Summary
وتتوقف الاستجابات السلوكية الدفاعية على شدة التهديد وقربه، ومدى تعرضه للخطر. وبناء على هذه العوامل، قمنا بتطوير نموذج تكييف الكلاسيكية التي تثير التحولات واضحة بين تجميد مشروط وسلوك الطيران داخل المواضيع الفردية. هذا النموذج هو أمر بالغ الأهمية لفهم الأمراض التي تنطوي عليها في القلق, الذعر, واضطرابات ما بعد الصدمة.
Abstract
الخوف والسلوكيات المتعلقة بالقلق تساهم بشكل كبير في بقاء الكائن الحي. ومع ذلك، فإن الاستجابات الدفاعية المبالغ فيها للتهديد المتصور هي سمة من سمات اضطرابات القلق المختلفة، التي هي الشكل الأكثر انتشارا من الأمراض العقلية في الولايات المتحدة. إن اكتشاف الآليات العصبية البيولوجية المسؤولة عن السلوكيات الدفاعية سيساعد في تطوير التدخلات العلاجية الجديدة. بافلوفيان تكييف الخوف هو نموذج مختبر المستخدمة على نطاق واسع لدراسة التعلم المتعلقة بالخوف والذاكرة. أحد القيود الرئيسية على نماذج تكييف الخوف بافلوفية التقليدية هو أن التجميد هو السلوك الدفاعي الوحيد الذي تم رصده. لقد طورنا مؤخرًا نموذجًا معدلًا لتكييف الخوف من بافلوفيان يسمح لنا بدراسة كل من التجميد المشروط والهروب (المعروف أيضًا باسم الهروب) السلوك داخل الموضوعات الفردية. هذا النموذج يستخدم ارتفاع كثافة الاقدام وعدد أكبر من الاقترانات بين التحفيز المشروط والحوافز غير مشروط. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم هذا النموذج طيران مشروط العرض المسلسل من لهجة نقية والمحفزات السمعية الضوضاء البيضاء كما التحفيز مشروطة. بعد تكييف في هذا النموذج، الفئران يحمل تجميد السلوك استجابة لحافز لهجة، واستجابات الطيران خلال الضوضاء البيضاء. يمكن تطبيق هذا النموذج تكييف لدراسة التحولات السريعة والمرنة بين الاستجابات السلوكية اللازمة للبقاء على قيد الحياة.
Introduction
الخوف هو استجابة تكيفية تحفظ تطوريا لتهديد فوري1،2. في حين أن الكائنات الحية تمتلك استجابات دفاعية فطرية للتهديد ، فإن الجمعيات المستفادة حاسمة للحصول على استجابات دفاعية مناسبة للمحفزات التنبؤية للخطر3. Dysregulation في دوائر الدماغ السيطرة على الاستجابات الدفاعية من المرجح أن تسهم في ردود الفعل غير المهكة المرتبطة باضطرابات القلق المنهكة متعددة, مثل اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD), اضطراب الذعر4, والرهاب محددة5,6. معدل انتشار اضطرابات القلق في الولايات المتحدة هو 19.1٪ للبالغين و 31.9٪ في المراهقين7,8. وعبء هذه الأمراض مرتفع للغاية على الروتين اليومي للأفراد ويؤثر سلبا على نوعية حياتهم.
على مدى العقود العديدة الماضية، وقد خدم بافلوفيان تكييف الخوف كنظام نموذج قوي للحصول على نظرة هائلة في الآليات العصبية الكامنة في التعلم المتعلقة بالخوف والذاكرة9،10،11. تكييف الخوف بافلوفيان ينطوي على إقران التحفيز مشروطة (CS، مثل التحفيز السمعي) مع التحفيز غير مشروط (الولايات المتحدة؛ على سبيل المثال، هزة القدم الكهربائية)12. لأن التجميد هو السلوك المهيمن الذي أثار ويقاس في نماذج تكييف بافلوفيان القياسية ، فإن آليات التحكم العصبية لأشكال نشطة من السلوك الدفاعي مثل استجابات الهروب / الطيران لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. وتظهر الدراسات السابقة أن أشكال مختلفة من السلوك الدفاعي، مثل الطيران، يتم استحضارها اعتمادا على شدة التهديد، وقرب السياق13،14. دراسة كيفية الدماغ تسيطر على أنواع مختلفة من السلوك الدفاعي قد تسهم بشكل كبير في فهم العمليات العصبية التي يتم dysregulated في اضطرابات الخوف والقلق.
لمعالجة هذه الحاجة الملحة، وضعنا نموذج تكييف بافلوفيان المعدلة التي تثير الهروب والقفزات الهروب، بالإضافة إلى تجميد15. في هذا النموذج، يتم مكيفة الفئران مع التحفيز المركب التسلسلي (SCS) تتكون من لهجة نقية تليها الضوضاء البيضاء. بعد يومين من إقران SCS مع هزة قدم كهربائية قوية ، تظهر الفئران التجميد استجابة لعنصر النغمة والطيران أثناء الضوضاء البيضاء. إن التبديل السلوكي بين التجميد المشروط وسلوك الطيران سريع وثابت. ومن المثير للاهتمام أن الفئران تعرض سلوك الطيران فقط عندما يتم عرض الضوضاء البيضاء CS في نفس سياق هزة القدم التي تم تسليمها مسبقًا (سياق التكييف) ولكن ليس في سياق محايد. بدلا من ذلك ، تجميد الردود تهيمن في هذا السياق محايدة ، مع مستويات أكبر بكثير من تجميد استجابة للضوضاء البيضاء مقارنة مع لهجة. وهذا يتسق مع دور السياق في تعديل كثافة الاستجابة الدفاعية ومع الدور التنظيمي للمعلومات السياقية في التعلم والذاكرة المرتبطة بالخوف الموجودة في نماذج تكييف التهديدات التقليدية16،17. يسمح هذا النموذج لمقارنات مباشرة داخل الموضوع من السلوكيات الدفاعية متعددة بطريقة خاصة السياق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تنفيذ الخطوات والإجراءات التالية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بعد موافقة لجنة الرعاية والاستخدام الحيواني المؤسسية في جامعة تولين.
1. إعداد الفئران
- استخدام الفئران البالغة من الذكور و /أو الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أشهر. في هذه الدراسة، استخدمنا ذكور C57BL/6J الفئران التي تم الحصول عليها من مختبر جاكسون، ولكن يمكن استخدام أي سلالة الفئران من مورد السمعة.
- على الأقل أسبوع واحد قبل التجربة، منزل جميع الفئران بشكل فردي على 12:12 ساعة ضوء / دورة داكنة طوال الدراسة. توفير الفئران الإعلانية libitum الوصول إلى الغذاء والماء.
- إجراء جميع التجارب السلوكية خلال دورة الضوء. تنفيذ جميع الجلسات في نفس الوقت من اليوم ضمن مجموعة فردية. على سبيل المثال، إذا بدأت التجربة في الساعة 9 صباحًا في يوم 1، فتابع البدء في ذلك الوقت حتى تكتمل التجربة.
2- إعداد مواد دراسية
- سياقات الدراسة
- اختر سياقين مختلفين لإجراء التجارب.
- استخدام غرفة أسطوانية تتألف من Plexiglas واضحة (قطرها 30 سم) كما السياق A، مع أرضية Plexiglas على نحو سلس. يجب أن يكون ارتفاع الغرفة كافيا لمنع الهروب (على الأقل 30 سم).
- بالنسبة للسياق B استخدام العلبة مستطيلة (25 سم × 30 سم) مع أرضية الشبكة الكهربائية المستخدمة لتقديم بالتناوب هزات القدم الحالية. ارتفاع هذه الغرفة مهم جداً ويجب أن يكون على الأقل 35 سم. بدلا من ذلك، استخدم سقف شفاف (ضمان إمكانية تسجيل الفيديو من خلال هذه المواد).
ملاحظة: استخدم غرفة ذات أسطح حائط ناعمة يمكن تنظيفها بسهولة. - استخدم حل تنظيف مختلف لتنظيف السياقات. على سبيل المثال، سياق نظيف A مع حمض الخليك 1٪ والسياق B مع 70٪ الإيثانول. تنظيف السياقات قبل بدء الجلسة الأولى، بين اختبار الفئران الفردية، وبعد الانتهاء من جلسات اليوم. هذا أمر حيوي لإزالة الإشارات الشمية من الفئران السابقة. كما سيساعد التنظيف الشامل في منع تحجيم البول على شبكة الصدمات، مما يعرض جلسات التكييف للخطر.
ملاحظة: تعمل حلول التنظيف أيضًا كإشارة حاسة الشم ، وبالتالي استخدم نفس سائل التنظيف لسياق معين. - ضع السياق A أو السياق B في مربع مخفف للصوت أثناء جلسات الدراسة المعنية.
- مولد الصوت
- قم بتركيب مكبر صوت فوق السياقات لتقديم محفزات سمعية عند dB 75.
- استخدام مولد الصوت للبرمجة لتوليد المحفزات السمعية على جدول محدد مسبقا. لهجة 7.5 كيلو هرتز نقية هو صوت مع الموجي الجيوب الأنفية، في حين أن الضوضاء البيضاء هي إشارة عشوائية لها كثافة متساوية في ترددات مختلفة، تتراوح بين 1-20،000 هرتز.
- استخدم نبضات TTL لتقديم محفزات سمعية وإشارات صدمات بدقة زمنية.
ملاحظة: قبل بدء التجارب، قم بقياس إخراج كثافة الصوت من السماعة المثبتة في كل غرفة باستخدام مقياس dB.
- صدمة: توصيل الصادم مع أرضية الشبكة الكهربائية التي تستخدم لتقديم صدمة AC 0.9 mA. تحديد تكرار الصدمات وبداية حدوثها ومدتها في برنامج كمبيوتر. تقديم كل حافز صدمة في نهاية كل SCS لمدة 1 s، مجموعها خمسة أزواج SCS-صدمة لكل جلسة تكييف.
3. إعداد برنامج الكمبيوتر وتتبع الفيديو
- إنشاء بروتوكولات سلوكية باستخدام الترميز في برنامج.
- في البرنامج، حدد المركب التسلسلي التحفيز SCS. هذا التحفيز هو عرض تسلسلي لـ 10 s نبرة نقية (يتم عرض كل نقطة ل 500 مللي ثانية، في تردد 7.5 كيلوهرتز ومعدل 1 هرتز) و 10 ثانية الضوضاء البيضاء (500 مللي ثانية نقطة في 1 هرتز).
- تحديد الفترات الفاصلة بين المحاكمات (ITI) المقدمة بعد كل محاكمة، pseudorandomly.
- أثناء الدراسة، تسجيل كل سلوك الماوس إلى الفيديو لتحليلها لاحقاً.
ملاحظة: قد لا يتم إعداد مربعات تكييف الخوف المتوفرة تجاريًا لتسجيل السلوكيات من خلال الكاميرا المثبتة أعلى. وهذا أمر مهم جدا حيث يتم استخدام الفيديو المسجل لحساب الحركة الأفقية والسرعة والمسافة الإجمالية التي يقطعها الحيوان. - لإعداد تتبع البرنامج، ضع ماوس اختبار في كل سياق ذي صلة، واضبط حساسية تتبع الكنتوري، وحدد مركز الجاذبية. وسيكفل ذلك الحصول على بيانات موثوقة عن الوضع النسبي. بالإضافة إلى ذلك، قم بتعريف منطقة السياق بالكامل التي يمكن الوصول إليها من قبل الموضوع.
ملاحظة: تعديل حجم كفاف لكلا السياقين مهم كما تغيير في السطوع في سياقات مختلفة تغيير حجم كفاف. - تحديد معامل المعايرة باستخدام أحجام الغرف المعروفة وأبعاد بكسل الكاميرا التي يمكن استخدامها لحساب السرعة (cm/s).
- مزامنة أحداث الطابع الزمني للكمبيوتر الحصول على البيانات إلى تواجدات الوقت الحقيقي الخاصة بهم.
4. تجربة سلوكية
- تشغيل جميع المعدات: أجهزة الكمبيوتر، والخوف تكييف مربع تحكم، صدمة، والفيديو وبرنامج تسجيل الطابع الزمني. تأكد من تشغيل الأدوات بالترتيب المناسب.
- تحقق من جميع الوظائف بما في ذلك النغمة والضوضاء البيضاء والتسليم بالصدمات، ثم قم بإعداد النظام للحصول على البيانات.
- نقل الحيوانات من غرفة التخزين الخاصة بهم إلى غرفة تكييف. السماح لهم بالتأقلم هناك لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- أخرج الحيوان من القفص المنزلي، وضعه بلطف في السياق الخاص به، ثم قم بتنشيط برامج الكمبيوتر على الفور.
ملاحظة: يمكن مزامنة تهيئة كل من نظام تكييف الخوف وجمع البيانات (الطوابع الزمنية، وتتبع الماوس وتسجيل الفيديو) في وقت واحد باستخدام تنشيطات نبض TTL بوساطة. - ما قبل التكييف/التعرض المسبق
- في اليوم 1، ضع الموضوع في السياق A (السياق المحايد). السماح لها بالتأقلم مع الغرفة لمدة 3 دقائق (فترة خط الأساس)، ومن ثم عرضها ل 4 تجارب من SCS من 20 s المدة الإجمالية(الشكل 1A-1B).
- الحفاظ على 90 s متوسط pseudorandom ITI (نطاق 80-100 s). وتبلغ المدة الإجمالية لكل جلسة ما قبل التعرض 590 s.
- الخوف تكييف
- في اليوم الثاني واليوم الثالث، ضع الموضوع في السياق B. بعد فترة خط أساس 3 دقائق، يعرض الموضوع لخمسة أزواج SCS مع إنهاء مع 1 s، 0.9 mA AC الشوّاكم.
- الحفاظ على 120 s متوسط الزائفة ITI (نطاق 90-150 s). لديك كل دورة تكييف الماضي لمدة 820 ق في المجموع (الشكل 1A).
- اعتماداً على الهدف من التجربة، تخضع الفئران في اليوم 4 إما إلى اختبار استدعاء (راجع الخطوة 4.7) أو للخوف من الانقراض (راجع الخطوة 4.8).
- استدعاء الخوف (لاختبار الاعتماد على السياق)
- في اليوم الرابع، ضع الموضوع في السياق أ. بعد فترة خط الأساس 3 دقائق، وتقديمه مع 4 تجارب SCS دون هزة القدم، أكثر من 590 s.
- الحفاظ على 90 s متوسط pseudorandom ITI (نطاق 80-100 s).
- الخوف من الانقراض
- في اليوم الرابع، ضع الموضوع في السياق باء. بعد فترة خط الأساس 3 دقائق، الحالية 16 التجارب SCS دون هزة قدم، على مدى 1910 ق.
- الحفاظ على 90 s متوسط pseudorandom ITI (نطاق 60-120 s).
- إعادة الحيوان إلى قفص منزله وتكرار الإجراء لجميع الحيوانات.
5. القياس الكمي للسلوك
- يكون المراقب أعمى للتجربة درجة أشرطة الفيديو المسجلة لتجميد السلوك باستخدام عتبة كاشف التجميد التلقائي متبوعا بتحليل الإطار حسب الإطار من التغييرات بكسل.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام حزم البرامج الأخرى لحساب التجميد تلقائياً باستخدام نظام الكاميرا 2. ومن الممكن أيضا للمراقب أن يسجل يدوياً سلوك التجميد. - تعريف التجميد على أنه وقف تام للحركات الجسدية، باستثناء تلك المطلوبة للتنفس، بحد أدنى 1 s.
- نقاط يقفز عندما جميع 4 من الكفوف مغادرة الأرض، مما أدى إلى حركة عمودية و/ أو أفقية.
- تصدير الملف المميز مع علامات التجميد، والقفز و الحدث.
- استخراج الأحداث ذات الصلة (التجميد والقفزات) من فترات زمنية محددة (على سبيل المثال، 10 s مدة ما قبل SCS، لهجة والضوضاء البيضاء، لكل محاكمة).
- باستخدام مدد بدء إيقاف مستخرجة من الأحداث في ملف جدول بيانات، حساب مدة التجميد (في ق) عن طريق طرح وقت البدء من وقت الانتهاء، من الفترات التجريبية المعنية.
- تمثل هذه البيانات محاكمة الحكمة أو اليوم من الحكمة، من خلال تلخيص تجميد المدة من جميع التجارب.
ملاحظة: اعتمادا على الغرض من الدراسة، يمكن تسجيل الرحلة أو تجميد السلوكيات وتحسب من أي محاكمة / مدة من جلسة الدراسة. - جمع العدد الإجمالي ل القفزات من مدة تجريبية معينة.
- استخراج الملف الذي تم إنشاؤه بواسطة إحداثيات تتبع الماوس من الإطار بواسطة الإطار X-Y حركة المحور من مركز الثقل من الماوس وحساب سرعة الماوس (سم / ق).
ملاحظة: قد تكون بيانات السرعة موجودة إما في تنسيق cm/s أو بكسل/الثانية. قم بتحويل وحدة البكسل/البكسل إلى سم/س باستخدام قيمة بوصة أو سم/بكسل محددة في الفيديو لهذا السياق الاختباري (يرجى الاطلاع على القسم 3.6). - بعد استخراج بيانات السرعة للإطار بواسطة حركة الإطار للحيوان ، استنادًا إلى معدل الإطار للفيديو (ويفضل أن يكون 30 إطارًا / s) ، احسب متوسط سرعة الحيوان في قوس رقم إطار محدد (ضرب أوقات البدء والنهاية في s بـ 30 للحصول على رقم إطار البداية والنهاية).
- حساب درجات الرحلة عن طريق تقسيم متوسط السرعة خلال كل SCS على متوسط السرعة خلال 10 ق قبل SCS (خط الأساس، BL) ثم إضافة نقطة 1 لكل قفزة الهروب (speedCS/speedBL + # من القفزات). وبالتالي فإن درجة الرحلة 1 تشير إلى عدم حدوث أي تغيير في سلوك الرحلة عن فترة ما قبل SCS.
- اختياريا، تسجيل أشرطة الفيديو يدويا لسلوكيات أخرى مثل تربية والإغواء.
6 - التحليل الإحصائي
- تحليل البيانات للأهمية الإحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي. بالنسبة لجميع الاختبارات، تعريف الأهمية الإحصائية هو P<0.05.
- تحقق من البيانات للتوزيع العادي باستخدام اختبار الأوضاع الطبيعية Shapiro-Wilk (α = 0.05).
- لاختبار تأثير الإشارات، قم بإجراء المقارنات الزوجية باستخدام اختبار البارامتر المناسب (اختبار t-test) أو غير القياسي (اختبار المرتبة الموقعة Wilcoxon).
- لتقييم التفاعل 2-اتجاه العوامل (جديلة X المحاكمة)، تنفيذ ANOVA 2-way تليها اختبارات ما بعد المخصصة (على سبيل المثال، اختبار مقارنة متعددة Bonferroni / اختبار توكي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكما هو موضح في الرسم البياني (الشكل 1A)،تبدأ الجلسة بالتعرض المسبق (اليوم 1)، متبوعاً بتكييف الخوف (أيام 2 و3)، ثم إما انقراض أو استرجاع (اليوم الرابع).
لم العروض من SCS في جلسة ما قبل التعرض (يوم 1) لا تثير الطيران أو تجميد الاستجابة في الفئران (الشكل 2A-2B). تحليل السلوك أثناء تكييف (أيام 2 و 3) كشفت أن عنصر لهجة SCS عززت بشكل كبير تجميد بالمقارنة مع تجميد خلال مرحلة ما قبل SCS (الشكل 2B, 2E). تغيرت درجات الرحلات الجوية بشكل ملحوظ عبر الجلسات (اليوم 1 إلى اليوم 3، ن = 20؛ اليوم 1 إلى 3، رقم 20؛ اليوم 1 إلى 3، رقم 20. الشكل 2أ). وأظهرت الفئران سرعة أعلى والقفزات أكثر، وبالتالي درجات أكبر من الرحلة، إلى جديلة الضوضاء البيضاء مقارنة مع لهجة(الشكل 2C-2D). وأظهرت الفئران انتقال واضح من السلوك الدفاعي --عرض درجات أقل من الطيران خلال لهجة تليها درجات أعلى من الطيران خلال الضوضاء البيضاء(الشكل 2F)والعكس بالعكس لتجميد الردود (الشكل 2G).
لاختبار تأثير القرب التهديد والسياق على الطيران مشروطة، تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين: مجموعة واحدة خضع التدريب على الانقراض في سياق تكييف(الشكل 3A-3B)،وتم اختبار مجموعة أخرى لاستدعاء الذاكرة الخوف عن طريق تعريضهم إلى SCS في سياق محايد (الشكل 3C-3D). وأظهرت الفئران التي خضعت لتجارب الانقراض الـ 16 الانقراض الانقراض السريع للطيران المشروط (n = 12). وكانت درجات الرحلة الجوية خلال الكتلة الأولى من أربع تجارب أعلى خلال الضوضاء البيضاء بالمقارنة مع لهجة (الشكل 3A). لم يعد سلوك الرحلة مُلّمًا بأي من الإشارات في نهاية جلسة الانقراض. وكان هناك انخفاض عام في التجميد الناجم عن النبرة وزيادة في التجميد بوساطة الضوضاء البيضاء خلال جلسة الانقراض. وكان تجميد الكتلة الأولى من أربع تجارب أعلى بكثير إلى لهجة مقارنة مع الضوضاء البيضاء(الشكل 3B). وهذا يشير إلى أن خطر التهديد أمر حيوي للرد على الطيران.
وقد تضاءلت الاستجابة للرحلات الجوية بطريقة تعتمد على السياق. ولم يثر التعرض للضوضاء البيضاء في السياق المحايد أي رحلة جوية (ن = 8). بدلا من ذلك ، أثار الضوضاء البيضاء في سياق محايد الردود تجميد التي كانت أعلى من تلك التي أثارتها لهجة(الشكل 3C - 3D). وهذا يدل على أهمية السياق في تعديل الاستجابة الدفاعية.
الشكل 1: دراسة التصميم لتقييم نموذج التجميد والطيران.
أ)رسم تخطيطي للجلسات السلوكية. ب) مخطط بياني يفصل تكوين المركب التسلسلي التحفيز (SCS)، وكذلك توقيت الولايات المتحدة. ج) السياق A - بمثابة سياق محايد، ويستخدم خلال جلسات ما قبل التعرض والاستدعاء. د)السياق ب – يستخدم لتكييف الخوف. وقد تم تعديل هذا الرقم من Fadok وآخرون 2017. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الاستجابة الجوية المشروطة.
A)مقارنة متوسط درجات الرحلة التجريبية الحكيمة (n = 20) بعد عرض النغمة والضوضاء البيضاء عبر الأيام 1-3. وقد لوحظ تغير كبير في درجات الرحلات الجوية عبر الدورات (اليوم 1 إلى اليوم 3؛ التدابير المتكررة في الاتجاهين ANOVA، × التفاعل التجريبي، F (13، 266) = 5.795؛ F (13, 266) = 5.795؛ F (13, 266) = 5.795؛ P<0.0001). يكشف اختبار مقارنة Bonferroni المتعددة بعد ذلك عن فرق كبير بين النبرة والضوضاء البيضاء الناجمة عن درجات الرحلات الجوية في يوم تكييف الخوف 1 (المحاكمة 4 ، P < 0.05) واليوم 2 (التجارب 2-5 ، P < 0.001). ب)مقارنة متوسط من الحكمة المحاكمة ٪ تجميد خلال فترات لهجة والضوضاء البيضاء عبر أيام 1-3. لاحظ تغيراً ذا دلالة إحصائية في نسبة التجمد عبر الجلسات (يوم 1 إلى اليوم 3، ن = 20؛ التدابير المتكررة في الاتجاهين ANOVA، جديلة × التفاعل التجريبي، F (13، 266) = 20.81؛ P < 0.001; الشكل 2 ب). اختبار مقارنة بونفروني بعد مخصص متعددة يكشف عن فرق كبير بين لهجة والضوضاء البيضاء الناجمة عن تجميد الخوف تكييف اليوم 1 (محاكمة 4 و 5، P < 0.001) واليوم 2 (جميع التجارب، P < 0.001). C)مقارنة عدد من الردود الهروب القفز خلال مرحلة ما قبل SCS، لهجة، الضوضاء البيضاء، وفترات الصدمة في اليوم 3. وأظهرت ANOVA ذات الاتجاه الواحد تليها اختبار المقارنات المتعددة الذي أجراه بونفرروني أن قفزات الهروب كانت أعلى بشكل ملحوظ خلال الضوضاء البيضاء والصدمة مقارنة بفترة النغمة (P < 0.01 و P < 0.001 على التوالي). د)مقارنة درجات الرحلات الجوية أثناء عرض النبرة والضوضاء البيضاء في اليوم الثالث. لاحظ درجات طيران أعلى بكثير في اليوم 3 خلال فترة الضوضاء البيضاء (P < 0.001 ، Wilcoxon مطابقة أزواج اختبار رتبة موقعة). E)مقارنة ٪ تجميد خلال مرحلة ما قبل SCS، لهجة، والضوضاء البيضاء في اليوم 3. سلوك تجميد يوم 3 يكشف عن تأثير كبير من لهجة والضوضاء البيضاء (اتجاه واحد المتكررة التدابير ANOVA، F = 56.82، P<0.01). أظهر اختبار المقارنات المتعددة الذي قام به Bonferroni أن عرض النبرة يزيد بشكل كبير من نسبة التجمد مقارنة بمدة ما قبل SCS (P < 0.01) ، في حين تم تقليل نسبة التجمد بشكل كبير مقارنة بمدد ما قبل SCS ونغمات (كلاهما P < 0.001). تظهر البيانات التمثيلية للتجارب الانتقالية انتقالات الطيران (F) وتجميد(G)بعد عرض نغمة وضوضاء بيضاء في الماوس في اليوم الثالث. القيم الممثلة هي وسيلة ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. قبل إكسب، قبل التعرض. يتم تعديل لوحات A-E من Fadok وآخرون، 2017. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الانقراض والتذكر بعد تكييف الطيران (اليوم الرابع).
A)أظهرت مقارنة درجات الرحلات الجوية أثناء التدريب على الانقراض الانقراض السريع للطيران المُشروط (n = 12؛ 16 تجربة، والتدابير المتكررة في الاتجاهين ANOVA، وإشارة × التفاعل التجريبي، وF(15،165) = 3.05، P < 0.01). لوحظت درجات الرحلة من الكتلة الأولى من أربع تجارب (محاكمة 1-4) من الانقراض أعلى بكثير للضوضاء البيضاء مقارنة مع النغمة (P < 0.05 ، Wilcoxon مطابقة أزواج اختبار الرتبة الموقعة). ب) أظهرت مقارنة التجميد تأثيرًا مهمًا إحصائيًا على التجميد (٪ ) بعد الضوضاء البيضاء (ن = 12؛ 16 التجارب، في اتجاهين المتكررة ANOVA التدابير، جديلة × التفاعل التجريبي، F(15،165) = 3.55، P < 0.01). التجمد للقطعة الأولى من أربع تجارب (محاكمة 1-4) خلال الانقراض وجدت أن تكون أقل بكثير خلال فترة الضوضاء البيضاء بالمقارنة مع لهجة (يقترن t-اختبار, P < 0.01). ج) التغيرات في السياق تؤثر بشكل كبير على درجات الرحلة (n = 8؛ 4 تجارب، ذات اتجاهين المتكررة ANOVA، جديلة × التفاعل التجريبي، F(1،7) = 27.44، P < 0.01). انخفضت درجات الرحلات الجوية بشكل كبير خلال الضوضاء البيضاء مقارنة بفترة النغمة في السياق المحايد (اختبار t-paired ثنائي الطرف، P < 0.01) D). تجميد الاستجابات عبر التجارب أثناء الاسترجاع كانت أيضا كبيرة (ن = 8، 4 تجارب، في الاتجاهين المتكررة ANOVA، تأثير جديلة F(1،7) = 27.67، P < 0.01). وقد زاد التعرض لWN في سياق محايد بشكل كبير من الردود المتجمدة بالمقارنة مع النغمة (اختبار t-paired ثنائي الطرف، P < 0.001). القيم الممثلة هي وسيلة ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. يتم تعديل لوحات A-D من Fadok وآخرون 2017. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد معلمات الصوت والصدمة الموصوفة عناصر هامة في هذا البروتوكول. لذلك، من المهم اختبار سعة الصدمة ومستوى ضغط الصوت قبل بدء التجارب. دراسات تكييف الخوف عادة استخدام 70-80 ديسيبل مستويات ضغط الصوت و0.1-1 1 شدة الصدمة18mA ; وبالتالي، فإن المعلمات الموصوفة تقع ضمن حدود نماذج تكييف الخوف التقليدية. في السابق CS-فقط (لا هزة قدم) التجربة، ونحن لم نلاحظ الطيران أو تجميد الاستجابات في الفئران، مما يدل على أن المحفزات السمعية ليست aversive عندما قدمت كما هو موضح15. قد يؤدي زيادة مستوى dB للضوضاء البيضاء فوق dB 80 إلى النفور الفطري. ومع ذلك، المحفزات الضوضاء المقدمة في 75 ديسيبل لا تثير الإجهاد في شكل النشاط السلوكي قمعها في الفئران19.
يجب اختيار المحفزات السمعية التي تشكل SCS بعناية. في دراستنا السابقة، قررنا أن تكييف واحد CS مع الضوضاء البيضاء يحفز درجات أعلى من الطيران من تكييف مع لهجة نقية15. وهذا يوضح أهمية أهمية التحفيز في هذا البروتوكول20. ومع ذلك ، أظهرت دراسة حديثة أن تكييف مع انعكاس تسلسل SCS (أبيض الضوضاء لهجة) النتائج في الطيران إلى لهجة وتجميد للضوضاء البيضاء21. وتؤيد هذه البيانات أن العلاقة الزمنية المستفادة من العظة هو أيضا عامل مهم.
لأن التغييرات في القفص هي مصدر محتمل للإجهاد، فمن المستحسن البدء في تكييف ما لا يقل عن 2 أيام بعد تغيير القفص الأخيرة. لتقليل تأثير الإجهاد على الفئران التي تخضع للدراسة ، يجب توخي الحذر المناسب للحد من الإشارات الشمية المتبقية من الموضوعات السابقة ، بما في ذلك رائحة البراز والبول. ولذلك، تنظيف الغرفة قبل وبعد كل فأر أمر بالغ الأهمية. لتجنب مصادر أخرى محتملة للاضطرابات، من الأفضل إجراء هذا البروتوكول في غرفة منفصلة عن أي تجارب جارية أخرى. يجب أن تظهر الفئران منخفضة جدا تجميد خط الأساس15. 21- وينبغي لكل مختبر أن يجري تجربة تجريبية لاختبار التجمد الأساسي في كل سياق من الظروف التجريبية.
بخلاف C57BL/6J وغيرها من الخطوط المعدلة وراثيا المستخدمة من قبل Fadok وآخرون (2017)15، ينبغي أن تكون هذه الطريقة مناسبة للتكيف مع سلالات أخرى من الفئران والجرذان20،21. وتشير البيانات الحديثة (Borkar et al. 2020)22 إلى أن كلا من الفئران الذكور والإناث تظهر استجابات مماثلة للطيران، وبالتالي فإن النموذج مناسب لكلا الجنسين. كما ذكر في الخطوة 2.1.2، استجابة للصدمات عالية الشدة، الفئران القفز عالية جدا، وبالتالي حدد بعناية ارتفاع الغرفة لمنع الفئران من الهروب من السياق. من المهم أيضا لضمان توقيت ثابت ودقيق من العظة ومحفزات الصدمة. فصدمات التيار المتردد والصدمات التي تُصدم في منطقة العاصمة تتسم بالفعالية؛ ومع ذلك، عند استخدام الصدمات DC، قد يكون من الضروري زيادة كثافة هزة القدم للوصول إلى درجات طيران مماثلة لتلك التي من الصدمات AC. لأن الصدمات DC لها تأثير أقل ضررا على التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية، ينصح باستخدام DC صدمة للدراسات التي تتطلب بيانات الفيزيولوجيا الكهربائية. ومن المهم ملاحظة أن خفض شدة هزة القدم قد يقلل من شدة استجابة الطيران.
كما هو مُدلٍ في البروتوكول، يتم حساب درجات الرحلة عن طريق تطبيع بيانات السرعة أثناء النبرة والضوضاء البيضاء عن طريق تقسيمها مع قيم سرعة ما قبل SCS التجريبية الفردية. ومع ذلك، إذا كان الماوس يسلك مستويات عالية للغاية من التجميد خلال فترة ما قبل SCS، قد تكون درجات الطيران الناتجة عالية جدا، وبالتالي زيادة تقلب البيانات. ويمكن التحايل على ذلك باستخدام قياس خط أساس مختلف، مثل متوسط بيانات السرعة من فترة الأساس 3 دقائق في بداية الجلسة أو باستخدام متوسط سرعة العام قبل SCS (متوسط 5 تجارب)، بدلاً من الفردية قبل SCS القيم.
التكيف السلوكي المرن والسريع مع التهديد أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة. معظم بروتوكولات تكييف الخوف الكلاسيكية استخدام الشروط التي تحفز على تجميد كمحدد وحيد لتعلم الخوف. فائدة هذا البروتوكول هو أنه يسمح لدراسة التحولات المعقدة حالة دفاعية داخل المواضيع. سابقا، كان يستخدم هذا النموذج لاكتشاف أن يتم معالجة التحولات السلوكية من قبل الدوائر المثبطة المحلية المتكررة في amygdala المركزية15،23. هذا النموذج أيضا تمكين الباحثين لتوضيح الدوائر كورتيكو ثالامية لاختيار السلوك الدفاعي21. هذه الدراسات تثبت أن هذه الطريقة سوف تسهل الدراسات التي تحقق السيطرة الدائرة العصبية من التحولات السريعة بين السلوكيات الدفاعية داخل موضوع. هذا له تطبيقات محتملة لتطوير فهم أفضل للدعائم العصبية البيولوجية من القلق, اضطراب الهلع, أو اضطراب ما بعد الصدمة24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس ولاية لويزيانا من خلال مجلس أمناء صندوق الدعم (LEQSF (2018-21)-RD-A-17) والمعهد الوطني للصحة العقلية في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01MH122561. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
- Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
- LeDoux, J. Rethinking the Emotional Brain. Neuron. , (2012).
- Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annual Review of Neuroscience. 24, 897-931 (2001).
- Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
- Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
- Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
- Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
- National Institute of Mental Health. Generalized anxiety disorder. National Institute of Mental Health. , 3-8 (2017).
- Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
- Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
- Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
- Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
- Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
- Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C. Noise avoidance in the C57BL/6J mouse. Animal Learning & Behavior. 20 (1), 25-32 (1992).
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
- Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
- Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
- Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
- Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
- Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).
