Darmmikroben dienten als Kontrollgruppe. Die Daten werden als Mittelwert -SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Expressionvon fortpflanzungsbezogenen Genen nach der Blutfütterung. Expression von Cathepsin B (A), Mitochondrialer ATPase-Hemmer (B), Ribosome biogenesis protein brix (C), und Serin/Threonine-Protein Kinase rio2 (D) nach DerBlutfütterung von antibiotikabehandelten Mücken für 24 h mit den angegebenen Bakterienstämmen. Die Mücken mit unbehandelter Darm-Mikrobe dienten als Kontrollgruppe. Jeder Punkt stellt eine Mücke dar, und jede Linie stellt den Medianwert der Gruppe dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | Gennummer | Primersequenz |
| Kathepsin B | AAEL009642 | Vorwärtsgrundierung-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA |
| Reverse Primer-AATCCCACATCCACCCAGTA | ||
| Mitochondrialer ATPase-Inhibitor | AAEL004284 | Vorwärtsgrundierung-CAACTGCACAAGCTGAAGGA |
| Reverse Primer-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT | ||
| Ribosome Biogenese Protein brix | AAEL001917 | Vorwärtsgrundierung-GAACAGCACAAGCGAATGAA |
| Reverse Primer-TTGGCCTTGAGAGTCGTCTT | ||
| Serin/Threonin-Protein-Kinase rio2 | AAEL011114 | Vorwärtsgrundierung-GAGGAGAAAGCAGCACAACC |
| Reverse Primer-TCGAATGGCTTTTCCATTTC |
Tabelle 1: Gene und Primersequenzen, die mit der Entwicklung von Ovarialen zusammenhängen.
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Discussion
Untersuchungen an Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen haben ergeben, dass verschiedene Darmmikroben ihre Wirtsphysiologie über divergierende Mechanismen beeinflussen. Dieser Artikel stellt die Methode vor, um die jeweilige Rolle der Moskito-Darm-Mikrobe zu untersuchen, einschließlich der Sezieren von Mückenmittelgut, Kultivieren von kultivierbaren Darmbakterien, Antibiotika-Behandlung, und Wiedereinführung der Bakterien von Interesse.
Für eine erfolgreiche Antibiotikabehandlung müssen bei der Durchführung des Experiments die folgenden Angaben berücksichtigt werden. In diesem Protokoll wurden Mücken mit Baumwollkugeln behandelt, die mit einer 10%igen Saccharoselösung befeuchtet wurden, einschließlich 20 Einheiten Penicillin und 20 g Streptomycin pro ml für 3 Tage11,16. Penicillin diente als Breitspektrum-Antibiotikum gegen grampositive Bakterien, und Streptomycin diente als Breitspektrum-Antibiotikum gegen gramnegative Bakterien20. Die richtige Konservierung von Antibiotika ist entscheidend für eine effiziente Antibiotikabehandlung21. Bei -18 °C beträgt die Stabilität von Penicillin G mindestens 3 m. Streptomycin ist bei 4 °C22für mindestens 12 m stabil. Während Unterschiede in der Antibiotikum Marke oder Lagerzeit kann leichte Unterschiede in der mikrobiellen Clearance verursachen, ist es notwendig, die Effizienz nach jeder Antibiotika-Behandlung zu überprüfen. Zusätzlich zur qPCR werden die Verbreitung der Platte oder die Verwendung von PCR häufig verwendet, um die Wirksamkeit der Antibiotikabehandlung zu bewerten23,24. Um zu verhindern, dass Mücken nach einer Antibiotikabehandlung mit anderen Bakterien kontaminiert werden, muss der Fütterungstest mit sterilisierten Geräten durchgeführt werden, die unter einer supersauberen Bank montiert werden.
Vor der bakteriellen oralen Fütterung sollten die Mücken 24 h ausgehungert werden, damit die Antibiotika verstoffwechselt werden können25. Dies hilft den Mücken nicht nur, Bakterien flüssigkeit zu aufnehmen, sondern verhindert auch, dass die Antibiotika die Bakterien abtöten.
Zugegeben, dieses Protokoll dient hauptsächlich der Untersuchung der Wirkung von kultivierbaren Bakterien. Um die Darmmikrobiota von Wirbeltieren und wirbellosen Wirt zu studieren, wird die Wiedereinführung von kultivierbaren Bakterien in antibiotikabehandelten Wirt häufig in den jüngsten Forschungen8,26,27verwendet. Darüber hinaus basiert die anfängliche Identifizierung kultivierter Darmbakterien im Allgemeinen auf den Eigenschaften von Koloniegröße, Form, Farbe, Kante, Deckkraft, Höhe und Konsistenz28. Für nicht kultiläierbare Bakterien, Hochdurchsatz Sequenzierung-basierte metagenomische Ansätze sind wahrscheinlich umfassende Informationen über die Gesamtzusammensetzung der Midgut Mikrobiota29,30,31. Das Zusammenspiel zwischen nicht kultivierbaren Bakterien und dem Wirt bleibt jedoch weitgehend unerforscht.
Dieser Artikel bietet zwei alternative Möglichkeiten, um die Wirkung von Darmmikroben auf die Mückenoviposition zu untersuchen, die Bakterien mit hitzeinaktiviertem Blut zu mischen oder die Bakterien über Zuckerzuführen, gefolgt von Blutfütterung, zu implantaten. Die repräsentativen Ergebnisse in diesem Manuskript wählten die erste Option, während die letztgenannte Methode ähnliche Ergebnisse hervorbrachte. Verschiedene Studien könnten nach oraler Fütterung mit einem bestimmten Bakterienstamm durchgeführt werden. Anschließende Assay könnte verwendet werden, um zu untersuchen, wie der mikrobielle Faktor das Verhalten der Moskitomotore moduliert. Protein-Quantifizierung assay könnte verfolgt werden, um die Auswirkungen verschiedener Bakterien auf die Verdauung zu untersuchen. Bei geringfügigen Modifikationen könnte diese Methode verwendet werden, um die jeweiligen Auswirkungen verschiedener Mikroben auf die Mückenphysiologie zu untersuchen, einschließlich Nährstoffaufnahme, Immunität, Entwicklung, Reproduktion und Vektorkompetenz.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) und dem Science and Technology Plan Project der Provinz Hunan (2019RS1036) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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