En bakteriell oral utfodring assay med antibiotikabehandlade myggor
Summary
Denna artikel presenterar ett protokoll för att undersöka effekten av enskilda mygga tarmbakterier, inklusive isolering och identifiering av mygga midgut cultivable mikrober, antibiotika utarmning av mygga tarmbakterier, och återinföra en specifik bakterie arter.
Abstract
Mygga midgut hamnar en mycket dynamisk mikrobiomet som påverkar värdmetabolism, reproduktion, fitness och vektorkompetens. Studier har utförts för att undersöka effekten av gut mikrober som helhet; olika mikrober kunde dock utöva tydliga effekter mot värden. Denna artikel ger metodiken för att studera effekten av varje specifik mygga gut mikrob och den potentiella mekanismen.
Det här protokollet innehåller två delar. Den första delen introducerar hur man dissekerar mygga midgut, isolera cultivable bakterier kolonier, och identifiera bakterier arter. Den andra delen ger förfarandet för att generera antibiotikabehandlade myggor och återinföra en specifik bakterieart.
Introduction
Myggor anses vara de viktigaste vektorerna av mänskliga patogena sjukdomar, som överför över hundra patogener inklusive Zika virus, Denguevirus, och Plasmodium parasiter1. När myggor tar en blodmåltid för att förvärva näringsämnen för oviposition, kan de oavsiktligt inta patogener från en infekterad värd via matsmältningskanalen2. Viktigt, mygga midgut, som spelar en central roll i både blod måltid matsmältning och patogen entré, hamnar en mycket dynamisk mikrobiom3.
Flera studier har karakteriserat lab-uppfödda och fältuppsamlade mygga mikrobiota med antingen en odlingsberoende metod eller en bakterier sekvensering assay4,5,6. Arter inklusive Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, och Enterococcus är vanligen isolerade från myggor i olikastudier 5,7,8,9. Intressant nog mygga gut mikrobiota fluktuerar dynamiskt i både samhället mångfald och mängden bakterier arter, påverkas av utvecklingsstadiet, arter, geografiskt ursprung, och utfodring beteende4. Studier visar att blodmatning dramatiskt ökar den totala bakteriebelastningen med snabb expansion av arter från Enterobacteriaceae och en minskning av den totala mångfalden10,11. Dessutom utrotas myggeminfektionsflovanta av larvstadiet vanligtvis när insekten genomgår metamorfos under pupation och eclosion; således, nyuppträdda vuxna myggor måste återbefolka sin mikrobiota4.
Gut mikrobiota modulerar insekt fysiologi i olika aspekter, inklusive näringsämne absorption, immunitet, utveckling, reproduktion, och vektor kompetens12. Axenic mygglarver misslyckas med att utvecklas bortom den första instar medan en bakterie oral leverans räddar utvecklingen, vilket tyder på att mygga tarmmikroben är avgörande för larvutveckling13,14. Förutom, utarmning av tarmbakterier retards blod måltid matsmältning och näringsämne absorption, påverkar oocyte mognad, och minskar oviposition15. Dessutom mygg med gut mikroflora framkalla högre immunsvar jämfört med antibiotikabehandlade myggor, med ständigt förhöjda antimikrobiella peptiduttryck mot andra patogener att infektera16. Antibiotika är vanligtvis oralt administreras för att ta bort pan gut bakterier i dessa studier, och sedan experiment utförs för att jämföra skillnaden mellan axenic myggor och myggor med commensal mikrober. Men mygga midgut hyser en mångsidig gemenskap av mikrober, och varje bakterie art kan utöva en tydlig effekt mot värden fysiologi.
Myggfloran reglerar vektorkompetens med divergerande effekter. Kolonisering av Proteus isolerad från fält-härledda myggor av denguefeber-endemiska områden ger upregulated antimikrobiell peptid uttryck och resistens mot denguevirusinfektion16. Den entomopathogenic svampen Beauveria bassiana aktiverar Toll och JAK-STAT immun väg mot arbovirus infektion17. Däremot svampen Talaromyces isolerade från Aedes aegypti midgut underlättar denguevirusinfektion genom modulering gut trypsin aktivitet18. Dessutom, Serratia marcescens främjar arbovirus överföring genom en sekretorisk protein som kallas SmEnhancin, som smälter mucin lagret på tarmepitelet av myggor19.
Detta förfarande ger en systematisk och intuitiv metod för dissekering av mygga midgut, isolering av cultivable bakterier kolonier, identifiering av bakterien arter, och återintroduktion via oral utfodring. Det ger representativa resultat av blod utfodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, på mygga äggstocken utveckling och oviposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskning om värd-mikrob interaktioner har funnit att olika gut mikrober påverkar deras värd fysiologi via olika mekanismer. Denna artikel introducerar metoden för att undersöka respektive roll mygga gut mikrob, inklusive dissekera mygga midgut, culturing cultivable tarmbakterier, antibiotikabehandling, och återinföra bakterier av intresse.
För framgångsrik antibiotikabehandling måste följande detaljer beaktas vid genomförandet av experimentet. I detta protokoll behandlades myggor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), och Science and Technology Plan Project of Hunan-provinsen (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
