Summary
Vi visar automatisering av mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) kulturer och neuronal differentieringstal kompatibel med automatiserad bildbehandling och analys.
Abstract
Manuell kultur och differentiering protokoll för mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) är svåra att standardisera, visa hög variation och är benägna att spontan differentiering till oönskade celltyper. Metoderna är arbetsintensiva och är inte lätt mottagliga för storskaliga experiment. För att övervinna dessa begränsningar, utvecklade vi en automatiserad cell kultur system kopplade till en hög genomströmning bildsystem och genomfört protokoll för att upprätthålla flera hiPSC linjer i parallella och neuronal differentiering. Vi beskriver automatisering av en kortvarig differentiering protokoll med hjälp av Neurogenin-2 (NGN2) över-uttryck för att producera hiPSC-härledda när nervceller inom 6\u20128 dagar, och genomförandet av en långsiktig differentiering protokoll för att generera hiPSC-härledda midbrain dopaminerga (mDA) nervceller inom 65 dagar. Också, Vi tillämpade NGN2 strategi för en liten molekyl-härledda neurala prekursorceller (smNPC) transduced med GFP lentivirus och etablerade en levande-cell automatiserad neurit utväxt assay. Vi presenterar ett automatiserat system med protokoll som lämpar sig för rutinmässig hiPSC kultur och differentiering till när och dopaminerga nervceller. Vår plattform är lämplig för långsiktig handsfree-kultur och hög halt/hög genomströmning hiPSC-baserad förening, RNAi och CRISPR/Cas9-visningar för att identifiera nya sjukdomsmekanismer och läkemedelsmål.
Introduction
Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) är självförnyande och kan differentiera i nästan alla vuxna celltyp. Dessa egenskaper gör hiPSC ett användbart verktyg för sjukdomsmodellering inom grundforskning och läkemedelsupptäckt1. Human iPSC behåller givaren genetisk bakgrund som tillåter härleda sjukdomsrelevanta celltyper som är mest drabbade / involverade i sjukdomsförloppet, till exempel, olika neuronala subtyper för neurodegenerativa sjukdomar2,3. Också, hiPSC övervinner några av de begränsningar av djur-och cellulära över-uttryck modeller genom modellering av sjukdomar i ett mänskligt sammanhang och fysiologiska proteinuttryck nivåer, och har visat sig vara en värdefull tillgång i modellering av sjukdomar som sträcker sig från monogena, komplexa och epigenetiska störningar samt sent sjukdomstillstånd4.
Trots dessa fördelar och möjligheter måste flera begränsningar av hiPSC fortfarande åtgärdas. Nuvarande hiPSC kultur och differentiering protokoll är inte kostnadseffektiva, svårt att standardisera och är arbetsintensiva. Manuell kultur steg kan resultera i hög variation i avkastningen och fenotyper på grund av skillnader i tillväxt och spontan differentiering av hiPSC. Därför behöver experimenterberoende variation minskas genom att man implementerar mer standardiserade hanteringstekniker och förenklar protokoll som kan uppnås med hjälp av automatisering5. Inrättandet av automatiserade hiPSC-kultur- och differentieringsprotokoll kommer att fastställa gemensamma standarder för både akademiska och industriella forskningsprojekt, och möjliggöra generering av biologiskt relevanta sjukdomsmodeller och mer reproducerbara resultat.
Tidigare arbete har försökt automatisering av hiPSC kulturer6,7,8 men deras protokoll har begränsats till specifika cellkultur plattan format beroende av systemet och saknar anpassningsförmåga till olika analysformat. Sådana system är användbara i sammanslagningen av celler men kanske inte är lämpliga för automatiserad differentiering till önskad celltyper, sjukdom fenotypning, och screening ändamål. Dessutom har en storskalig automatiserad plattform för fibroblast härledning, hiPSC generation och differentiering beskrivits9 men på en skala som endast kan uppnås genom hög genomströmning laboratorier tillägnad produktion av linjer som verkar attraktiva men kan vara dyra för många akademiska laboratorier.
Vi utvecklade ett helt automatiserat cellodlingssystem baserat på en vätskehanteringsstation i en HEPA-filtrerad miljö (High-Efficiency Particulate Air) i samband med en CO2-inkubator med stor kapacitet, en ljusfältsbildande cytometer och en robotarm för plåttransport. Dessa komponenter ger grunden för stabil och reproducerbar hiPSC-kultur och differentiering. Vi kompletterade systemet med ett automatiserat -20 °C-lagringssystem för lagring av föreningar eller virus och en höghastighetsspinnande disk confocal live-cell imager. Skräddarsydda protokoll genererades så att automatiserade cell seeding, media förändringar, konfluency kontroller, cell expansion och analysplåt generation med provbehandling och plattan bildbehandling, vilket gör systemet kompatibelt med hög halt/hög genomströmning screenings. Det automatiserade cellodlings- och bildhanteringssystemet drivs med hjälp av den kontrollerande programvaran och det skräddarsydda grafiska användargränssnittet (GUI). Gui:t tillåter användare att importera CSV-filer som innehåller cellinjespecifika parametrar som behövs för metodkörning. Dessutom aktiveras GUI för att schemalägga ett flertal experiment i valfri sekvens med hjälp av den inbyggda kalendervyn vilket möjliggör full kontroll över tiden när varje metod startar.
Vårt automatiserade cellodlingssystem använder standardiserade pipetthastigheter, passagingtider, confluencytrösklar, sådddensiteter och medelvolymer med flexibiliteten att odla celler i en mängd olika plåtformat (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brunnsplåtformat). Vi anpassade en nyligen publicerad kortvarig differentiering protokoll för att omvandla hiPSC till nervceller som kan ge TUBB3 positiva nervceller i 6 dagar10,11. Vi etablerade också den automatiserade differentiering och bildbehandling av små molekyl neurala prekursorceller (smNPC) i nervceller som utgör uttrycker GFP under EF1a promotorn12 och iPSC i midbrain dopaminergic (mDA) nervceller, anpassa en tidigare publicerad dual-SMAD hämning protokoll13 som ger mDA nervceller inom 65 dagar.
Protocol
1. Grundläggande rutiner för att automatisera cellkulturer och bildframställning
- Ladda nya odlingsplattor och tips
- Öppna GUI och klicka på resurs/ Instrument process vy knappen. För att köra någon resurs/instrument process, välj resurs/instrument process och klicka på kör Instrument processknappen.
- Kör resursprocessen RunHepaHood och Ladda om (se steg 1.1.1). Öppna dörren, ladda cellodlingsplattorna och engångsspetsarna i motsvarande läge enligt angivan i popupbilden på den kontrollerande PC:n.
- Torka av dörren med 70% etanol för sanering och stäng den. Kör instrumentprocessen Sanering från GUI(se steg 1.1.1). Systemet blir steriliserat av UV-strålning i 30 min.
- Påfyllningskulturmedia och/eller reagens för dissociation
- Utför instrumentsteget RunHepahood (se steg 1.1.1). Öppna ytterdörren till stationen för vätskehantering. Dekontaminera reservoarer (innehållande media, PBS och/eller dissociationsreagens) med 70% etanol och placera dem på däck till den tilldelade positonen (enligt definitionen i CFG.csv fil). Avlocka reservoarerna.
- Dekontaminera dörren med 70% etanol och stäng den. Kraftförsörjning ner HEPA-huven genom att köra resursen/instrumentprocessen "InitHepaHood" från GUI.
- Skapa en ny "Celllinje" och projicera i GUI:t
- Skapa/ändra de användardefinierade "Celllinjen"-filer som består av filerna Config (*.cfg.csv), import (*.imp.csv), resursen (*.rsv.csv) och arbetsflödet (*.wfl.csv) filer.
- Öppna GUI och skapa en ny "Celllinje" genom att klicka på knappen Lägg till celllinje i vyn "Celllinjeredigeraren". En guide öppnas där Config-filen behöver väljas och ett projektnamn med en kort beskrivning behöver anges.
- Navigera genom den här guiden med hjälp av den gröna pilspetsen och bekräfta inställningarna genom att klicka på den gröna bocken. Skapa ett nytt projekt för den genererade "Celllinjen" genom att klicka på knappen Lägg till projekt.
- Ange ett projektnamn och en beskrivning och definiera en projektfärg som ska vara synlig i kalendervyn i guidning. Navigera till nästa sida i guiden genom att klicka på pilspetsen.
- Skapa en ny batch genom att klicka på knappen Lägg till batch och ge ett kort namn och beskrivning i popup-fönstret. Välj alla processsteg och schemalägg starttiden för vart och ett av processsteget. Stäng fönstret genom att klicka på OK.
- Utför en automatiserad metod med GUI-gränssnittet
- Gå till kalendervyn av GUI och klicka på knappen Lägg till processsteg.
- Markera raden Cell och efter att navigera till nästa sida i guiden välja projektet. Markera partiet som ska användas och klicka på pilspetsen pekar till höger. Beroende på vilken metod som används måste satsarna vara antingen tomma (för att ta emot nya plattor), eller innehålla odlingsplattor eller analysplattor (alla andra processer).
- Navigera till nästa sida i guiden och välj det processsteg som ska utföras. Gå till den sista sidan i den här guiden och schemalägg experimentet. I avsnittet "Parameter Detaljer" variabler som behövs för att köra metoden kan ändras. Bekräfta genom att klicka på OK.
- Inläsning av odlings- och analysplattor i CO2-inkubatorn
OBS: 1-brunnsplattor definieras som odlingsplattor eftersom de vanligen används för att bulkceller. Alla fler-brunnsplattor definieras som analysplattor.- Utför instrumentprocessen "RunHepaHood" från GUI:t enligt beskrivningen i steg 1.1.1. och öppna dörren framför robotarmen.
- Torka av botten på analysplattorna med 70% etanol och en luddfri vävnad om plattor laddas för automatiserad bildbehandling. Placera kultur eller analysplattor på vänster hylla. Se till att plattans orientering är korrekt. För analysplattor måste väl A1 peka mot robotarmen medan kanterna på kulturplattor måste peka åt höger.
- Torka av dörren med 70% etanol för sanering och stäng den.
- Utför metoden "Loading Of Culture Plates" för import av 1-brunnsplåtar eller "Lastning av analysplattor" för import av fler-brunnsplåtar enligt beskrivningen i steg 1.4. Använd en tom bunt för att köra båda metoderna. Om streckkoder redan finns i denna batch avmarkerar du dem genom att klicka på checkboxarna.
- Transportera enskilda plattor från hyllan till CO2-inkubatorplattformen med hjälp av robotarmen. Den inbyggda plattan shuttle station hämtar plattan och lagrar dem i en av rack av CO2 inkubatorn. Cellerna bibehålls vid 37 °C och 5% CO2.
- Lossning av plattor från CO2-inkubatorn
- Utför metoden "Lossa plattor" (se steg 1.4). Välj den sats som innehåller de plattor som behöver exporteras. Enskilda plattor kan väljas av sina streckkoder.
- Transportera ut plattorna från CO2-inkubatorn till vänster hylla med hjälp av robotarmen.
- Starta HEPA-huven genom att använda instrumentprocessen "RunHepaHood" enligt beskrivningen i steg 1.1.1. och öppna dörren framför robotarmen. Ta bort plattorna, dekontaminera dörren med 70% etanol innan du stänger den och stänga ner HEPA huven.
2. Automatiseringsprotokoll
- Såning av plattor från rör
- Starta HEPA-huven genom att exekvera instrumentprocessen RunHepaHood (se steg 1.1.1). Öppna dörren framför vätskehanteringsstationen. Mata in 50 mL-tuben som innehåller cellupphängningen och avlocka röret.
- Öppna dörren framför robotarmen och lastbelagt odlingsplattor för mottagning av celler på hyllan. Dekontaminera och stäng båda dörrarna. Utför metoden "Seedning av plattor från rör" (se steg 1.4).
- Räkna celler vid brightfield imaging cytometer med hjälp av direkt cellräkning funktion. För cellräkning, använd 16 brunnar som replikat i ett 384-brunnsplattformat.
- Transportera 384-brunnsräkningsplattan från däcket till ljusfältsbildande cytometern via skivspelaren med hjälp av robotarmen och starta bildhanteringsprocessen. Cytometern bestämmer automatiskt cellnumret per milliliter. För räkneplattan tillbaka till sin ursprungliga position med hjälp av robotarmen.
- Transportera en bestruken odling eller analysplatta från hyllan till pipetteringsdäcket med hjälp av robotarmen. Ta bort beläggning och fröceller i det användardefinierade talet, och volym som passar för plåtformatet (se tabell 1). Flytta plattan till på däcksskaknare i 10 s vid 500 rpm för cellfördelning och överför till CO 2-inkubatorn.
- Automatiserad sammanflödesbedömning
- Utför metoden "Kontrollera Confluency" enligt beskrivningen i steg 1.4. Välj en sats som innehåller minst en odlingsplatta och inga analysplattor. I avsnittet "Parameter Detaljer" ingång "iPSCf_2020" för bild förvärv och bildframställning analysinställningar.
- Transportera den första plattan från CO 2-inkubatorn till ljusfältsbildande cytometern via skivspelaren med hjälp av robotarmen.
- Utför avbildning av celler i den brightfield imaging cytometer för sammanflödeskontroll av hiPSC kolonier. Använd "confluence" -program- och bild 13-fält av 1-brunnspate och beräkna automatiskt den genomsnittliga area som upptas av celler.
- Transportera tillbaka plattan till CO2-inkubatorn med hjälp av robotarmen. Upprepa steg 2.2.2. till 2.2.4. för de återstående plattorna.
- Media byte av kultur plattor eller analys plattor
- Utför metoden "Media Change Of Culture Plates" enligt beskrivningen i steg 1.4. och välj ett parti som endast innehåller odlingsplattor. Ställ in variabeln som anger om spetsar eller nålar används för pipetteringsstegen i avsnittet "Parameterdetaljer". För media byte av någon multi-well-platta, verkställa metoden "Media Change Of Assay Plates" och välj ett parti som innehåller analys plattor.
- Transportera de enskilda plattorna från CO2-inkubatorn till däcket med hjälp av robotarmen och avlockar plattorna. Luta plåtarna och aspirera gamla medier automatiskt och kasta det i avfallsuppsamlingsmodulen. Tillsätt 12 mL färska medier. Återlocka plattan och transportera tillbaka plattorna till CO2-inkubatorn med hjälp av robotarmen.
- Subcultivation
OBS: Utför instrumentprocessen "RunHepaHood" från GUI enligt beskrivningen i 1.1.1. och öppna ytterdörren till vätskehanteringsstationen. Ladda media och dissociationsreagens vid de befordringslägena (se steg 1.2). Om dricks behöver fyllas på ska du använda "Omlastning" enligt beskrivningen i steg 1.1. Mata in ett 50 mL-rör för mottagning av cellupphängningen och avlocka röret.- Utför metoden "Subcultivation Of Adherent Cells" (se steg 1.4). Välj den sats som innehåller odlingsplattor som behöver subcultivation.
- Transportera plattorna från CO2-inkubatorn till däcket med hjälp av robotarmen och avlockar plattorna. Luta plattorna automatiskt och ta bort gamla medier och kasta det i avfallsuppsamlingsmodulen. Tvätta celler en gång med 8 mL PBS. Tillsätt 8 mL på 0,5 mM EDTA för klumpbaserad passaging. Inkubera på däck i 8 min.
- Ta bort EDTA-lösning från plattorna och kasta den i avfallsuppsamlingsmodulen. Tillsätt 12 mL färskt medium och transportera plattorna till skakmedlet. Skaka vid 2000 rpm i 1 min för att rubba kolonierna.
- Triturtera cellupphängningen för fem kretslopp av pipettering för att bryta iPSC-kolonierna i en mindre storlek (~50\u201280 μm). Överför cellupphängningen till ett 50 mL-rör på däcket. Fröceller automatiskt enligt beskrivningen i steg 2.1.5 med hjälp av ett split-förhållande på 1 i 7.
OBS: Valfri, enkelcellspassning. Generera en enda cell suspension med hjälp av encellig dissociation reagens (se Tabell över material). I stället för 0,5 mM EDTA i steg 2.4.2., använd 8 mL av encellig dissociationsreagens och inkubera i 20 min vid 37 °C. Samla in cellupphängningen i ett 50 mL-rör och tillsätt lika stor volym av media. Dissociation med hjälp av den enda cellen dissociation reagens kräver ett manuellt steg för att pelleta cellerna. Centrifugera celler vid 300 x g i 3 min. Ta bort supernatanten och resuspend cellpelleten i 12 mL av det nödvändiga mediet och fortsätt med "Seedning av plattor från rör" (se steg 2.1). Komplettera media med 2 μM tiazovivin på dagen för sådd när du använder single cell suspension av hiPSCs.
- Automatiserad bildbehandling med högt innehåll, högt genomflöde
OBS: Måttinställningen måste vara tillgänglig (se Tilläggsfil 1: steg 1.1). De analysplattor som ska avbildas finns i inkubatorn.- Utför metoden "Imaging" (se steg 1.4). Välj en batch som innehåller minst en analysplatta och ingen odlingsplatta. I avsnittet "Parameterdetaljer", ange plåttyp, plåtdefinitionerna (för standard 96-brunnsbildplattor: "Plate-96-20170918113842") och namnet på måttinställningen.
- Transportera analysplattan via skivspelaren till det automatiserade konfokalmikroskopet med hjälp av robotarmen för att starta bildtagningsprocessen. Återvinn plattan i slutet av avbildningen från mikroskopet och transportera den tillbaka till CO2 inkubatorn. Upprepa processen för de återstående plattorna i partiet.
3. Automatiserat underhåll och utbyggnad av hiPSC
-
Sekvensen av automatiserade konfluencykontroller, medieförändringar och subcultivation
- Fröceller på 1-brunnsplattor med "Seedning av plattor från rör" -metoden (se steg 2.1). Alternativt importera manuellt seedade 1-brunnsplattor med "Loading of culture plate" -metoden (se steg 1.5).
- Schema automatiserad konfluency kontroller dagligen för att övervaka kolonitillväxt från dag 1 till dag 6 av kulturen för iPSC (se steg 2.2).
- Uppdatera media varannan dag med metoden "Media change of culture plates" (se steg 2.3). 12 mL medium används per platta.
- På dag 6 startar du "Subcultivation"-processen (se steg 2.4.).
4. Automatiserad differentiering
- Human iPSC till kortikala NGN2 nervceller
OBS: Manuell hiPSC-förberedelse. Protokollet innebär över-uttryck för NGN2 med lentiviral vektorer för leverans. Transduce hiPSC med NGN2 till rTTA3 lentivirus i en 1:2 förhållande (> ~ 107 TU/mL). Celler väljs sedan för en passage med 0,5 μg/mL puromycin. Ett detaljerat protokoll för att generera stabila hiPSC-NGN2-linjer finns i Tilläggsfilen 1: steg 2.- Fortsätt med "Subcultivation"-processen enligt beskrivningen med hjälp av det encelliga dissociationsreagens som beskrivs i not i steg 2.4.4. när hiPSC nå 70\u201280% konfluency
- Avlägsna supernatanten och resuspend cell pelleten i 12 mL av NGN2 media (Tabell of Materials) som innehåller 2,5 μg/mL doxycyklin (dox) och 2 μM tiazovivin.
- Påbörja differentiering med hjälp av "Seedning av plattor från rör" -metoden (se steg 2.1). Ställ in önskad sådddensitet av iPSC till 30 000/cm2 (se tabell 1). IPSC är pläterade på förbelagda plattor med 0,1 mg/mL poly-L-ornitin (PLO) och 5 μg/mL laminin.
OBS: 1-brunnsplattor är att föredra för RNA- och proteomikbaserade studier medan 96-brunnsplattformatet föredras för bilddiagnostik. Andra analysplåtsformat som 48-, 24-, 12- eller 6-brunnsplåtar får också användas. - På dag 1 av differentiering, Uppdatera media med hjälp av "Media byte av analysplattor (se steg 2.3) med hjälp av NGN2 medium, kompletterat med 2,5 μg/mL dox och 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-glycin, 1,1-dimetyletyl ester (DAPT). Fortsätt med medieförändringar var 2\u20123 dagar fram till önskad dag för differentiering (se steg 2.3).
- På dag 4 av differentiering, genomföra en annan mediaförändring (se steg 2.3.) med NGN2 medium kompletterat med 10 hjärnhärledd neurotrofa faktor (BDNF) med 10 ng/mL-cellershärledd med 10 ng/mL-hjärnhärledd neurotrofa faktor (BDNF), 10 ng/mL glialcellshärdad neurotrofisk faktor (GDNF) och 10 ng/mL neurotrofa faktor 3 (NT-3) för att förstärka mognaden. I slutet av experimentet exporterar du odlingsplattorna från systemet för nedströmsexperiment (se steg 1.6).
- Små molekyler neurala föregångare celler (smNPC) till NGN2 nervceller
OBS: Härleda smNPC efter den anpassade versionen av publicerat protokoll12 (se Tilläggsfil 1: steg 5). Modifiera smNPC med NGN2 och rTTA3 virus (se Tilläggsfil 1: steg 2). En omgång NGN2 och rTTA-transduktion är tillräcklig för att generera en stabil population. Ytterligare modifiera smNPC med pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus gör det möjligt att utföra live-cell övervakning. En multiplicity av infektion (MOI) av 10 används för GFP lentiviral transduction.- Passage smNPC på att nå confluency med hjälp av enkelcells dissociationsreagens enligt beskrivningen i steg 2.4. Observera.
- Fröceller som använder det automatiserade cellodlingssystemet vid en celltäthet på 50 000/cm2 med hjälp av "Seedning av plattor från rör" -metoden (se steg 2.1.) på förbelagda plattor med 0,1 mg/mL PLO, och 5 μg/mL laminin i NGN2 medium kompletterat med 2,5 μg/mL dox.
- På dag 3 utför du ett mediabyte (se steg 1.3.) med hjälp av färskt NGN2-medium som innehåller 2,5 μg/mL dox och 10 μM DAPT. Efter dag 3, utför mediabyten var tredje dag med färskt NGN2 medium som innehåller 2,5 μg/mL dox, BDNF, GDNF och NT-3 vid 10 ng/mL vardera.
- Bildceller dagligen med hjälp av metoden "Automated high content, high throughput imaging" (se steg 2.5) för övervakning av differentieringsstatus med hjälp av GFP som avläsning för neuritutväxt. Ställ in lasereffekten på 80 % och använd en exponeringstid på 30 ms. Skaffa ett stort antal fält (t.ex. 25 fält) med hjälp av 20x-målsättning.
- Analys av batch-bild
- Utför bildanalys med bildanalysprogramvara 1, med hjälp av neurite outgrowth-mallen.
- Öppna programvaran. Välj "Data" alternativet och bläddra till mappen bildåtergivningsdata, klicka på ok för att läsa in data som ska analyseras. Klicka på öppna och från den övre menyraden, välj protokoll och på programmenyn välj neurit utväxt. Gå till "algoritmer" och använd "488" kanalen för att definiera kärnan, cellkroppen och neuriten. Justera tröskelvärdet parametrar för varje.
- Välj de brunnar som ska användas för bildanalys. På botten högerklicka länk och välj funktioner som ska analyseras såsom cellantal genomsnitt, totalt skelett längd totalt. Fortsätt med "pre-analysera" följt av "förhandsgranska".
- Kontrollera om förhandsgranskningsinställningarna är godtagbara och starta analysen i batchläget. Resultaten är tillgängliga i den överordnade mappen under "rapporter" .csv ett filformat som kan öppnas i excel.
OBS: Bildanalysskript finns tillgängligt på begäran. - Rita genomsnittliga neuritlängd erhålls genom total neurit längd normaliseras till cellnummer.
5. Automatiserad differentiering av hiPSC till midbrain dopaminerga (mDA) nervceller
- Manuell hiPSC-förberedelse
- Dissociate 70\u201280% confluent hiPSC i enstaka celler med hjälp av enkelcellsupplösningsreagensen. Kortfattat, inkubera celler med enkelcellsdesociationsreagens (100 μL/cm2) i 30 min vid 37 °C, samlar in cellupphängning i ett koniskt rör, centrifug vid 200 x g i 5 min och återanvänd cellpellet i iPSC-odlingsmedium.
- Frö 200 000 celler/cm2 på extracellulära matrisbelagda 1-brunnsplattor och iPSC-odlingsmedium kompletterat med 10 μM Y-27632. Odlingsceller över natten vid 37 °C och 5 % CO2.
- Automatiserad differentiering: Fas 1
- Förbered det automatiserade kultursystemet enligt beskrivningen i steg 1.1\u20121.2.
- Ladda odlingsplattor som innehåller celler i CO 2-inkubatorn för det automatiserade odlingssystemet (se steg 1.5).
- Förbered KSR-medium (se Tabell över material) och komplettera med små molekyler (se tabell 2) som krävs för startdag 0 av differentiering. Använd endast nyberedda medier med små molekyler och tillväxtfaktorer.
- Utför mediebyten av odlingsplåtarna enligt beskrivningen i steg 2.3 på dag 0 och 1 av differentiering och sedan varannan dag fram till dag 25.
- Från dag 5, skift media formulering gradvis enligt beskrivningen i detalj i tabell 3.
- På dag 11, lägg till MDA neuron differentiering medium kompletteras med CHIR (fram till dag 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 och DAPT (se tabellen över material).
- På dag 25, lasta av plattor (se steg 1.6.)
- Manuell omplatning 1
- Dissociate dag 25 mDA prekursorer i enstaka celler med hjälp av den enda cellen dissociation reagens. Kortfattat, inkubera celler med enkelcellsdesociationsreagens (100 μL/cm2) i 40 min vid 37 °C, samla in cellfjädring i ett koniskt rör, centrifug vid 200 x g i 5 min och återanvändcellspellets i mDA neuron differentiering medium.
- Frö 400 000 celler/cm2 i 1-brunnsodlingsplattor förbelagda med 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL laminin och 2 μg/mL fibronectin i mDA neuron differentieringsmedium kompletterat med 10 μM Y-27632 (till dag 26) och små molekyler och tillväxtfaktorer som beskrivs i tabell 2. Odlingsceller över natten vid 37 °C och 5 % CO2.
- Automatiserad differentiering: Fas 2
- Ladda odlingsplattor som innehåller mDA-nervceller i CO 2-inkubatorn för det automatiserade odlingssystemet enligt beskrivningen i steg 1.5
- Förbered mDA neuron differentieringsmedium (se Tabell över material) och komplettera med små molekyler och tillväxtfaktorer som krävs för den slutliga differentiering från dag 26 och framåt (se tabell 2).
- Utföra mediebyten av odlingsplattor enligt beskrivningen i steg 2.3 dag 26 av differentiering och sedan var 3\u20124 dagar fram till dag 65.
OBS: För hög-genomströmning bildframställning ändamål, rekommenderas att replate mDA nervceller i 96-brunn plattor vid låg densitet på dag 32 av differentiering, som beskrivs i steg 5.5.
- Manuell omplatning 2
- Lossa kulturplåtar enligt beskrivningen i steg 1.6. Dissociate dag 32 mDA nervceller i enstaka celler som beskrivs i steg 5.3.1.
- Frö 100 000 celler/cm2 i 96-brunnsplattor föröverdragna med 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL laminin och 2 μg/mL fibronectin i mDA neuron differentieringsmedium kompletterat med 10 μM Y-27632 (tills dag 33) och småmolekylar och tillväxtfaktorer (se tabell 2). Odlingsceller över natten vid 37 °C och 5 % CO2.
- På dag 33, ersätta medium med nyberedda DA nervceller differentiering medium kompletteras med små molekyler och tillväxtfaktorer (utan Y-27632). Byt medium manuellt var 3\u20124 dagar fram till dag 65.
6. Immunfärgning, automatiserad bildförvärv och analys med hög genomströmning
-
Fluorescens färgning
- Utför fluorescerande immunfärgning enligt beskrivningen i Tilläggsfilen 1: steg 4.
- Bildceller enligt beskrivningen i Tilläggsfilen 1: steg 1.2.
- Ladda upp bildfiler som genereras av bildsystemet till bildanalysprogramvaran 2 (se Table of Materials) för ytterligare bildanalys, enligt beskrivningen i steg 6.2.
-
Bildanalys med hjälp av bildanalysprogramvaran 2
- När bildfiler laddas upp i bildanalysprogram 2, gå till "bildanalys" -funktionen och bygga analysalgoritmen genom att använda rullgardinsmenyn.
- Välj kärnor med hjälp av uppgiften "hitta kärnor", som upptäcker regioner på bilden som tillhör cellkärnor (här färgas med Hoechst). Uteslut kärnor från döda celler (pyknotiska kärnor) genom att fastställa en tröskel för kärnområde eller diameter.
- Markera cellcytoplasmet med hjälp av uppgiften "hitta cytoplasman". Denna uppgift upptäcker regioner runt atomkärnor som tillhör cell cytoplasman. Inkludera endast välsegmenterade celler. Uteslut mitotiska, apoptotiska och dåligt segmenterade celler. Ta bort celler som rör vid bildens kant.
- Lägg till aktiviteterna "beräkna morfologiegenskaper" och "beräkna intensitetsegenskaper". Morfologi parametrarna inkluderar beräkningen av morfologi egenskaper såsom område för en region av intresse. Intensitetsparametrarna inkluderar beräkningen av intensitetsegenskaper som medelintensitet för en region av intresse (t.ex. neurons cytoplasma).
- Välj en delpopulation (t.ex., TH positiva nervceller) av insatspopulationen (alla cytoplasmor som valts) med hjälp av ett eller flera villkor, morfologi och/eller intensitet.
OBS: Vanligtvis väljs intensitet för nervceller. Baserat på negativa kontroller, är det möjligt att definiera över vilken tröskel av intensitet nervcellerna anses vara positiva för TH. - Definiera utdataresultaten. Detta är den sista byggstenen i varje analys. Den definierar de assay avläsningsvärden för varje brunn av en kulturplatta (resultat per brunn).
- Kör batchanalysen och exportera resultaten. Normalisera antalet positiva celler till det totala antalet atomkärnor och representera data som procentandel positiva celler.
7. Kvantitativ realtids-polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR)
- Utför protokollet qRT-PCR enligt beskrivningen i tilläggsfilen 1: steg 3.
Representative Results
Vår automatiserade cell kultur och bildsystem var utformad för att minimera mänsklig intervention tillåter oss att standardisera odling av hiPSC och differentiering till olika celltyper såsom när eller mellanhjärnan dopaminerga (mDA) nervceller. En schematisk översikt över vårt automatiserade cellkultursystem med integrerade bildenheter avbildas i figur 1. Den inledande introduktionen av cellkulturer till detta automatiserade cellodlingssystem kan antingen göras genom att automatiskt så celler från ett 50 mL-rör eller genom att använda metoden "Loading Of Culture Plates" eller "Loading Of Assay Plates" för import av odlings- eller analysplattor. En central komponent i vårt system är den vätskehanteringsstation där alla vätskeöverföringssteg som mediebyten eller subcultivationer utförs. Vätskehanterarens specialtillverkade däcklayout representeras i figur 2. Vätskehanteringsstationen är utrustad med fyra lägen. Upp till fyra plattor kan överföras från inkubatorn till däcket, vilket möjliggör parallella mediebyten. Eftersom i subcultivationsmetoden, både föräldra- och dotterkultursplåtarna måste rymmas på däck, begränsas det maximala antalet kulturplattor som bearbetas parallellt till två. En viktig egenskap hos vätskehanteringsstationen är möjligheten att luta plattorna vid mediabyte för fullständigt borttagande av cellodlingssuptant. Även vätskehanteringsstationen är utrustad med shakers för att gynna enzymatisk dissociation av celler under utförandet av subcultivation-protokollet. Vårt automatiserade odlingssystem är också utrustat med två bildsystem: en ljusfältsbildande cytometer för att utföra cellräknings- och sammanflödeskontroller och därför övervaka celltillväxten över tiden, och ett dubbelt snurrande diskkonfokalmikroskop för snabb, hög halt och högupplöst avbildning av celler.
HiPSC-kulturerna övervakas dagligen för tillväxt vid den brightfield imaging cytometern och analyseras för procent av konfluency. Brightfieldbilden i den vänstra panelen och i den högra panelen en grön mask från analysen av brightfieldbilden som erhålls med cytometern (Bild 3A). En homogen hiPSC-tillväxt observeras under tiden, vilket framgår av sammanflödetsprocenten på två hiPSC-linjer (n = 4 plattor) som odlas parallellt och utsätts för konfluencykontroller från dag 1 till dag 6 (Figur 3B). När du når den inställda tröskeln, är hiPSC passaged. Cellinjerna odlades manuellt (m) eller av automations (a) systemet och observerades för underhåll av typiska stamceller morfologi för minst två passager, representativa brightfield bilder (Figur 4A). Den hiPSC odlade manuellt (visas inte) eller i det automatiserade systemet uppvisade den typiska stamcellsmarkören OCT4 (röd) och SSEA4 (grön), som visas i immunofluorescensanalysen (figur 4B). Uttrycket av pluripotensmarkörerna OCT4, NANOG och REX1 bedömdes också på mRNA-nivå av qRT-PCR (Figur 4C). Relativa kvantifieringar utfördes med prover som samlats in från en cellinje som odlats manuellt (m) och i det automatiserade odlingssystemet (a) i dubbletter (replikat 1 och 2). Uttrycksnivåerna för alla tre pluripotensmarkörer i replikaten som odlas i det automatiserade odlingssystemet liknar marköruttryck efter manuell kultur. Dag 8 (D8), var uttrycket av pluripotency markörer frånvarande i när nervceller differentierade (Diff) från hiPSC.
En viktig tillämpning av det automatiserade kultursystemet är differentieringen av hiPSC i olika celltyper inklusive nervceller. Här visar vi differentiering av hiPSC i nervceller med hjälp av NGN2 strategi, som producerar en ren när neuron kultur på mycket kort tid (cirka 6 dagar). Nervceller differentierade i det automatiserade odlingssystemet (a) presenterade liknande morfologi och neuronal nätverksorganisation som de nervceller odlas manuellt (m) (Figur 5A). Automatiserade differentierade när nervceller var positiva för TUBB3 (neuron-specifika klass III β-tubulin, röd) och BRN2 (övre när skikt markör, grön) (Figur 5B), jämförbar med manuellt differentierade nervceller (data visas inte). Uttrycket av neuronala markörer inklusive mikrotubuli-associerade protein 2 (MAP2), den neurala cellen adhesionsmolekylen (NCAM1) och Synapsin-1 (SYN1), samt den kortikala neuron markörer BRN2 och CUX1 (övre när skikt) berikades i nervceller på dag 8 (D8) av differentiering (Figur 5C). Mycket låg eller inget uttryck för dessa markörer observerades i hiPSC. Relativa kvantifieringar utfördes med prover som samlats in från en cellinje som odlats manuellt (m) och i det automatiserade odlingssystemet (a) i dubbletter (replikat 1 och 2). Uttrycksnivåerna i replikat visar liknande variationer mellan manuellt och automatiserade differentieringar.
Den integrerade bildförmågan hos det automatiserade kultursystemet möjliggör handsfree-datainsamling för kulturhälsan och möjliggör på så sätt långsiktigt automatiserat förvärv av fenotypiska avläsningar. Använda NGN2 tillvägagångssättet till en liten molekyl härledda neurala föregångare (smNPC) linje transduced med GFP lentivirus, etablerade vi en levande-cell automatiserad neurit utväxt assay där neurit längd mättes över 11 dagar av differentiering utan någon manuell intervention. Den neurit komplexitet ökade med tiden, vilket framgår av det område som upptas med neuriter på dag 1, 3 och 11, GFP uttryck och maskerade bilder från analys (Figur 6A, B). Ökningen av neuritlängden från dag 1 till 11 av differentiering kvantifierades och visade en liknande utveckling över olika brunnar. För enkelhetens skull, data från endast 3 kolumner med 6 brunnar vardera från en 96-väl platta avbildas i den representativa grafen även om alla inre 60 brunnar analyserades (Figur 6C).
En annan tillämpning av det automatiserade kultursystemet som visas här är differentiering av hiPSC i mDA nervceller. Differentieringen baseras på medieförändringar efter ett i förväg etablerat protokoll och utfördes på det automatiserade kultursystemet från dag 0 till 65. Automatiserade medieförändringar orsakade inte cellavlossning eller några andra visuellt detekterbara förändringar i differentieringen. I slutet av differentiering, dag 65, mDA nervceller visar cellulär organisation och morfologi (sfäriska soma, långa och spiny dendrites) jämförbar med manuell differentiering (Figur 7A, B). På mRNA-nivå, mDA nervceller differentierade i det automatiserade kultursystemet visar uttrycket av neuronala och mDA markörer, MAP2 och TH (tyrosin hydroxylas), respektive (Figur 7C). Båda differentieringar genererade betydande mängder TH och MAP2 positiva nervceller (Figur 7D).
Figur 1: Schematisk översikt över den automatiserade cellodlings- och bildplattformen.
Systemet utformades med ett polykarbonathus och två HEPA-kåpor (A och B) utrustade med fyra UV-lampor som säkerställer en steril miljö för cellkulturapplikationer. Cellkulturplattorna lastas på hyllor framför robotarmen som kan nås via ytterdörren (C). Plattorna lastas i CO 2-inkubatorn (D) med en kapacitet på 456 plattor. En cellcytmeter i Brightfield (E) används för konfluencykontroller och cellräkning under subcultivation-rutiner. Vätskehanteringsstationen ligger under en av HEPA-kåporna (B). Däckslayouten för vätskehanteraren beskrivs i figur 2. Vätskehanteringsstationens pipetterarm bär ett 96-kanals pipettinghuvud, åtta 1 mL-pipetteringskanaler och fyra 5 mL-pipetteringskanaler. När det gäller de 1 mL-pipetteringskanalerna kan spetsar eller nålar användas för vätskeöverföringar. För screeningändamål kan celler som är seedade i analysplattor behandlas med prover som förvaras vid -20 °C i det automatiserade -20 °C-lagringssystemet (F) efter upptining av dessa prover i en andra inkubator (G). Hög genomströmning imaging utförs i den automatiserade confocal mikroskop (H) erbjuder sig att skaffa bilder i confocal läge med hjälp av två snurrande skivor eller i epifluorescens läge. En levande-cell kammare integreras i mikroskopet gör att utföra långsiktiga bildbehandling av odlade celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Kortleksupplägget för vätskehanteringsstationen.
Tipspositioner indikeras med "50 μL" för 50 μL-spetsar, med "standard" för 300 μL-spetsar, genom "hög" för 1 mL-spetsar och med "5 mL" för 5 mL-spetsar. Däckskomponenter: (A) Fyra uppvärmda skakningars positioner (maxhastighet: 2500 rpm) som kan användas för valfri odlingsplatta eller analysplåtsformat. Skaklägena är utrustade med klämbara gripdon som också används för plåtinriktning efter transporter till däck. Vidare fungerar skaklägena som ett lockparkeringsläge för plattor vid vätskeöverföringssteg. För representativa ändamål, alla shaker positioner är upptagna av 96 väl assay plattor. (B) Fyra lutningsmoduler för bearbetning av fyra plattor av valfritt format samtidigt placeras på ovansidan. Den lägsta positionen markerar avfallsuppsamlingskammaren för odlings- och analysplattor och 96-kanals pipetteringshuvudet. För representativa ändamål är alla tiltmoduler upptagna av 96-brunnsanalysplattor. (C) På översta positionen är 384-brunnsplattan för cellräkning placerad. Nedan finns två lägen för plattor som upptas av 96-brunnsplåtar för representativa ändamål och ett rack för fyra 50 mL och fyra 15 mL-rör. Den lägsta positionen är upptagen av 5 mL-spetsar. (D) Tre medielinjer med positioner för mediereservoarer. Medialedningarna har vätskenivåsensorer som gör det möjligt att automatiskt fylla mediareservoaren med upp till 250 mL media. (E) Två flytande avfallsmoduler med aktivt avlopp baseras på toppen, under en temperaturkontrollerad modul med en position för en behållare (vit) och ett 5 mL-spetsställ finns. (F) Fem lägen för 1 mL-spetsar. (G) Två temperaturstyrda moduler är placerade längst ned och en position för parkering av ett av sina lock på ovansidan. (H) Positioner för två 50 μL kapslade spetsställ (NTR) i överdelen följt av två positioner för enkanaliga och 96-kanaliga upphämtningar av 300 μL-spetsar och ett 5 mL-spetsställ i botten. (I) En staplare för 384-brunnsräkningsplattor upptill följt av tre 300 μL NTR och ett 5 mL-spetsställ i botten. (J) Förvarings- och tvättstation för tre uppsättningar av åtta återanvändbara metall 1 mL-nålar. (K) Avfallsläge för 1 mL och 5 mL-pipettkanaler och tomma NTR (grå) samt ett gripblock för 1 och 5 mL-kanaler (vita) som används för transportsteg på däck. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Automatiserad konfluencykontroll av hiPSC.
(A) Representativa brightfield (BF) bilder av hiPSC som tagits av cellcytometern (vänster) och efter automatiserad konfluencyanalys (höger) som anger det proportionella område som upptas av celler i grönt; (B) Confluency procentsatser som registrerats från två hiPSC-linjer (iPS #1 och #2) från dag 1 till 6 av kultur, n = 4 1-brunnsplattor per cellinje. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Passaging av hiPSC.
(A) BF bild av en hiPSC linje odlas manuellt (vänster) och med hjälp av den automatiserade kultursystem (höger). Bilder togs 6 dagar efter den andra passaging; (B) Representativa bilder av hiPSC färgas för pluripotency markörerna OCT4 och SSEA4, och motverkas med Hoechst 33342 (Kärnor); (C) Resultat av qRT-PCR för pluripotensmarkörerna OCT4, NANOG och REX1 i en hiPSC-linje som odlas i dubbletter (1 och 2) manuellt (m) och i det automatiserade odlingssystemet (a), och respektive hiPSC-härledda kortikala nervceller (Diff) vid dag 8 (D8) av differentiering. Data representeras som den relativa kvantiteten (RQ) med iPS_a_1 som referensprov. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD) från 3 tekniska replikat av qRT-PCR-reaktion. GAPDH, RPL13A1 och RPLPO användes som hushållning gener. Skala bar: 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Human iPSC-härledda kortikala nervceller.
(A) Brightfield bilder av dag 6, manuellt (m) och automatiserad (a) differentierade kortikala nervceller visar liknande neuronala nätverk; (B) Representativa bilder av celler som färgats för TUBB3 (pan neuronal), BRN2 (kortikala nervceller) och Hoechst 33342 (kärnor) på dag 8 av differentiering; (C) Resultat av qRT-PCR för markörgener av när nervceller (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 och SYN1) berikade i dag 8 (D8) av differentiering. Data representeras som den relativa kvantiteten (RQ) med iPS_a_1 som referensprov. Felstaplar representerar SD från 3 tekniska replikat av qRT-PCR-reaktionen. GAPDH, RPL13A1 och RPLPO användes som hushållning gener. Skala bar: 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: En analys med hög genomströmning för neuritutväxt.
(A) Representativa bilder av GFP uttrycker celler på dag 1, 3 och 11 av differentiering; (B) Representativa binära bilder av neuriter på dag 1, 3 och 11 av differentiering. Neurit utväxt kvantifierades med hjälp av hög innehållsbilden analysprogramvara 1 och representeras som neuritlängd; (B) Grafiken visar ökningen av neuritlängd i NPC-härledda NGN2 nervceller och bildandet av ett tätt nätverk. Tre 96-brunnsplattor med celler i de inre 60 brunnarna avbildas. För enkelhetens skull visas endast tre kolumner med brunnar per 96-brunnsplatta som ett exempel med n = 6 brunnar per kolumn. Ett genomsnitt av 1308 celler analyserades per brunn. Felstaplar representerar medelvärdets standardfel (S.E.M.). Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Human iPSC-härledda mDA nervceller.
Midbrain DA nervceller differentierade manuellt (m) och i det automatiserade (a) kultursystemet. (A, B) Representativa fluorescerande bilder av mDA nervceller färgas för tyrosin hydroxylas (TH, mDA neuron markör; grön), MAP2 (neuronal markör; röd) och Hoechst 33342 (kärnor; blå); (C) Representativa qRT-PCR resultat för markör gener av mDA nervceller differentieras manuellt och i det automatiserade kultursystemet. TH och MAP2 uttrycksnivåer representeras som relativt antal (RQ) normaliseras till hushållning gener (OAZ1 och GAPDH); (D) Procentsatser av TH och MAP2 positiva nervceller som genereras av manuell och automatiserad differentiering. Felstaplar representerar SD för två oberoende differentieringar som utförs med två distinkta iPSC-rader (#1 och #2). Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Celltyp | Syfte | Protokoll steg | Celltäthet | Plattans format | Cellnummer/brunn |
| NGN2 differentiering | |||||
| Ipsc | NGN2 stabil linjegenerering | S.2.3. | 30 000 celler/cm2 | 12-brunn | 1,17,000 |
| Ipsc | NGN2 neuron differentiering | 3.1.3. | 30 000 celler/cm2 | 1-brunn | 25,20,000 |
| Ipsc | NGN2 neuron differentiering | 3.1.3. | 30 000 celler/cm2 | 96-brunn | 9,600 |
| smNPC generation | |||||
| smNPC | Omplatning dag 12 och 16 | S5.9. och S5.11. | 70 000 celler/cm2 | 6-brunn | 6,72,000 |
| smNPC | Omplatning från passage 5 | 5.11. | 50 000 celler/cm2 | 6-brunn | 4,80,000 |
| smNPC | smNPC till NGN2 nervceller | 3.2.2 | 50 000 celler/cm2 | 96-brunn | 16,000 |
| mDA differentiering | |||||
| Ipsc | mDA neuron differentiering | 4.1.2. | 200 000 celler/cm2 | 1-brunn | 1,68,00,000 |
| DA nervceller | Dag 25 omplatning | 4.3.2. | 400 000 celler/cm2 | 1-brunn | 3,36,00,000 |
| DA nervceller | Dag 25 omplatning | 4.5.2. | 100 000 celler/cm2 | 96-brunn | 32,000 |
| Beläggning | Syfte | Protokoll steg | Koncentration/ Utspädning |
Plattans format | Uppgifter om beläggning |
| iPS-kultur | |||||
| Extracellulär matris | iPSC, NGN2-linjen, mDA nervceller |
1.5.7. och S2.3. | 1 alikvot*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-/12-brunn | 8/0,5 mL/brunn; 1 h på RT |
| NGN2 differentiering | |||||
| Poly-L-Ornitin | NGN2 neuron differentiering | 3.1.3. och 3.2.2. | 0,1 mg/mL, Pbs | 1-/96-brunn | 8/0,1 mL/brunn; 12 h vid 37°C; 3x PBS-tvätt |
| Laminin | NGN2 neuron differentiering | 3.1.3. och 3.2.2. | 5 μg/mL, Pbs | 1-/96-brunn | 8/0,1 mL/brunn; 4 h vid 37°C |
| smNPC generation | |||||
| Extracellulär matris | smNPC generation och kultur | S5.6., S5.9., S5.11. |
1 alikvot*; 25 mL DMEM/F-12 |
6-brunn | 1 mL; 2 h på RT |
| mDA differentiering | |||||
| Extracellulär matris | mDA differentiering | 4.1.2. | 1 alikvot*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-brunn | 12 mL; 12 h vid 37°C |
| Poly-L-Ornitin | mDA differentiering | 4.3.2. och 4.5.2. | 0,1 mg/mL, Pbs | 1-/96-brunn | 12/0,1 mL/brunn; 12 h vid 37°C; 3x PBS-tvätt |
| Laminin | mDA differentiering | 4.3.2. och 4.5.2. | 10 μg/mL, Pbs | 1-/96-brunn | 12/0,1 mL/brunn; 12 h vid 37°C |
| Fibronectin | mDA differentiering | 4.3.2. och 4.5.2. | 2 μg/mL, Pbs | 1-/96-brunn | 12/0,1 mL/brunn; 12 h vid 37°C |
| *En alikvot för extracellulär matris definieras som den utspädningsfaktor (i μL) som förekommer i Analyscertifikatet av denna produkt. | |||||
Tabell 1: Sådd celltäthet respektive beläggning till plattans format.
| Dag | Reagens | ||
| Dag 0 - 1 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 | ||
| Dag 1 - 3 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b |
||
| Dag 3 - 5 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| Dag 5 - 7 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| Dag 7 - 9 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dag 9 - 11 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dag 11 - 13 | 3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-askorbinsyra (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
| Dag 13 - 65 | 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-askorbinsyra (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
Tabell 2: Liten molekyl addition för dopaminerga neuron differentiering.
| Dag | KSR medel | N2 medel | Differentieringsmedium |
| Dag 0 - 1 | 100% | 0 | 0 |
| Dag 1 - 3 | 100% | 0 | 0 |
| Dag 3 - 5 | 100% | 0 | 0 |
| Dag 5 - 7 | 75% | 25% | 0 |
| Dag 7 - 9 | 50% | 50% | 0 |
| Dag 9 - 11 | 25% | 75% | 0 |
| Dag 11 - 13 | 0 | 0 | 100% |
| Dag 13 - 65 | 0 | 0 | 100% |
Tabell 3: Mediagradient för dopaminerg neuron differentiering.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Vi introducerar ett automatiserat cellkultursystem med integrerad bildframställning kapacitet för standardisering av hiPSC kultur och neuronal differentiering. På grund av minimala användaren ingripande, experimentell variation är låg säkerställa reproducerbarhet av cellulära fenotyper under differentiering. Den kalenderbaserade schemaläggaren stöder organisering och parallellisering av experiment och tillåter en hög grad av flexibilitet vid vilken tidpunkt experimenten utförs. Befintliga metoder kan enkelt anpassas och spektrumet av tillgängliga metoder kan ökas. Dessutom kan ett stort antal assay plate format användas lägga till flexibiliteten i detta system. Det minimala systemet som består av en CO 2-inkubator, en robotarm, en cellcytmeter i brightfield och en vätskehanteringsstation utgör den grundläggande enhet som behövs för hiPSC-kultur och differentiering, med överkomliga kostnader för akademiska forskningslaboratorier. Kombinationen av det automatiserade cellodlingssystemet med ett automatiserat -20 °C-lagringssystem för lagring av föreningar, RNAi-bibliotek eller CRISPR/Cas9-bibliotek, och integrering av ett mikroskop med hög innehåll/hög genomströmning möjliggör utförande av fenotypiska screenings.
I den aktuella studien använde det automatiserade cellodlingssystemet engångstips och odlingsmedierna återfylldes manuellt i reservoaren, vilket begränsar användningen av vätskehanteringsstationen för medieförändringar och andra odlingsprocesser speciellt över en natt. För att kringgå denna begränsning kan metoderna justeras till nålanvändning istället för engångsspetsar och, efter installation av röranslutningar mellan medielinjer och mediapåsar som lagras i ett kylskåp, kan mediareservoarer automatiskt fyllas på med färska medier förvärmda av värmeelement. Detta skulle minska användarnas störningar som orsakas av manuell påfyllning av tips, kulturmedia och reservoarutbyten.
Vårt automatiserade cellodlingssystem ger flera fördelar. En är streckkodsspårningssystemet. Plattorna lastas i systemet identifieras genom en unik streckkod som läses och sparas av systemet tillåter spårning av prover under och efter metodkörning. En annan fördel är möjligheten att skapa användarspecifika projekt. Här kan kulturplattor som laddas i systemet tilldelas till ett visst projekt och grupperas i batchar. Struktureringen i omgångar förenklar utförandet av samma procedur till alla plattor av en viss sats eftersom inga enskilda plattor behöver väljas. Dessutom tillåter en flytande klass redaktör att justera pipetting hastighet och höjd samt aspiration och dispensering parametrar för varje flytande överföring steg. Varje process dokumenteras i loggfiler gör det möjligt att spåra vilka uppgifter som har utförts för en viss kultur eller analysplåt.
Nervceller och andra celltyper som härrör från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) är användbara in vitro-verktyg för att studera mekanismerna för neurodegenerativa sjukdomar i specifika patientpopulationer (t.ex. dopaminerga nervceller för Parkinsons sjukdom) som erbjuder möjlighet till personliga läkemedelsscreening. Culturing hiPSC är mycket tidsintensiv och kräver utbildade människor att utföra komplexa differentieringsprotokoll, vanligtvis begränsad till låg skala produktion. Vi anpassade den matarfria kulturen av hiPSC till en automatiserad kultur och genomfört två neuronal differentiering protokoll, en snabb när nervceller differentiering protokoll baserat på NGN2 över-uttryck under en tet-onpromotorn 10,11, och en långsiktig liten molekyl-baserade protokoll för generering av midbrainergic dopamin (mDA) nervceller13. Den enkla överföringen och reproducerbarheten av manuell kultur och differentieringsprotokoll gör det automatiserade kultursystemet mycket användbart. Mänskliga iPSC odlade i det automatiserade cellen kultur systemet visade konsekvent stamcell morfologi och uttryckte viktiga pluripotency markörer, reproducerbara mellan oberoende experiment. Dessutom gynnade automatiseringen av hiPSC-kulturprotokollet kulturen och expansionen av ett större antal cellinjer parallellt. Automatiserade konfluencykontroller som planeras utföras över natten sparad tid som lämnar systemet fritt under dagen för nedströms processsteg som utfördes när användaren var i laboratoriet (t.ex. skörd av celler eller manuell omplatning för differentiering). På att nå den användardefinierade sammanflödet tröskeln, celler är passaged och replated i extracellulära matris-belagda plattor som finns på staplaren av automatiserade cellodling systemet. Varje passagerunda tar ca 70 min och genererar fyra 1-brunns plattor från en förälder platta, vilket översätts till en kapacitet på 20 passager på en dag.
Automatiseringen av NGN2 differentiering protokollet gjordes framgångsrikt och tillåts generering av en homogen population av neuronala celler över olika passager och jämförbar med manuella differentieringar. Dessutom skulle de experimentella kostnaderna för storskaliga screeningstudier med flera cellinjer eller screeningexperiment med tusentals testförhållanden/föreningar minska på grund av snabba differentieringar. Kostnadseffektiva och hög-genomströmning avläsningar inklusive live-cell neurit utväxt mätningar kan enkelt utvecklas, genomföras och användas som fenotypiska avläsningar för sjukdom modellering, som visas tidigare14,15,16. Således anpassade vi ytterligare NGN2-protokollet med hjälp av små molekyl härledda neurala föregångare (smNPC) celler som utgördativt över-express GFP. SmNPC-cellerna ger ytterligare fördelar, inklusive minskade kostnader med odlingsmedier (en tredjedel av kostnaden med iPSC-kulturen) och tid som krävs för att skala upp experiment. Cellen avkastning från smNPC är 7 till 10 gånger högre än den som erhålls med iPSC. De differentierande nervcellerna övervakades framgångsrikt och avbildades i flera dagar med hjälp av en helt automatiserad bildbehandlingsprocess utan behov av manuella antikroppsfärgningar eller kemisk märkning, vilket sparar kostnader och tid som krävs för manuella procedurer, inklusive avbildning av sig själv. Den nuvarande avbildningen av inre 60 brunnar av en 96-brunnsplatta tar cirka 16 min per platta när 25 fält per brunn avbildas, vilket innebär att data för en bildbehandling-baserad screening för 1000 föreningar, skulle kunna förvärvas och analyseras på en dag. I framtiden kan denna avläsning användas i sammansatta screeningstudier för räddning av neuritutväxtdefekter.
Vidare visar vi också överföring av en manuell differentiering protokoll för att generera midbrain dopaminergic (mDA) nervceller från iPSC. Denna lilla molekyl-baserade differentiering protokoll tar 65 dagar och är arbetsintensiva på grund av de flera replating steg och täta förändringar media, mestadels var 2 dagar, vilket begränsar produktionen av mDA nervceller till några iPSC linjer samtidigt. Den automatiserade mDA differentiering protokollet har den stora fördelen att skala upp differentiering till dussintals iPSC linjer. Upp till kunde 30 cellinjer göras åtskillnad mellan parallellt. Eftersom differentieringen till största delen baseras på medieförändringar, kan nästan hela differentieringsprocessen genomföras utan mänsklig inblandning. Med hjälp av den kalenderbaserade schemaläggaren av det automatiserade systemet skulle vi kunna planera medieändringarna enligt differentieringsstegen. En begränsning av att arbeta med ett så stort antal cellinjer och kulturplattor var omöjligheten att utföra över natten medieförändringar. Den främsta orsaken är det faktum att vårt system är inrättat för att använda disponibel tips och manuell påfyllning av kultur media kräver en användare i laboratoriet för att utföra denna manuella steg. För att underlätta media förändringsprocessen, var plattor lastas i systemet tilldelats ett projekt och grupperade i omgångar. Satsstorleken anpassades sedan till antalet disponibla tips och volym av odlingsmedia som fanns tillgängliga. Som diskuterats ovan, kan denna begränsning enkelt övervinnas genom genomförandet av återanvändbara / tvättbara nålar och automatiserad påfyllning av media. Automatiserad passaging / omplatning av celler, som visas för iPSC, är en av de bekvämligheter som erbjuds av vårt automatiserade cellodlingssystem. Vi har testat den automatiserade omplatning av mDA nervceller på dag 25 av differentiering. Dissociation av mDA nervceller kräver dock längre (40 min) inkubation med dissociation enzymet än iPSC (8 min) utvidga automatiserade replating processen till mer än 1 h per cellinjer. Som en följd blev den automatiserade omplatningen av 30 cellinjer samma dag omöjlig. Påskynda andra steg under automatiserad omplatning (transport av plattor, pipettering) och anpassa systemet till användning av nålar och media linje som gör en övernattning arbete möjligt skulle lösa denna begränsning. Trots nackdelarna, vi kunde framgångsrikt överföra det manuella protokollet till en automatiserad differentiering av mDA nervceller producera kulturer med betydande mängder AV MAP2 (neuron) och TH (mDA nervceller) positiva celler.
Att differentiera dussintals iPSC-cellinjer parallellt är av stort intresse i projekt som undersöker de molekylära mekanismerna för neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom. Men att slutföra uppgifter snabbare med färre fel och till minskade kostnader är dock en stor utmaning. På grund av automatiseringen av de protokoll som presenteras här (iPSC, smNPC och mDA neuron), kunde vi påskynda, minska kostnaderna och öka reproducerbarheten i våra projekt. Utvecklingen av projekt som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) som omfattar hundratals patient cellinjer visar behov av automatiserad kultur och differentiering protokoll. Våra framtida perspektiv inkluderar överföring av manuell 3 dimensionella (3D) cellkultur modeller till det automatiserade systemet. Mindre anpassningar i inställningarna för plattdefinition och användning av adaptrar kommer att möjliggöra användning av kommersiella eller specialtillverkade plattor och mikrofluidiska kammare som krävs för 3D-kulturerna. Dessutom kommer genomförandet av en automatiserad etikettfri bildmodell gör det möjligt för oss att spåra den neuronala tillväxten i realtid och översätta förändringar i neuritutväxt, neuron organisation och celldöd till bättre förståelse av sjukdomen mekanismer.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt de patienter och deras familjer som bidragit biomaterial för denna studie. Celler linjer som används i studien var från NINDS samling med Rutgers (ND41865 som iPS # 1) och labbet av Dr Tilo Kunath (iPS # 2). Detta arbete stöds delvis av NOMIS-stiftelsen (PH), RiMod-FTD, ett EU-gemensamt program - Neurodegenerativ sjukdomsforskning (JPND) (PH); DZNE I2A-initiativet (AD); PD-Strat, ett ERA-Net ERACoSysMed finansierat projekt (PH) och Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD är en del av Michael J. Fox Foundations PATH to PD-program. Författarna tackar Steven Finkbeiner och Melanie Cobb (Gladstone Institutes) för att bidra till inrättandet av den manuella mDA neuron differentiering protokoll och Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) för hjälp i neurite utväxt analys setup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
| iPSC pluripotency marker | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
| Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
| NGN2 neuron markers | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
| Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
| mDA neuron markers | |||
| Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
| Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
| Nuclei counterstaining | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
| Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
| Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
| Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
| Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
| Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
| Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
| HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
| Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
| Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
| Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
| QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
| Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
| Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
| Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
| VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
| Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
| 1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
| 12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
| 96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
| Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
| Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
| Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
| Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
| Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
| Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
| Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurons | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
| Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
| Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μg/mL |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| Culture media | |||
| iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
| NGN2 neurons - NGN2 medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
| Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurons - SRM medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurons - N2 medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurons - Differentiation medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
| Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
| Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| Dissociation reagents | |||
| Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA isolation and cDNA kit | |||
| RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
| Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
| Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
| CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
| CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
| Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
| Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
- Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
- Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647 (2015).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).
- Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
- Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252 (2013).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811 (2015).
- Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
- Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792 (2010).
