Summary
ניסוחים אבקה יבשה לשאיפה יש פוטנציאל גדול בטיפול במחלות בדרכי הנשימה. לפני הכניסה למחקרים בבני אדם, יש צורך להעריך את היעילות של ניסוח אבקה יבשה במחקרים פרה-קוליניים. מוצגת שיטה פשוטה ולא פולשנית לניהול אבקה יבשה בעכברים דרך המסלול התוך-מסלולי.
Abstract
בהתפתחות של ניסוחים אבקה יבשה שאיפה, חיוני להעריך את הפעילות הביולוגית שלהם במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים. נייר זה מציג שיטה לא פולשנית של אספקה תוך-צדדית של ניסוח אבקה יבשה בעכברים. מוצג התקן טעינת אבקה יבשה המורכב מקצה פיפט לטעינת ג'ל 200 μL המחובר למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת. כמות קטנה של אבקה יבשה (1-2 מ"ג) נטענת לתוך קצה פיפטה ומפוזר על ידי 0.6 מ"ל של אוויר במזרק. בגלל טיפים פיפטה הם חד פעמיים וזולים, ניסוחים אבקה יבשה שונים ניתן לטעון לתוך טיפים שונים מראש. ניסוחים שונים ניתן להעריך באותו ניסוי בעלי חיים ללא ניקוי המכשיר ומילוי מינון, ובכך לחסוך זמן ומבטל את הסיכון של זיהום צולב מאבקה שיורית. ניתן לבדוק את היקף פיזור האבקה על ידי כמות האבקה שנותרה בקצה פיפטה. פרוטוקול של אינטובציה בעכבר עם מקור אור בהתאמה אישית וקנולה מנחה כלול. אינטובציה נכונה היא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על האספקה התוך-סטרית של ניסוח אבקה יבשה לאזור הריאות העמוקות של העכבר.
Introduction
מסלול הריאות של הממשל מציע יתרונות שונים באספקת טיפולים הן לפעולות מקומיות והן לפעולות מערכתיות. לטיפול במחלות ריאה, ריכוז תרופות מקומי גבוה יכול להיות מושגת על ידי משלוח ריאתי, ובכך להפחית את המינון הנדרש ולהוריד את השכיחות של תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, פעילות אנזימטית נמוכה יחסית בריאה יכולה להפחית את חילוף החומרים של תרופות מוקדמות. הריאות יעילות גם לספיגת תרופות לפעולה מערכתית בשל שטח הפנים הגדול והחדור היטב, שכבת תאי האפיתל הדקה ביותר ונפח הדם הגבוה בנימים ריאתי1.
פורמולציות אבקה יבשה בשאיפה נחקרו בהרחבה למניעה וטיפול במחלות שונות כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, סוכרת וחיסון ריאתי2,3,4. תרופות במצב מוצק הם בדרך כלל יציבים יותר מאשר בצורה נוזלית, משאפי אבקה יבשה הם ניידים יותר וידידותי למשתמש מאשר nebulizers5,6. בהתפתחות של ניסוחים אבקה יבשה בשאיפה, הבטיחות, הפרופיל הפרמקוקינטי ואת היעילות הטיפולית צריך להיות מוערך במודלים פרה-קוליניים בעלי חיים לאחר מתן ריאתי7. שלא כמו בני אדם שיכולים לשאוף אבקה יבשה באופן פעיל, משלוח ריאתי של אבקה יבשה לבעלי חיים קטנים הוא מאתגר. יש צורך לקבוע פרוטוקול יעיל של אספקת אבקה יבשה לריאות של בעלי חיים.
עכברים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים של בעלי חיים מחקר כי הם חסכוניים והם מתרבים היטב. הם גם קלים לטיפול ומודלים רבים של מחלות מבוססים היטב. ישנן שתי גישות עיקריות לניהול אבקה יבשה לריאה של העכבר: שאיפה וניהול תוך-כיווני. לשאיפה, העכבר ממוקם בתא גוף שלם או אף בלבד שבו אבקה יבשה הוא אירוסול ובעלי החיים לנשום בתרסיס ללא סם8,9. ציוד יקר נדרש ויעילות אספקת הסמים נמוכה. בעוד תא כל הגוף עשוי להיות מבחינה טכנית פחות מאתגר, תא החשיפה לאף בלבד יכול למזער את החשיפה של תרופות לפני השטח של הגוף. ללא קשר, עדיין קשה לשלוט במדויק ולקבוע את המינון המועבר לריאות. האבקה היבשה מופקדת בעיקר באזור nasopharynx שבו סיווג רירי בולט10. יתר על כן, עכברים בתוך התא נמצאים תחת לחץ משמעותי במהלך תהליך הממשל כי הם מוגבלים מקופחים של אספקת מזון ומים11. עבור ניהול תוך-סחיר, זה בדרך כלל מתייחס המבוא של החומר ישירות לתוך קנה הנשימה. ישנן שתי טכניקות שונות כדי להשיג זאת: קנה הנשימה ו אינטובציה orotracheal. הראשון דורש הליך כירורגי שעושה חתך בקנה הנשימה, שהוא פולשני ולעתים רחוקות משמש לניהול אבקה. רק הטכניקה השנייה מתוארת כאן. בהשוואה לשיטת השאיפה, ניהול תוך-סחווי הוא השיטה הנפוצה יותר לאספקה ריאתי בעכבר בגלל יעילות המסירה הגבוהה שלו עם אובדן סמים מינימלי12,13. זוהי שיטה פשוטה ומהירה כדי לספק בדיוק כמות קטנה של אבקה בתוך כמה מיליגרם לעכבר. למרות שהעכבר נבדל אנטומית ופיזיולוגית לבני אדם וההרדמה נדרשת במהלך תהליך הצנרור, ניהול תוך-סחווי עוקף את דרכי הנשימה העליונות ומציע דרך יעילה יותר להעריך את הפעילות הביולוגית של ניסוח האבקה היבשה כגון ספיגת הריאות, הזמינות הביולוגית והאפקטים הטיפוליים14,15.
כדי לנהל אבקה יבשה תוך-אופן, העכבר צריך להיות צנרור, אשר יכול להיות מאתגר. בנייר זה מתואר ייצור של אבקה יבשה בהזמנה אישית ומכשיר אינטובציה. ההליכים של אינטובציה ו insufflation של אבקה יבשה בריאה של העכבר הם הפגינו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים שנערכו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לשימוש בבעלי חיים להוראה ומחקר (CULATR), אוניברסיטת הונג קונג. ניסוחים אבקה יבשה שהוכנו על ידי ייבוש הקפאת ספריי (SFD) המכיל 0.5% של RNA שליח לוציפראז (mRNA), 5% פפטיד סינתטי PEG12KL4 ו 94.5% של מניטול (w / w) משמשים במחקר זה כדי להדגים ביטוי mRNA בריאה16. הקוטר האווירודינמי החציוני ההמוני (MMAD) של אבקת SFD הוא 2.4 מיקרומטר. אבקת מניטול מיובשת ספריי (SD) משמשים כדי לחקור את ההשפעה של נפח האוויר המשמש פיזור אבקה16. MMAD של אבקת SD הוא 1.5 מיקרומטר.
1. ייצור של אבקה יבשה אינזלטור והעמסה של אבקה יבשה
- (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לנטרל את הטעינה הסטטית של אבקה יבשה (בבקבוקון) ואת קצה פיפטה עגול 200 μL ללא מסנן. השתמש באקדח אנטי סטטי או איזון עם פונקציית deionizing על פי הוראות היצרן.
- מכינים נייר שקילה בגודל של כ 4 ס"מ x 4 ס"מ. מקפלים את הנייר לחצי באלכסון ולאחר מכן לפתוח אותו.
- שוקלים 1-2 מ"ג אבקה יבשה על נייר השקילה.
- מלאו טיפ פיפטה לטעינת ג'ל באבקה דרך הפתח הרחב יותר של הקצה. הקש בעדינות כדי לארוז את האבקה עד שהאבקה תסתובב בחופשיות ליד הקצה הצר של הקצה (איור 1A). הימנע אריזת האבקה חזק מדי כפי שהוא עלול לעכב את פיזור אבקה.
- חברו את הקצה הטעון באבקה למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת(איור 1B). ניתן לשנות את גודל המזרק בהתאם לנפח האוויר המשמש לפיזור האבקה. החזק את הקצה ומזרק אנכית במהלך החיבור כדי למנוע שפיכה של אבקה. אם הניהול אינו מבוצע באופן מיידי, השתמש בפרפילם כדי לאטום את פתחי הקצה ולאחסן אותו באופן זמני בתנאים מתאימים עד להנהלה.
2. ייצור של מכשיר אינטובציה
- מקור אור (איור 2)
- הכינו מקור אור בהתאמה אישית עם לפיד דיודה פולט אור (LED) וסיבים אופטיים גמישים בקוטר של 0.8-1 מ"מ.
- הפוך פתח ממורכז על העדשה הברורה של לפיד LED עם מקדחה ביד או קצת מקדחה, כך הסיב האופטי בקושי יכול לעבור.
- הכנס את הסיב האופטי דרך הפתח. הפעל את לפיד ה- LED כדי לכוונן את המיקום ואת עומק ההכנסה לקבלת בהירות מרבית בקצה השני של הסיב האופטי.
- הדבק את הסיב האופטי במיקום עם דבק אפוקסי ברור.
- קנולה מנחה (איור 3)
- קחו פיפט פסטר מפלסטיק 1 מ"ל(איור 3A)והחזיקו את הפיפט בשני קצותיו.
- השתמש במנורת אלכוהול (או במקורות חום אחרים במעבדה כגון מבער בונזן) כדי לחמם את אמצע הפיפטה על ידי הצבתה בגובה 5-10 ס"מ מעל הלהבה(איור 3B). סובב את הפיפט כדי לוודא שהוא מחומם באופן שווה.
- כאשר הפלסטיק הופך רך ומעוות, להזיז את פיפטה מן הלהבה למתוח את פיפטה בעדינות.
- חותכים את הפיפט המתוח באמצע עם זוג מספריים לחלק א' ולחלק ב'(איור 3C-E). השתמשו בחלק א' כטיפ יפה ובחלק ב' כקנולה מנחה. כדי להגדיל את הסיכוי לצנרור מוצלח עם הצינור המנחה, בצע מסגרת משופעת (לא חדה מדי שעלולה להגביר את הסיכון לפגיעה בבעל החיים) בסוף חלק ב'(איור 3F). כאשר קצה פיפטה 200 μL טעינת ג'ל (עבור טעינת אבקה) מוכנס לתוך הצינור המנחה, זה צריך לבלוט את הצינורית על ידי 1-2 מ"מ.
הערה: קנולה מנחה (חלק B) עם הממד המתאים (קוטר פנימי וחיצוני) עבור אינטובציה יכול להיות 21 מד מחט להתאים בתוכו בזמן שהוא יכול גם להתאים בתוך מחט 17 מד. ייתכן שיהיה צורך בניסיונות מרובים למתוח את הפיפטות כדי להשיג את הממד המתאים. - (אופציונלי): חותכים פתח קטן בקצה הרחב יותר של הצינורית המנחה כדי להפוך אותו לגמיש יותר כך שיהיה קל יותר להחזיק את הסיב האופטי(איור 3F). פתח זה מאפשר גם התאמה של microsprayer לניהול תרסיס נוזלי.
3. אינטובציה
- הרדמה של העכבר (BALB/c, 7-9 שבועות) עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקה תוך אישית.
- הכינו פלטפורמה העשויה פרספקס והרכיבו אותה לדוכן עם מהדק(איור 4A). מניחים את העכבר המרדים על הרציף (בסביבות 60° נטייה) בתנוחה סופית. הגובה והזווית של הנטייה של הפלטפורמה יכול להיות מותאם על ידי המיקום של מהדק על הדוכן.
- להשעות את העכבר על ידי חיבור החותכות שלו על חוט ניילון (איור 4B). לאבטח את המיקום של העכבר על ידי פיסת קלטת או גומייה.
- הכנס את הסיב האופטי לתוך הצינורית המנחה לפני הצנרור עם קצה רמת הסיבים עם פתיחת הצינורית המנחה. הפעל את לפיד ה-LED כדי להאיר.
- בעדינות לבליט את הלשון של העכבר עם זוג מלקחיים כדי לחשוף את קנה הנשימה שלה.
- השתמש ביד השנייה כדי להחזיק את הצינורית המנחה עם סיבים אופטיים בפנים. הכנס אותם דרך חלל הפה. עם התאורה מהסיבים האופטיים, ניתן לדמיין את פתיחת קנה הנשימה כפתח בין מיתרי הקול.
- יישרו את מסגרת השופעת של הצינורית המנחה לכיוון קו האמצע של הפתח (איור 5A). צנררו בעדינות את הצינורית המנחה עם סיבים אופטיים לקנה הנשימה על ידי כיוון לקצה הטוב ביותר של הצינורית בפתח קנה הנשימה.
- לאחר הצנרור, הסירו במהירות את הסיב האופטי והשאירו את הצינורית המנחה בתוך קנה הנשימה (איור 5B). נשימה נורמלית צריכה להיות נצפית.
- החזק את פיפטה קצה דק (חלק A) בפתיחת הצינור המנחה ואת האינטולט נשיפה קטנה של אוויר (כ 0.2 מ"ל) לתוך הריאה של העכבר. אינפלציה קלה בחזה העכבר מצביעה על אינטובציה נאותה. הסר את פיפטה טיפ דק לפני ניהול אבקה.
4. ניהול אבקה
- החזק את האבקה טעונה קצה המחובר המזרק כמתואר בשלב 1.5. ודא שזרימת האוויר בין המזרק לקצה מנותקת.
- משוך את בוכנה מזרק לאחור כדי למשוך 0.6 מ"ל של אוויר.
הערה: נפח האוויר המשמש לפיזור האבקה תלוי במאפייני האבקה ובכמות האבקה הטעונה. הדבר מתואר עוד יותר בסעיף התוצאות. - סובבו את השסתום של העצירה המשולשת כדי לחבר את זרימת האוויר בין המזרק לקצה הטעון באבקה.
- הכנס את הקצה הטעון באבקה לקנולה המנחה שכבר הונחה בקנה הנשימה של העכבר (איור 5C). החזק את הצינורית המנחה ולדחוף את הבוכנה מזרק בכוח בפעולה רציפה אחת כדי לפזר את האבקה כמו אירוסולים לתוך הריאה.
הערה: יש למזער כל תנועה קדימה של המכשיר כדי למנוע פגיעה בבעל החיים. - הסר את הקצה ובדוק אם האבקה בתוך הקצה התרוקנה. אם לא, חזור על שלב 4.1 עד 4.4.
הערה: אם האבקה ארוזה חזק מדי עקב הקשה מוגזמת, ייתכן שהיא לא תתפזר כראוי. - לאחר השלמת הממשל, הסר את הצינורית המנחה מקנה הנשימה.
- אפשר לעכבר להתאושש על ידי הצבתו אופקית בתנוחה על-חושית עם לשונו בולטת למחצה כדי למנוע את המצור על דרכי הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר אבקה יבשה insufflator משמש כדי לספק תרסיס אבקה לריאה של בעל חיים, נפח האוויר בשימוש הוא קריטי כפי שהוא משפיע על הבטיחות, כמו גם את יעילות פיזור האבקה. כדי לייעל את השיטה, כמויות שונות של אוויר (0.3 מ"ל, 0.6 מ"ל ו 1.0 מ"ל) שימשו כדי לפזר את האבקה היבשה (1 מ"ג של מניטול מיובש ספריי) ומשקל העכברים היה במעקב במשך 48 שעות לאחר מתן (איור 6). השימוש 0.3 מ"ל ו 0.6 מ"ל של אוויר לא לגרום לירידה במשקל של העכברים עד 48 שעות לאחר הממשל. פיזור האבקה עם 1 מ"ל של אוויר הביא מעל 5% של ירידה במשקל בתוך 24 שעות, אשר לא התאושש באופן מלא לאחר 48 שעות. בפרוטוקול זה, עכברי BALB / c של 7-9 שבועות שימשו. בהתאם למין, המתח והגיל של בעלי החיים, תכונות האבקה (למשל, חלוקת גודל החלקיקים, הלכידות והצפיפות) ומסת האבקה שיש לתת, נפח האוויר שישמש לפיזור אבקה יעיל וסובלנות לבעלי חיים עשויים לדרוש אופטימיזציה על ידי חוקרים למודלים שונים של בעלי חיים.
נוסחת אבקה יבשה שהוכנה על ידי ייבוש הקפאת ספריי (SFD) נמסרה לעכברים בשיטה המתוארת לעיל. ניסוח SFD הכיל 0.5% של mRNA המבטא חלבון לוציפראז, 5% של פפטיד סינתטי כמו וקטור משלוח ו 94.5% של מניטול16. עכברי BALB/c נוהלו תוך-טרה-צ'יאלית עם 1 מ"ג אבקת SFD המכילה 5 מיקרוגרם של mRNA והביטוי לוציפראז בריאות הוערך ב-24 שעות לאחר הניהול באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS)(איור 7). אבקת SFD פוזרו בריאה העמוקה וביטוי לוציפראז נצפתה. לשם השוואה, אבקת SFD הוקמו מחדש ב- PBS (לנפח סופי של 75 μL) ומנוהלים לעכברים כנוזל עם אותו הליך אינטובציה, אך במקום זאת נעשה שימוש במיקרוספרייר כדי ליצור תרסיס נוזלי16. הביטוי לוציפראז של ניסוח מחדש היה גבוה משמעותית מאשר ניסוח אבקה יבשה, אשר יכול להיות בגלל הבעיה פירוק אבקה או פרופיל פרמקוקינטי שונה בין אבקה לצורה נוזלית. המאפיינים ההיסטולוגיים של הריאות שטופלו בתרסיס אבקה יבשה mRNA הושוו עם שליטה לא מטופלת ו lipopolysaccharide (LPS) קבוצות שטופלו (איור 8). הריאות ללא כל טיפול המחישו מצגת בריאה בעוד הריאה שטופלה ב -10 מיקרוגרם של LPS תוך-תאי הראתה התפלגות לא סדירה של מרחב האוויר וחדירת תאים דלקתיים לחללים הבין-כוכביים והמכתשיים. הריאות שטופלו באבקת SFD לא הראו סימנים לדלקת.
איור 1: מחסן אבקה יבשה בהזמנה אישית.
(A)אבקה ארוזה ליד הקצה הצר של הקצה. (B)קצה פיפטה לטעינת ג'ל מחובר למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת. הדמות מותאמת מ ליאו ואח '21. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מקור אור בהזמנה אישית עבור אינטובציה.
סיב אופטי גמיש מחובר לפיד LED על ידי יצירת חור קטן על העדשה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הצינורית המנחה.
(A)פיפט פסטר פלסטיק 1 מ"ל משמש להכנת צינורית מנחה. (B)פיפטה מרוככת על ידי חימום. (ג)פיפטה מחוממת נמתחת וחתוכה. (ד)חלק א' של הפיפט משמש כ-pipette עדין. (E&F) חלק ב' של הפיפט משמש כקנולה מנחה. מסגרת משופעת נוצרת כדי להקל על פרוצדורת אינטובציה. פתח קטן (אופציונלי) יכול להתבצע כדי להגדיל את הגמישות של הצינורית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פלטפורמת אינטובציה.
(A)הפלטפורמה לצנרור מורכבת מלוח פרספקס המותקן על מעמד. (B)עכבר מורדם ממוקם על הרציף בתנוחה סופית, מושעה על ידי חיבור החותכות שלו עם חוט ניילון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דיאגרמה סכמטית הממחישה את פרוצדורת הצנרור.
(A) שפוע הצינורית המנחה מיושר עם קו האמצע של פתח קנה הנשימה. (B)הצינורית המנחה מוכנסת לקנה הנשימה ומוכנה לניהול אבקה. (C)הקצה טעון האבקה (מחובר למזרק דרך עצירה משולשת) מוכנס לתוך הצינור המנחה שכבר הונח בקנה הנשימה של העכבר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניהול תוך-סחירי של אבקה יבשה עם נפח אוויר שונה.
עכברי BALB/c נוהלו תוך-סחיר עם אבקת מניטול מיובשת ספריי (SD) מפוזרת על ידי 0.3 מ"ל, 0.6 מ"ל ו 1.0 מ"ל של אוויר. משקל הגוף של העכברים היה במעקב לפני הממשל וב 18 שעות, 24 שעות ו 48 שעות לאחר הממשל. הנתונים הוצגו כערך ממוצע של אחוז שינוי המשקל (n = 2). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניהול תוך-סחיר של ניסוח mRNA כאבקה יבשה ותרסיס נוזלי משוחזר.
עכברי BALB/c נוהלו תוך-סחיר עם תרסיס להקפיא מיובש (SFD) 0.5% mRNA (לוציפראז) ניסוח כמו תרסיס אבקה (1 מ"ג) באמצעות תרסיס אבקה יבשה בהתאמה אישית או תרסיס נוזלי מחדש (1 מ"ג ב 75 μL PBS) באמצעות microsprayer. כל עכבר קיבל מנה של 5 מיקרוגרם של mRNA. PBS (75 μL) שימש כפקד. בשעה 24 שעות לאחר הממשל (A) הריאות היו מבודדות להדמיית ביולומינציה; (B) נמדד ביטוי חלבון לוציפראז של רקמות הריאה. הנתונים באו לידי ביטוי כערך הממוצע של יחידת אור יחסית (RLU) לכל מ"ג חלבון, שנותחה על ידי ANOVA חד כיווני ואחריו הבדיקה שלאחר הוק של Tukey, ***p < 0.001 (n = 4). הדמות מותאמת מ- Qiu et al.16. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: היסטולוגיה של הריאות של עכברים בעקבות ניהול תוך-טראציאלי של ניסוח אבקה יבשה mRNA.
(A)שליטה לא מטופלת; עכברים היו מנוהלים תוך-סחיר עם (B) LPS (10 מ"ג ב 25 μL PBS), ו - (C) להקפיא אבקת mRNA מיובש (1 מ"ג). שקופיות נצפו באמצעות מיקרוסקופ זקוף בהגדלה של פי 20 (סרגל קנה מידה = 100 מ"מ). הדמות מותאמת מ- Qiu et al.16. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בנייר זה, מכשירים בהתאמה אישית עבור זלוף אבקה יבשה אינטובציה תוך-צ'יאלי מוצגים. בשלב טעינת האבקה, אבקה יבשה נטענת לקצה פיפטה 200 μL טעינת ג'ל. חשוב להקיש בעדינות על הקצה כדי לאפשר אריזה רופפת של אבקה בקצה הצר של הקצה. עם זאת, אם האבקה ארוזה חזק מדי, הם ייתקעו בקצה ולא ניתן לפזר כראוי. מומלץ לנטרל את הטעינה הסטטית של האבקה ואת קצה פיפטה על מנת להקל על טעינת אבקה, במיוחד עבור אבקה עם צפיפות נמוכה ולחות יחסית נמוכה. הצינורית המנחה היא מרכיב קריטי בהתקן. הוא משמש כדי להקל על הצנרור של קצה פיפטה טעון אבקה לתוך קנה הנשימה של העכבר. קוטר הצינורית המנחה לא צריך להיות רחב מדי; אחרת יהיה קשה להכניס אותו לקנה הנשימה ועלול לפגוע בעכבר. קוטר הצינורית המנחה צריך להיות רחב מספיק כדי להתאים לסיבים האופטיים ולטיפה פיפטה טעונה אבקה, ואת קצה פיפטה צריך לבלוט את הצינור המנחה על ידי כ 1-2 מ"מ.
היכולת לדמיין את פתיחת קנה הנשימה היא חיונית בתהליך הצנרור, ומאפשרת להכניס את הצינורית המנחה כראוי. פתח קנה הנשימה מורכב סחוס אריטנואיד לבן עם פתיחה קבועה ותנועת סגירה בחלק האחורי של הגרון. עם תאורת הסיבים האופטיים, ניתן היה לדמיין בקלות את פתיחת קנה הנשימה. על ידי נשיפת נפח זעיר של אוויר דרך פיפטה פלסטיק קצה דק, אינפלציה בחזה מצביע על צנרור נאות. אם האינפלציה בחזה אינה נצפית או שההתנגדות מורגשת במהלך הכניסה, חזור בו מהקנולה המנחה במהירות וחזור על השלבים שוב.
היה בשימוש נרחב מסחרית אבקה יבשה insufflator12,17,18 (שולחן החומרים;מכשיר זה הופסק כעת). האבקה היבשה נטענת לתא הדגימה של המכשיר ומפוזרת באוויר ממזרק אוויר מפלסטיק 3 מ"ל או משאבת אוויר. כדי למדוד את המינון הנפלט, המכשיר צריך להיות שקל לפני ואחרי ניהול אבקה, מה שמוביל לאי דיוק בהתחשב במינון של אבקה הוא בדרך כלל קטן מאוד (יחסית למסה של המכשיר). בהשוואה לאי ספיקה מסחרית, היתרון הגדול ביותר של המכשיר בהתאמה אישית הוא כי ההצלחה של פיזור אבקה ניתן לראות על ידי היעדר אבקה טיפים פיפטה טעינת ג'ל שקוף. מאז קצה פיפטה הוא אור, זה יכול גם להישקל במדויק לפני ואחרי הממשל כדי למדוד את המינון הנפלט. קצה פיפטה מוכנס לתוך הצינור המנחה במקום להיחשף לקנה הנשימה של החיה. קיים סיכון מינימלי לזיהום הקצה בלחות או בהפרשה בקנה הנשימה (מה שעלול להשפיע על הדיוק של מדידת המינון הנפלט). כמו טיפים פיפטה הם חד פעמיים וזולים, ניסוחים שונים אבקה יבשה ניתן לטעון לתוך טיפים שונים מראש. ניסוחים שונים ניתן להעריך באותו ניסוי בעלי חיים ללא צורך ניקוי המכשיר ומילוי מינון, ובכך לחסוך זמן ומבטל את הסיכון של זיהום צולב מאבקה שיורית. יתר על כן, דפוס פיזור האבקה שנוצר על ידי insufflator מסחרי השתנה בין ניסוחים שונים. מספר מחקרים דיווחו כי אבקה יבשה מפוזרת על ידי insufflator מסחרי היו בקלות agglomerated ולא הצליחו להגיע לריאה העמוקה על הממשל19,20. לעומת זאת, ניסוחים אחרים מפוזרים על ידי מכשירים דומים לשלנו מדווחים יש תצהיר ריאות גבוה15,21,22.
ישנם מכשירים דומים אחרים בהתאמה אישית שדווחו בספרות לניהול תרסיס אבקה לריאה של בעלי חיים. לדוגמה, Chaurasiya et al. תיאר את השימוש בצינור קנולה לצנרור, כמו גם טעינת אבקה, עם מזרק המחובר לצינור הצינור קנולה לאחר צנרור לפיזור אבקה23. בעוד הגישה שלהם משתמשת בציוד סטנדרטי וחומר (למשל, אוטוסקופ, קנולה ומזרק) עם פחות התאמה אישית, השיטה כאן מציעה כמה יתרונות ברורים. ראשית, זה מאפשר אישור של אינטובציה נכונה לפני מתן תרופות. שלב זה שימושי במיוחד עבור משתמשים פחות מנוסים. שנית, הצינורית המנחה יכולה לשמש כמגן הגנה כדי למנוע כל הפרשה או לחות בקנה הנשימה מלזהם את קצה פיפטה טעינת הג'ל, המאפשר מדידת מינון פולט מדויקת יותר על ידי שקילה. לבסוף, הצינורית המנחה הגמישה יותר יחד עם הסיב האופטי עשויה לאפשר צנרור קל יותר.
לסיכום, אבקה יבשה בהתאמה אישית insufflator שהוא זול, חד פעמי, לשחזור ויעיל בפיזור כמות קטנה של אבקה בדיוק הוא הציג בנייר זה. תהליך הצנרור שהוזכר אינו פולשני, מהיר ויכול לספק ניסוחים אבקה לעכברים בבטחה ובדייקנות. זה יכול גם להיות מאומץ כדי לנהל ניסוח נוזלי עבור משלוח ריאתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות למר ריי לי, מר HC ליונג ומר וואלאס אז על עזרתם האדיבה בהפיכת מקור האור ואבקת insufflator; ומתקן הליבה של הפקולטה לסיוע בהדמיה של בעלי חיים. העבודה נתמכה על ידי מועצת מענק המחקר, הונג קונג (17300319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
| Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Three-way stopcock | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
References
- Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
- Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
- Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
- de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
- Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
- Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
- He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
- Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
- Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454 (2017).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Price, D. N., Muttil, P.
- Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
- Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
- Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
- Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
- Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
- Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
- Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
- Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
- Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
- Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
- Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
- Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).
