Summary
Questo articolo presenta un protocollo per studiare l'effetto dei singoli batteri dell'intestino di zanzara, tra cui l'isolamento e l'identificazione di microbi cultivable delle zanzare, l'esaurimento antibiotico dei batteri dell'intestino di zanzara e reintrodurre una specie di batteri specifici.
Abstract
La zanzara midgut ospita un microbioma altamente dinamico che influenza il metabolismo dell'ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza vettoriale. Sono stati condotti studi per studiare l'effetto dei microbi intestinali nel loro complesso; tuttavia, microbi diversi potrebbero esercitare effetti distinti verso l'ospite. Questo articolo fornisce la metodologia per studiare l'effetto di ogni microbo specifico dell'intestino di zanzara e il potenziale meccanismo.
Questo protocollo contiene due parti. La prima parte introduce come sezionare la zanzara midgut, isolare colonie batteriche cultivable, e identificare le specie di batteri. La seconda parte fornisce la procedura per generare zanzare trattate con antibiotici e reintrodurre una specie di batteri specifici.
Introduction
Le zanzare sono considerate i vettori più importanti delle malattie patogene umane, trasmettendo oltre un centinaio di patogeni tra cui il virus zoika, il virus Dengue e i parassiti del Plasmodium 1. Quando le zanzare prendono un pasto di sangue per acquisire nutrienti per l'oviposizione, possono accidentalmente ingerire agenti patogeni da un ospite infetto tramite il tratto digestivo2. È importante sottolineare che la zanzara midgut, che svolge un ruolo fondamentale sia nella digestione dei pasti sanguigni che nell'ingresso di agenti patogeni, ospita un microbiomaaltamente dinamico 3.
Diversi studi hanno caratterizzato il microbiota di zanzara allevato in laboratorio e raccolto sul campo utilizzando un metodo dipendente dalla coltura o un asquencing di sequenziamentobatterico 4,5,6. Specie tra cui Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, e Enterococcus sono comunemente isolati dalle zanzare in varistudi 5,7,8,9. È interessante notare che il microbiota dell'intestino di zanzara fluttua dinamicamente sia nella diversità della comunità che nella quantità di specie batteriche, influenzate dalla fase di sviluppo, dalle specie, dall'origine geografica e dal comportamento alimentare4. Gli studi dimostrano che l'alimentazione del sangue aumenta drammaticamente il carico batterico totale con una rapida espansione delle specie da Enterobacteriaceae e una riduzione della diversitàcomplessiva 10,11. Inoltre, il microbiota intestinale della zanzara dello stadio larvale viene solitamente sradicato quando l'insetto subisce la metamorfosi durante la pupazione e l'eclosione; quindi, le zanzare adulte appena emerse hanno bisogno di ripopolare il loro microbiota4.
Il microbiota intestinale modula la fisiologia degli insetti in vari aspetti, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, l'immunità, lo sviluppo, la riproduzione e la competenzavettoriale 12. Le larve di zanzara ascia non riescono a svilupparsi oltre la prima instar mentre un approvvigionamento orale batterico salva lo sviluppo, indicando che il microbo intestinale della zanzara è essenziale per lo sviluppo larvale13,14. Inoltre, l'esaurimento dei batteri intestinali ritarda la digestione dei pasti nel sangue e l'assorbimento dei nutrienti, influisce sulla maturazione degli oociti e diminuisce l'oviposizione15. Inoltre, le zanzare con microflora intestinale suscitano risposte immunitarie più elevate rispetto alle zanzare trattate con antibiotici, con espressione di peptidi antimicrobici costantemente elevata contro altri patogeni perinfettare 16. Gli antibiotici sono di solito somministrati per via orale per rimuovere i batteri intestinali pan in questi studi, e poi vengono condotti esperimenti per confrontare la differenza tra zanzare asceniche e zanzare con microbi commensal. Tuttavia, la zanzara midgut ospita una comunità diversificata di microbi, e ogni specie di batteri potrebbe esercitare un effetto distinto verso la fisiologia ospite.
Il microbiota delle zanzare regola la competenza vettoriale con effetti divergenti. La colonizzazione da parte di Proteus isolato dalle zanzare derivate dal campo delle aree dengue-endemiche conferisce l'espressione di peptidi antimicrobici e la resistenza contro l'infezione da virus dengue16. Il fungo entomopatogenico Beauveria bassiana attiva il percorso immunitario Toll e JAK-STAT contro l'infezione da arbovirus17. Al contrario, il fungo Talaromyces isolato da Aedes aegypti midgut facilita l'infezione da virus dengue modulando l'attività di trypsinaintestinale 18. Inoltre, Serratia marcescens promuove la trasmissione dell'arbovirus attraverso una proteina secretoria chiamata SmEnhancin, che digerisce lo strato di mucina sull'epitelio intestinale delle zanzare19.
Questa procedura fornisce un metodo sistematico e intuitivo per la dissezione della zanzara midgut, l'isolamento delle colonie di batteri cultizzabili, l'identificazione delle specie batteriche e la reintroduzione tramite alimentazione orale. Fornisce risultati rappresentativi dell'alimentazione del sangue con un batterio commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sullo sviluppo dell'ovaio delle zanzare e sull'oviposizione.
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Protocol
1. dissezione midgut e isolamento batterico cultivable bacteria isolation
- Preparare la zanzara per la dissezione.
- Raccogliere le zanzare 7-9 giorni dopo l'emergere con un aspiratore. Anestetizzare le zanzare raccolte sottoponendole a una temperatura di 4 gradi centigradi per 3-5 min e mantenere le zanzare anestetizzate in un piatto Petri ghiacciato fino alla dissezione.
- Sterilizzare gli strumenti di laboratorio e la superficie della zanzara.
- Sterilizzare il banco dell'esperimento, sezionare microscopio, forze e vetrate spruzzando 75% di etanolo per evitare la contaminazione da batteri provenienti dall'ambiente.
- Preparare un piatto Petri sterile contenente il 75% di etanolo e due piatti Petri contenenti salina tamponata sterile 1x fosfato (1x PBS).
- Superficie-sterilizzare la zanzara immergendoli e scuotendoli in 75% etanolo per 3 min, e risciacquare due volte con 1x tampone PBS nel caso in cui l'etanolo colpisce la flora intestinale sezionata.
- Dissacre la zanzara midgut.
- Trasferire la zanzara sterilizzata in superficie sullo scivolo di vetro con una goccia di tampone sterile 1x PBS. Dissect sotto il microscopio sezionante.
- Sotto l'ingrandimento inferiore del microscopio sezionante, rimuovere con attenzione le gambe, le ali e la testa della zanzara per evitare la fuga. Rimuovere l'ultimo somite della zanzara tagliando direttamente, piuttosto che tirarla, per evitare che il tratto digestivo si rompa.
- Bloccare il torace della zanzara e l'estremità dell'addome con le forcetti. Estrarre delicatamente il tratto digestivo della zanzara. Il tratto digestivo acquisito di solito contiene il raccolto, il foregut, il midgut, il hindgut e i tubi Malpighian.
- Regolare il microscopio sezionante su un ingrandimento più elevato. Rimuovere il raccolto, il foregut, il hindgut e i tubi Malpighian dal tratto digestivo sezionato per ottenere il midgut della zanzara.
- Fare attenzione durante la rimozione del raccolto, come il raccolto si gonfia e assomiglia al midgut dopo che la zanzara prende un pasto di zucchero. I tubi Malpighian, un gruppo di tubi escretori lunghi e sottili, si trovano al confine tra il midgut e il hindgut.
- Isolare i batteri intestinali.
- Trasferire il midgut sezionato in un tubo sterile da 1,5 mL con 200 L di tampone sterile 1x PBS.
- Macinare accuratamente il midgut su una panca sterile con un pestello sterile per consentire il rilascio completo di batteri intestinali al tampone.
- Diluire l'omogenea a tre diluizioni da 10 volte. Aggiungere 50 L di ogni diluizione alla piastra di agar LB (brodo di Luria), quindi stenderla sul piatto. Se il midgut contiene un'alta concentrazione di flora intestinale, è essenziale fare più diluizioni seriali per scegliere singole colonie.
- Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 1-2 giorni fino a quando non sono visibili singole colonie.
- Identificazione delle specie
- Raccogliere singole colonie e inocularle rispettivamente in un flacone conico da 150 mL contenente 50 mL di media brodo LB.
- Agitare i batteri a 37 gradi centigradi durante la notte.
- Estrarre il DNA totale dal kit di estrazione del DNA genomico batterico. Amplificare 16S rDNA mediante reazione a catena di polimerasi (PCR).
NOTA: Ci sono più segmenti in 16S rDNA che sono conservati. Sulla base di queste regioni conservate, primer universali per i batteri possono essere progettati per amplificare frammenti 16S rDNA di tutti i batteri. Questi primer sono specifici per i batteri, e la differenza nella regione variabile di 16S rDNA può essere utilizzata per distinguere diversi batteri. Pertanto, 16S rDNA è ampiamente utilizzato per l'identificazione batterica. - Recuperare e purificare i frammenti di DNA dai prodotti PCR mediante elettroforesi gel agarose e un kit di recupero gel commerciale.
- Eseguire il sequenziamento del DNA sui frammenti di DNA purificati per ottenere sequenze geniche batteriche.
- Confrontare la sequenza genica 16S rRNA con la sequenza batterica disponibile in GenBank. Selezionare il database Batteri e Archaea.
NOTA: l'identificazione al livello della specie è stata definita come somiglianza della sequenza rDNA del 99% 16S con la voce GenBank più vicina. L'isolato è stato assegnato al genere corrispondente quando la sua somiglianza di sequenza 16S rDNA era <99% e 95%.
2. Trattamento antibiotico e reintroduzione del batterio
- Preparare la soluzione antibiotica.
- Pesare la quantità richiesta di saccarosio, penicillina e streptomicina per preparare una soluzione di saccarosio del 10%, comprendenti 20 unità di penicillina e 20 g di streptomicina per mL.
- Nutrire le zanzare con la soluzione antibiotica.
- Anestetizzare le zanzare in 4 gradi centigradi per 3-5 min. Trasferire le zanzare in un tazza di carta. Coprire la parte superiore con garza e avvolgere la garza con del nastro adesivo per evitare che le zanzare s scappatono.
- Immergere le batuffoli di cotone sterili nella soluzione antibiotica e posizionarle con attenzione sulla coppa di zanzara. Spremere i batuffoli di cotone prima dell'uso per evitare che le zanzare annegano nei palline di cotone gocciolanti.
- Coprire i batuffoli di cotone con un piatto Petri da 10 cm per evitare l'evaporazione dell'umidità. Sostituire i batuffoli di cotone due volte al giorno per tre giorni consecutivi.
- Confermare l'efficacia del trattamento antibiotico.
- Secondo il metodo di cui sopra, sezionare il midgut di zanzare trattate con antibiotici.
- Trasferire i midguts sezionati in un tubo sterile da 1,5 mL con 200 L di tampone sterile 1x PBS.
- Macinare accuratamente i midguts in una panca sterile con un pestello sterile per consentire il rilascio completo di batteri intestinali al tampone.
- Estrarre il DNA microbico intestinale dal kit di estrazione del DNA genomico batterico.
- Eseguire la quantificazione batterica mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR) sul DNA genomico utilizzando primer eubacteria universali (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT e R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
- Preparazione delle sospensioni batteriche
- Misurare la soluzione batterica con uno spettrofotometro. Aggiungere 1 sospensione batterica OD (OD600) in un tubo da 1 mL. Centrifugare la sospensione a 5.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Eliminare il supernatant e aggiungere 1 mL di tampone sterile 1x PBS a tubo da 1,5 mL per le precipitazioni delle sospensioni.
- Centrifuga a 5.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi; scartare il supernatant.
- Ripetere i passaggi 2.4.2 e 2.4.3.
- Aggiungere 200 L di tampone sterile 1x PBS alla precipitazione batterica.
- Aggiungere 600 L della soluzione di saccarosio del 10%, 200 L di 10 mm ATP (che agisce come fagostimolante) e 200 L di sospensione batterica in un tubo sterile da 1,5 mL. Mescolare per vortice. In alternativa, sospendere i batteri pelletati nel sangue inattivato dal calore.
- Preparazione del sangue inattivato dal calore
- Raccogliere sangue fresco con un tubo anticoagulante.
- Prendere 2-3 mL di sangue fresco. Centrifuga a 1.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per separare plasma e cellule del sangue. Si noti che il sangue andrà perso durante la centrifugazione e il processo di lavaggio; è necessario calcolare l'utilizzo in anticipo.
- Raccogliere il plasma in un nuovo tubo da 1,5 mL e inattivare il calore a 56 gradi centigradi per 1 h.
- Aggiungere 500 L di tampone sterile 1x PBS a 1,5 mL tubo per la sospensione delle cellule del sangue. Centrifuga a 1.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e quindi scartare il supernante.
- Ripetere il passaggio 2.4.7.4 due volte.
- Riespondare le cellule del sangue con plasma inattivato dal calore per ottenere sangue inattivato dal calore.
- Seguire i passaggi da 2.4.1 a 2.4.4 per ottenere 1 OD batterico pelleted.
- Riesosponda i batteri pelletati con 1 mL di sangue inattivato dal calore.
- Nutrire la zanzara con sospensione batteri.
- Affama le zanzare per 24 h, permettendo agli antibiotici di metabolizzare prima di nutrire i batteri.
- Assemblare il sistema di alimentazione a membrana.
- Sigillare l'unità di alimentazione sterilizzata con un parafilm, in alternativa una membrana di collagene.
- Mettere su un anello di plastica e fissarlo con parafilm per evitare la rottura a causa di attrito durante l'alimentazione.
- Aggiungere lentamente la soluzione batterica preparata all'unità di alimentazione. Si noti che solo un pozzo dell'unità di alimentazione a due pozzo può essere riempito con la soluzione e coprire l'unità di alimentazione solo dal lato di caduta del reagente.
- Collegare l'unità di alimentazione a un sistema di alimentazione preriscaldato a 37 gradi centigradi, che simula la temperatura umana per attirare le zanzare. Posizionare il dispositivo di alimentazione su una tazza di carta piena di zanzare e nutrirsi per 90 min.
- Dopo l'alimentazione, anestetizzare le zanzare sottoponendole a una temperatura di 4 gradi centigradi per 3-5 min e mantenere le zanzare anestetizzate in un piatto Petri ghiacciato.
- Scegli le zanzare completamente engorged per ulteriori studi.
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Representative Results
I midguts di zanzare trattate con antibiotici e senza antibiotici sono stati prelevati per l'estrazione del DNA, e qPCR è stato eseguito con primer batterici universali. La figura 1 mostra l'espressione del rRNA 16S batterico nel gruppo di controllo e nel gruppo di trattamento antibiotico. I risultati mostrano che circa il 98% dei batteri intestinali sono stati rimossi e la sterilizzazione intestinale della penicillina e della streptomicina ha avuto successo.
Con i metodi descritti, i ceppi batterici sono stati isolati e identificati. C. meningosepticum è un bacillo aerobico nonfermenting, ossidasi-positivo gram-negativo, appartenente a Chryseobacterium. La figura 2 mostra l'uovo medio deposto per zanzara dopo l'alimentazione del sangue di zanzare trattate con antibiotici con C. meningosepticum. Figura 3 mostra l'espressione di geni correlati allo sviluppo ovarico 24 h dopo pasto di sangue contenente C. meningosepticum. Una panoramica dei geni e delle sequenze primer correlati allo sviluppo ovarico è elencata nella Tabella 1.
Il ceppo isolato dai batteri intestinali da cui sono stati rimossi i batteri intestinali e quindi le zanzare completamente engorged sono state divise in tre gruppi. Cinque femmine nel primo gruppo e nel secondo gruppo sono state utilizzate per contare la quantità di deposizione delle uova, e 10 femmine nel terzo gruppo sono state utilizzate per rilevare l'espressione genica correlata allo sviluppo ovarico dopo 24 h di ogni zanzara femmina dopo l'alimentazione, rispettivamente. I risultati mostrano che non vi è alcun cambiamento significativo nella produzione di uova del gruppo di controllo e del gruppo di alimentazione.
Figura 1: Espressione di 16S rRNA dopo il trattamento antibiotico. Le zanzare con antibiotici non trattati servivano come gruppo di controllo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto del microbo intestinale sull'oviposizione delle zanzare. I ceppi di batteri indicati sono stati mescolati con sangue e alimentati con zanzare trattate con antibiotici. Le zanzare con microbi commensali intestinali non trattati servivano come gruppo di controllo. I dati sono presentati come media : SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione dei geni correlati alla riproduzione dopo l'alimentazione del sangue. Espressione di Cathepsin B (A), inibitore ATPase mitocondriale (B), ribososom biogenesi proteina brix (C) e Serina/Threonine-protein kinase rio2 (D) dopo l'alimentazione del sangue di zanzare trattate con antibiotici per 24 h con i ceppi batterici indicati. Le zanzare con microbi commensali intestinali non trattati servivano come gruppo di controllo. Ogni punto rappresenta una zanzara e ogni linea rappresenta il valore mediano del gruppo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome | numero gene | sequenza primer |
| Cathepsin B | AAEL009642 | Primer in avanti-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA |
| Primer inverso-AATCCCACATCCACCCAGTA | ||
| Inibitore ATPase mitocondriale | AAEL004284 | Primer in avanti-CAACTGCACAAGAGAGAGGAGA |
| Primer inverso-ACGTGCGATAGCTTCTGT | ||
| Brix proteica di biogenesi ribososome | AAEL001917 | Primer forward-GAACCACAAGCGAATGAA |
| Primer inverso-TTGGCCTTGAGTGTGTCTT | ||
| Serina/Threonine-proteina chinasi rio2 | AAEL011114 | Primer in avanti-GAGGAAAGCACACACACACACA |
| Primer inverso-TCGAATGGCTTTTCCATTTC |
Tabella 1: Geni correlati allo sviluppo ovarico e sequenze primer.
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Discussion
La ricerca sulle interazioni ospite-microbi ha scoperto che diversi microbi intestinali influenzano la loro fisiologia ospite attraverso meccanismi divergenti. Questo articolo introduce il metodo per studiare il rispettivo ruolo del microbo intestinale della zanzara, tra cui sezionare la zanzara midgut, culturing batteri intestinali culti, trattamento antibiotico, e reintrodurre i batteri di interesse.
Per un trattamento antibiotico di successo, i seguenti dettagli devono essere considerati nel condurre l'esperimento. In questo protocollo, le zanzare sono state trattate con batuffoli di cotone in umido con una soluzione di saccarosio del 10%, tra cui 20 unità di penicillina e 20 g di streptomicina per mL per 3giorni 11,16. Penicillina servito come un antibiotico ad ampio spettro contro i batteri gram-positivi, e streptomicina servito come un antibiotico ad ampio spettro contro i batteri gram-negativi20. Una corretta conservazione degli antibiotici è fondamentale per un trattamento antibioticoefficiente 21. Se conservata a -18 gradi centigradi, la stabilità della penicillina G è di almeno 3 m. La streptomicina è stabile per almeno 12 m se conservata a 4 gradicentigradi. Mentre le differenze nel marchio antibiotico o nel tempo di conservazione possono causare lievi differenze nella liquidazione microbica, è necessario verificare l'efficienza dopo ogni trattamento antibiotico. Oltre al qPCR, la diffusione della piastra o l'utilizzo della PCR sono comunemente utilizzati per valutare l'efficienza del trattamentoantibiotico 23,24. Inoltre, per evitare che le zanzare vengano contaminate da altri batteri dopo il trattamento antibiotico, il saggio di alimentazione deve essere eseguito con attrezzature sterilizzate assemblate sotto un banco super pulito.
Prima dell'alimentazione orale batterica, le zanzare devono essere affamate per 24 h per consentire agli antibiotici di essere metabolizzati25. Questo non solo aiuta le zanzare a ingerire liquidi batteri, ma impedisce anche agli antibiotici di uccidere i batteri.
Certo, questo protocollo è principalmente per indagare l'effetto dei batteri culti. Per studiare il microbiota intestinale dell'ospite di vertebrati e invertebrati, la reintroduzione di batteri cultiviabili all'ospite trattato con antibiotici è comunemente utilizzata nelle recenti ricerche8,26,27. Inoltre, l'identificazione iniziale dei batteri intestinali colturati si basa generalmente sulle caratteristiche di dimensione della colonia, forma, colore, bordo, opacità, altezza e consistenza28. Per i batteri non culturabili, gli approcci metagenomici basati sul sequenziamento ad alta produttività forniranno probabilmente informazioni complete sulla composizione totale del microbiota midgut29,30,31. Tuttavia, l'interazione tra i batteri non culturabili e l'ospite rimane in gran parte inesplorato.
Questo articolo offre due opzioni alternative per studiare l'effetto del microbo intestinale sull'oviposizione delle zanzare, mescolare i batteri con sangue inattivato dal calore o l'impianto dei batteri tramite l'alimentazione da zucchero seguita dall'alimentazione del sangue. I risultati rappresentativi di questo manoscritto hanno adottato la prima opzione, mentre quest'ultimo metodo ha generato risultati simili. Vari studi potrebbero essere condotti dopo l'alimentazione orale con un ceppo batterico specifico. Il saggio successivo potrebbe essere usato per studiare come il fattore microbico modula il comportamento del locomotore della zanzara. Il saggio di quantificazione delle proteine potrebbe essere seguito per studiare gli effetti di diversi batteri sulla digestione. Con piccole modifiche, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare i rispettivi effetti di vari microbi verso la fisiologia delle zanzare, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, l'immunità, lo sviluppo, la riproduzione e la competenza vettoriale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), e dal Science and Technology Plan Project della provincia di Hunan (2019RS1036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
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