Summary
Savunma amaçlı davranışsal tepkiler tehdit yoğunluğuna, yakınlığa ve maruz kalma bağlamı üzerine kuruludur. Bu faktörlere dayanarak, bireysel deneklerde koşullandırılmış donma ve uçuş davranışı arasında net geçişler sağlayan klasik bir şartlandırma paradigması geliştirdik. Bu model anksiyete, panik ve travma sonrası stres bozukluklarında yer alan patolojilerin anlaşılması için çok önemlidir.
Abstract
Korku ve anksiyete ile ilgili davranışlar bir organizmanın hayatta kalmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bununla birlikte, algılanan tehdide karşı abartılı savunma yanıtları, AMERIKA Birleşik Devletleri'nde en yaygın akıl hastalığı şekli olan çeşitli anksiyete bozukluklarının karakteristiğidir. Savunma davranışlarından sorumlu nörobiyolojik mekanizmaların keşfedilmeleri, yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Pavlovian korku şartlandırma, korkuya bağlı öğrenme ve hafızayı incelemek için yaygın olarak kullanılan bir laboratuvar paradigmasıdır. Geleneksel Pavlovian korku şartlandırma paradigmalarının önemli bir sınırlaması, donma izlenen tek savunma davranışıdır. Son zamanlarda, bireysel denekler içinde hem koşullandırılmış dondurma hem de uçuş (kaçış olarak da bilinir) davranışını incelememizi sağlayan değiştirilmiş bir Pavlovian korku şartlandırma paradigması geliştirdik. Bu model, daha yüksek yoğunluklu ayak depremleri ve koşullandırılmış uyaran ile koşulsuz uyaran arasında daha fazla sayıda eşleştirme istihdam eder. Ek olarak, bu şartlı uçuş paradigması, koşullandırılmış uyaran olarak saf ton ve beyaz gürültü işitsel uyaranların seri sunumunu kullanır. Bu paradigmadaki koşullandırmayı takiben, fareler ton uyaranlarına yanıt olarak donma davranışı ve beyaz gürültü sırasında uçuş tepkileri sergiler. Bu koşullandırma modeli, hayatta kalmak için gerekli davranışsal tepkiler arasındaki hızlı ve esnek geçişlerin incelenmesine uygulanabilir.
Introduction
Korku, acil bir tehdide evrimsel olarak korunmuş uyarlanabilir bir yanıttır1,2. Organizmalar bir tehdide doğuştan gelen savunma tepkilerine sahip olsa da, öğrenilen ilişkiler tehlikenin uyaranlarına uygun savunma tepkileri ortaya çıkarmak için çok önemlidir3. Savunma tepkilerini kontrol eden beyin devrelerindeki düzensizlik, travma sonrası stres bozukluğu (TSSB), panik bozukluk 4 ve spesifik fobiler5,6gibi birdenfazla zayıflatıcı anksiyete bozukluğu ile ilişkili maladaptif reaksiyonlara katkıda bulunma olasılığı yüksektir. Amerika Birleşik Devletleri'nde anksiyete bozukluklarında yaygınlık oranı yetişkinler için% 19.1 ve ergenlerde% 31.9'dur7,8. Bu hastalıkların yükü bireylerin günlük rutini üzerinde son derece yüksektir ve yaşam kalitelerini olumsuz yönde etkiler.
Son birkaç on yılda Pavlovian korku koşullandırması, korkuyla ilgili öğrenme ve hafızanın altında yatan sinirsel mekanizmalar hakkında muazzam bir fikir edinmek için güçlü bir model sistemi olarak hizmet etti9,10,11. Pavlovian korku şartlandırması, koşullandırılmış bir uyaranın (işitsel bir uyaran gibi CS) karşıt koşulsuz bir uyaranla (ABD; örneğin, bir elektrik ayağı)12. Donma, standart Pavlovian şartlandırma paradigmalarında uyandırılan ve ölçülen baskın davranış olduğundan, kaçış/uçuş tepkileri gibi aktif savunma davranışlarının sinir kontrol mekanizmaları büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Önceki çalışmalar, tehdit yoğunluğuna, yakınlığa ve içeriğe bağlı olarak uçuş gibi farklı savunma davranışı biçimlerinin uyandırdığını göstermektedir13,14. Beynin farklı savunma davranışlarını nasıl kontrol ettiğini incelemek, korku ve anksiyete bozukluklarında düzensiz olan nöronal süreçlerin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir.
Bu kritik ihtiyacı gidermek için, donma15'e ek olarak uçuş ve kaçış atlayışları ortaya çıkan değiştirilmiş bir Pavlovian şartlandırma paradigması geliştirdik. Bu paradigmada, fareler saf bir tondan ve ardından beyaz gürültüden oluşan bir seri bileşik uyaran (SCS) ile şartlandırılmıştır. SCS'yi güçlü bir elektrikli ayakla eşleştirdikten iki gün sonra, fareler beyaz gürültü sırasında ton bileşenine ve uçuşa yanıt olarak donma sergiler. Koşullandırılmış dondurma ve uçuş davranışı arasındaki davranışsal anahtarlar hızlı ve tutarlıdır. İlginçtir ki, fareler uçuş davranışını yalnızca beyaz gürültü CS'i daha önce teslim edilen bir ayakla (koşullandırma bağlamı) aynı bağlamda sunulduğunda, ancak nötr bir bağlamda olmadığında sergiler. Bunun yerine, donma tepkileri bu nötr bağlamda baskındır ve tona kıyasla beyaz gürültüye yanıt olarak önemli ölçüde daha fazla donma seviyesine sahiptir. Bu, savunma tepki yoğunluğunu modüle etmedeki bağlamın rolü ve geleneksel tehdit koşullandırma paradigmalarında bulunan korkuya bağlı öğrenme ve bellekte bağlamsal bilgilerin düzenleyici rolü ile tutarlıdır16,17. Bu model, birden çok savunma davranışının içeriğe özgü bir şekilde doğrudan, konu içinde karşılaştırılmalarına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki adımlar/prosedürler, Tulane Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayından sonra kurumsal yönergelere uygun olarak gerçeklendirilmiştir.
1. Farelerin hazırlanması
- 3-5 ay arasında erkek ve/veya dişi yetişkin fareler kullanın. Bu çalışmada Jackson Laboratuvarı'ndan elde edilen erkek C57BL/6J fareleri kullandık, ancak saygın bir tedarikçiden gelen herhangi bir fare zorlanması kullanılabilir.
- Deneyden en az bir hafta önce, tüm fareleri çalışma boyunca 12:12 saat açık / karanlık bir döngüde ayrı ayrı barındırın. Farelere yiyecek ve suya reklam sıvısı erişimi sağlayın.
- Işık döngüsü sırasında tüm davranış deneylerini gerçekleştirin. Tüm oturumları günün aynı saatinde tek bir kohort içinde gerçekleştirin. Örneğin, denemeyi 1.
2. Çalışma materyallerinin hazırlanması
- Çalışma bağlamları
- Denemeleri gerçekleştirmek için iki farklı bağlam seçin.
- Pürüzsüz bir Pleksiglas zemine sahip bağlam A olarak net Pleksiglaslardan (çap 30 cm) oluşan silindirik bir oda kullanın. Odanın yüksekliği kaçışı önlemek için yeterli olmalıdır (en az 30 cm yüksekliğinde).
- B Bağlamı için, alternatif akım ayak depremleri sağlamak için kullanılan elektrik ızgara zeminine sahip dikdörtgen bir muhafaza (25 cm x 30 cm) kullanın. Bu odanın yüksekliği çok önemlidir ve en az 35 cm yüksekliğinde olmalıdır. Alternatif olarak, şeffaf bir çatı kullanın (videonun bu malzemeden kaydedilebildiğinden emin olun).
NOT: Kolayca temizlenebilen pürüzsüz duvar yüzeylerine sahip bir oda kullanın. - Bağlamları temizlemek için farklı bir temizleme çözümü kullanın. Örneğin, %1 asetik asit ile temiz bağlam A ve %70 etanol ile B bağlamı. İlk oturuma başlamadan önce, tek tek fareleri test etmek arasında ve günün oturumlarını tamamladıktan sonra bağlamları temizleyin. Bu, koku ipuçlarını önceki farelerden kaldırmak için hayati önem taşır. Kapsamlı temizlik ayrıca şok ızgarası üzerinde idrar ölçeklendirmeyi önlemeye yardımcı olacak ve bu da şartlandırma seanslarını tehlikeye atacaktır.
NOT: Temizleme çözümleri aynı zamanda bir koku işareti görevi de sunar, bu nedenle belirli bir bağlam için aynı temizleme sıvısını kullanın. - İlgili çalışma oturumları sırasında A bağlamını veya B bağlamını ses zayıflatıcı bir kutuya yerleştirin.
- Ses üreteci
- 75 dB'de işitsel uyaranlar sunmak için bağlamların üzerine bir tepegöz hoparlör takın.
- Önceden tanımlanmış bir programda işitsel uyaranlar oluşturmak için programlanabilir bir ses üreteci kullanın. 7,5 kHz saf ton sinüzoidal dalga biçimine sahip bir sestir, beyaz gürültü ise 1-20.000 Hz arasında değişen farklı frekanslarda eşit yoğunluğa sahip rastgele bir sinyaldir.
- İşitsel uyaranları ve şok sinyallerini zamansal hassasiyetle sunmak için TTL darbeleri kullanın.
NOT: Denemelere başlamadan önce, her haznedeki monte edilmiş hoparlörden gelen ses yoğunluğu çıkışını bir dB metre kullanarak ölçün.
- Şoklayıcı: Şoklayıcıyı 0,9 mA AC şok sağlamak için kullanılan elektrik şebekesi zeminine bağlayın. Bir bilgisayar programındaki şokların sıklığını, başlangıcını ve süresini tanımlayın. Her SCS'nin sonundaki her şok uyaranını 1 s süreyle sn teslim edin ve koşullandırma seansı başına toplam beş SCS şok eşleştirmesi gerçekleştirin.
3. Bilgisayar programının hazırlanması ve video takibi
- Bir yazılım programında kodlama kullanarak davranış protokolleri oluşturun.
- Programda, seri bileşik uyaran SCS'yi tanımlayın. Bu uyaran, 10 s saf tonun seri sunumudur (her pip 500 ms için, 7,5 kHz frekansta ve 1 Hz hızında sunulur) ve 10 s beyaz gürültü (1 Hz'de 500 ms pip).
- Her denemeden sonra sunulan deneme aralıklarını (ITI) psödorandomly olarak tanımlayın.
- Çalışma sırasında, sonraki analiz için tüm fare davranışını videoya kaydedin.
NOT: Ticari olarak kullanılabilen korku koşullandırma kutuları, davranışları üste monte edilmiş kameradan kaydetmek için kurulmayabilir. Kaydedilen video, hayvanın kat ettiği yatay hareketi, hızı ve toplam mesafeyi hesaplamak için kullanıldığından bu çok önemlidir. - Yazılım izlemeyi ayarlamak için, ilgili her içeriğe bir test faresi yerleştirin, kontur izleme hassasiyetini ayarlayın ve ağırlık merkezini tanımlayın. Bu, göreli konum hakkında güvenilir verilerin alınmasını sağlayacaktır. Ayrıca, konunun erişebileceği tüm bağlam alanını tanımlayın.
NOT: Farklı bağlamlardaki parlaklık değişimi kontur boyutunu değiştireceğinden, her iki bağlam için kontur boyutunun ayarlanmasında önemlidir. - Odaların bilinen boyutlarını ve kameranın hızı (cm/s) hesaplamak için kullanılabilecek piksel boyutlarını kullanarak bir kalibrasyon katsayısı belirleyin.
- Veri toplama bilgisayarının zaman damgası olaylarını gerçek zamanlı oluşumlarıyla eşitleyin.
4. Davranış deneyi
- Tüm ekipmanları açın: bilgisayarlar, korku koşullandırma kutusu denetleyicisi, şok edici ve video ve zaman damgası kayıt yazılımı. Aletlerin uygun sırada açıldığından emin olun.
- Ton, beyaz gürültü ve şok teslimi dahil olmak üzere tüm işlevleri kontrol edin ve sistemi veri toplama için ayarlayın.
- Hayvanları depolarından klima odasına taşıyın. Orada en az 10 dakika alışmalarına izin verin.
- Hayvanı ev kafesinden çıkar, ilgili içeriğe nazikçe yerleştirin ve ardından bilgisayar programlarını hemen etkinleştirin.
NOT: Hem korku şartlandırma sistemi hem de veri toplama (zaman damgaları, fare izleme ve video kaydı) yazılımının aynı anda başlatılması, TTL darbe aracılı aktivasyonlar kullanılarak senkronize edilebilir. - Ön koşullandırma/Ön maruz kalma
- 1. Günde, konuyu A bağlamına (nötr bağlam) yerleştirin. Odaya 3 dakika (taban çizgisi süresi) alışmasına izin verin ve ardından 20'nin toplam süresine sahip bir SCS'nin 4 denemesine maruz bırakın (Şekil 1A-1B).
- 90 s ortalama psödorandom ITI (aralık 80-100 s) koruyun. Her ön pozlama seansının toplam süresi 590 s'dir.
- Korku şartlandırması
- 2. gün ve 3. 3 dakikalık bir taban çizgisi periyodunun ardından, konuyu SCS'nin 1 s, 0,9 mA AC ayakla birlikte sonlandırmasının beş eşleşmesine maruz bırakın.
- 120 s ortalama psödorandom ITI (aralık 90-150 s) koruyun. Her koşullandırma seansının toplamda 820 sn sürmesini iste (Şekil 1A).
- Deneyin amacına bağlı olarak, 4. günde fareleri bir geri çağırma testine tabi edin (bkz. adım 4.7) veya yok olmaktan korkmak (bkz. adım 4.8).
- Korku geri çağırma (bağlam bağımlılığını test etmek için)
- 4. günde, konuyu Bağlam A'ya yerleştirin. 3 dakikalık taban çizgisi süresinden sonra, 590 sn'nin üzerinde, ayakçıksız 4 SCS denemesi ile sunun.
- 90 s ortalama psödorandom ITI (aralık 80-100 s) koruyun.
- Yok olmaktan korkun
- 4. günde, konuyu B bağlamına yerleştirin. 3 dakikalık temel sürenin ardından, 1910 sn'nin üzerinde, ayakçıksız SCS'nin 16 denemesini sunun.
- 90 s ortalama psödorandom ITI (aralık 60-120 s) koruyun.
- Hayvanı ev kafesine geri koyun ve tüm hayvanlar için prosedürü tekrarlayın.
5. Davranışın nicelleştirilmesi
- Deneye kör olan bir gözlemcinin, otomatik dondurma dedektörü eşiğini ve ardından piksel değişikliklerinin kare kare analizini kullanarak kaydedilen videoları donma davranışı için puanlamasını sağlar.
NOT: Diğer yazılım paketleri, 2 kamera sistemi kullanarak dondurmayı otomatik olarak hesaplamak için de kullanılabilir. Bir gözlemcinin dondurma davranışını manuel olarak puanlaması da mümkündür. - Dondurmayı, solunum için gerekli olanlar hariç, en az 1 sn boyunca bedensel hareketlerin tamamen durması olarak tanımlayın.
- Pençelerin 4'ü de zeminden çıktığında puan atlar ve bu da dikey ve/veya yatay bir hareketle sonuçlanır.
- İşaretli dosyayı dondurma, atlama ve olay işaretçileriyle dışa aktar.
- Tanımlanan zaman aralıklarından (örneğin, scs öncesi 10 s süre, her deneme için ton ve beyaz gürültü) ilgili olayları (donma ve atlamalar) çıkarın.
- Bir elektronik tablo dosyasındaki olayların ayıklanan başlangıç-durdurma sürelerini kullanarak, başlangıç saatini bitiş saatinden, ilgili deneme sürelerinden çıkararak dondurma (lar) süresini hesaplayın.
- Tüm denemelerden dondurma süresini özetleyerek bu veri deneme açısından veya gün açısından temsil edin.
NOT: Çalışmanın amacına bağlı olarak, uçuş veya donma davranışları, çalışma oturumundan itibaren herhangi bir deneme/süreden puanlanabilir ve hesaplanabilir. - Belirli bir deneme süresinden toplam atlama sayısını toplayın.
- Fare izleme koordinatları tarafından oluşturulan dosyayı, farenin ağırlık merkezinin kare kare X-Y ekseni hareketinden ayıklayın ve farenin hızını (cm/sn) hesaplayın.
NOT: Hız verileri cm/s veya piksel/s biçiminde bulunabilir. Bu test bağlamı için videoda tanımlanan inç veya cm/piksel değerini kullanarak piksel/s birimini cm/s'ye dönüştürün (lütfen bölüm 3,6'ya bakın). - Videonun kare hızına (tercihen 30 kare/sn) dayanarak hayvanın kare kare hareketi için hız verilerini çıkardıktan sonra, hayvanın belirli bir kare numarası braketindeki ortalama hızını hesaplayın (başlangıç ve bitiş kare numarasını almak için başlangıç ve bitiş sürelerini 30 ile çarpın).
- Her SCS sırasındaki ortalama hızı 10 s scs öncesi (taban çizgisi, BL) sırasındaki ortalama hıza bölerek ve ardından her kaçış atlayışı için 1 puan ekleyerek uçuş puanlarını hesaplayın (speedCS/speedBL + atlama sayısı). Bu nedenle 1 uçuş puanı, SCS öncesi dönemden itibaren uçuş davranışında bir değişiklik olmadığını gösterir.
- İsteğe bağlı olarak, yetiştirme ve tımar gibi diğer davranışlar için videoları manuel olarak puanlama.
6. İstatistiksel analiz
- İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak istatistiksel öneme sahip verileri analiz edin. Tüm testler için istatistiksel önemin tanımı P<0.05'tir.
- Shapiro-Wilk normallik testini kullanarak verileri normal dağılım için kontrol edin (α=0,05).
- İpuçlarının etkisini test etmek için, uygun parametrik (eşleştirilmiş t testi) veya parametrik olmayan (Wilcoxon imzalı derece testi) testi kullanarak çift yönlü karşılaştırmaları gerçekleştirin.
- Faktörlerin 2 yönlü etkileşimini değerlendirmek için (işaret X denemesi), 2 yönlü bir ANOVA ve ardından geçici testler yapın (örneğin, Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi/Tukey testi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diyagramda açıklandığı gibi (Şekil 1A), oturum ön maruz kalma (Gün 1), ardından korku koşullandırması (Gün 2 ve 3) ve ardından yok olma veya geri alma (Gün 4) ile başlar.
SCS'nin ön pozlama (Gün 1) oturumundaki sunumları farelerde uçuş veya donma tepkisi vermedi(Şekil 2A-2B). Koşullandırma sırasında davranışsal analiz (Gün 2 ve 3), SCS'nin ton bileşeninin SCS öncesi dönemde donmaya kıyasla önemli ölçüde donmayı artırdığını ortaya koydu (Şekil 2B,2E). Uçuş puanları seanslar arasında önemli ölçüde değişti (1. günden 3. güne, n = 20; Şekil 2A). Fareler, tona kıyasla beyaz gürültü işaretine daha yüksek hız ve daha fazla atlama ve dolayısıyla daha fazla uçuş puanı gösterdi (Şekil 2C-2D). Fareler savunma davranışının net bir geçişini gösterdi - ton sırasında daha düşük uçuş puanları ve ardından beyaz gürültü sırasında daha yüksek uçuş puanları sergiledi (Şekil 2F) ve donma yanıtları için tam tersi (Şekil 2G).
Tehdit yakınlığının ve bağlamının koşullandırılmış uçuş üzerindeki etkisini test etmek için, fareler iki gruba ayrıldı: bir grup şartlandırma bağlamında yok olma eğitiminden geçirildi (Şekil 3A-3B), ve başka bir grup, scs'ye nötr bir bağlamda maruz bırakarak korku hafızası hatırlama için test edildi (Şekil 3C-3D). 16 yok olma eğitimine tabi tutulan fareler, şartlandırılmış uçuşun hızlı bir şekilde yok olduğunu gösterdi (n = 12). Dört denemenin ilk bloğu sırasında uçuş puanları beyaz gürültü sırasında tona kıyasla daha yüksekti (Şekil 3A). Uçuş davranışı artık yok olma seansının sonundaki her iki işaretle de ortaya değildi. Yok olma seansı sırasında ton kaynaklı donmada genel bir azalma ve beyaz gürültü aracılı donmada bir artış oldu. Dört denemenin ilk bloğu için donma, beyaz gürültüye kıyasla tona göre önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 3B). Bu, tehdidin yakınlaşmasının uçuş tepkisi için hayati önem taşıdığını göstermektedir.
Uçuş tepkisi içeriğe bağlı bir şekilde azaldı. Nötr bağlamda beyaz gürültüye maruz kalmak uçuşa neden olmadı (n = 8). Bunun yerine, nötr bağlamda beyaz gürültü sunumları, ton tarafından ortaya çıkanlardan daha yüksek olan donma tepkilerini ortaya çıkardı (Şekil 3C-3D). Bu, savunma yanıtlarının modüleinde bağlamın önemini göstermektedir.
Şekil 1: Donma ve uçuş paradigmasını değerlendirmek için tasarım çalışması.
A) Davranışsal oturumların şeması. B) Seri bileşik uyaranın (SCS) bileşimini ve ABD'nin zamanlamasını ayrıntılı olarak açıklayan diyagram. C) Bağlam A - nötr bir bağlam olarak hizmet verdi ve ön pozlama ve geri çağırma oturumları sırasında kullanıldı. D) Bağlam B – korku şartlandırma için kullanılır. Bu rakam Fadok ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Şartlı uçuş yanıtı.
A) 1-3. gün boyunca ton ve beyaz gürültü sunumunu takiben ortalama deneme amaçlı uçuş puanlarının (n = 20) karşılaştırılması. Oturumlar arasında uçuş puanlarında önemli bir değişiklik kaydedildi (1. günden 3. güne; iki yönlü tekrarlanan önlemler ANOVA, işaret × deneme etkileşimi, F (13, 266) = 5.795; P<0.0001). Post-hoc Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi, korku şartlandırma Günü 1 (deneme 4, P < 0.05) ve 2. B)1-3. gün boyunca ton ve beyaz gürültü dönemlerinde ortalama deneme amaçlı % donma karşılaştırması. Oturumlar boyunca donma yüzdesinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişikliğe dikkat edin (1. günden Gün 3'e, n = 20; iki yönlü tekrarlanan önlemler ANOVA, işaret × deneme etkileşimi, F (13, 266) = 20.81; P < 0.001; Şekil 2B). Post-hoc Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi, korku şartlandırması Day 1 (deneme 4 ve 5, P < 0.001) ve Day 2'de (tüm denemeler, P < 0.001) ton ve beyaz gürültü kaynaklı donma arasında önemli bir fark olduğunu ortaya koymaktadır. C) 3. Günde SCS öncesi, ton, beyaz gürültü ve şok dönemleri sırasında atlama kaçış yanıtlarının sayısının karşılaştırılması. Tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi, beyaz gürültü ve şok sırasında kaçış atlayışlarının ton dönemine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi (sırasıyla P < 0.01 ve P < 0.001). D) 3. günde ton ve beyaz gürültü sunumu sırasında uçuş puanlarının karşılaştırılması. Beyaz gürültü döneminde 3. günde önemli ölçüde daha yüksek uçuş puanlarına dikkat edin (P < 0.001, Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler imzalı derece testi). E) 3. Günde SCS öncesi, ton ve beyaz gürültü sırasında % donma karşılaştırması. 3. günde donma davranışı, ton ve beyaz gürültünün önemli etkisini ortaya çıkarır (tek yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA, F = 56.82, P<0.01). Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi, ton sunumunun SCS öncesi süreye (P < 0.01) karşılık % donma olasılığını önemli ölçüde artırdığını, % donma ise SCS öncesi ve ton sürelerine kıyasla önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (her ikisi de P < 0.001). Temsili deneme açısından veriler, 3. günde farede ton ve beyaz gürültü sunumunu takiben uçuş (F) ve donma(G) davranışının geçişlerini gösterir. Temsil edilen değerler SEM ± anlamına gelir. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Ön hazırlık, Ön pozlama. Paneller A-E, Fadok ve ark., 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Uçuş şartlandırmasını takiben yok olma ve geri çağırma (Gün 4).
A)Yok olma eğitimi sırasında uçuş puanlarının karşılaştırılması, koşullu uçuşun hızla yok olduğunu göstermiştir (n = 12; 16 deneme, iki yönlü tekrarlanan önlemler ANOVA, işaret × deneme etkileşimi, F(15,165) = 3,05, P < 0,01). Dört denemenin ilk bloğundan (deneme 1-4) uçuş puanları, tona kıyasla beyaz gürültü için önemli ölçüde daha yüksek gözlendi (P < 0.05, Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler imzalı derece testi). B)Donma karşılaştırması donma üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etki gösterdi (%) beyaz gürültüyü takip ederek (n = 12; 16 deneme, iki yönlü tekrarlanan önlemler ANOVA, işaret × deneme etkileşimi, F(15,165) = 3,55, P < 0,01). Yok olma sırasında dört denemenin ilk bloğunun (deneme 1-4) donması, beyaz gürültü döneminde tona kıyasla önemli ölçüde daha düşük bulunmuştur (Eşleştirilmiş t-testi, P < 0.01). C) Bağlamdaki değişiklikler uçuş puanlarını önemli ölçüde etkiler (n = 8; 4 deneme, iki yönlü tekrarlanan önlemler ANOVA, işaret × deneme etkileşimi, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Uçuş puanları, nötr bağlamdaki ton dönemine kıyasla beyaz gürültü sırasında önemli ölçüde azaldı (iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi, P < 0.01) D). Alma sırasında denemeler arasında donma yanıtları da anlamlıydı (n = 8, 4 deneme, iki yönlü tekrarlanan önlemler ANOVA, F işaretinin etkisi(1,7) = 27,67, P < 0,01). WN'nin nötr bağlamda maruz kalması, tona kıyasla donma yanıtlarını önemli ölçüde artırdı (iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi, P < 0.001). Temsil edilen değerler SEM ± anlamına gelir. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Paneller A-D, Fadok ve ark. 2017'den itibaren değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan ses ve şok parametreleri bu protokolün önemli unsurlarıdır. Bu nedenle, deneylere başlamadan önce şok genliği ve ses basıncı seviyesini test etmek önemlidir. Korku şartlandırma çalışmaları tipik olarak 70-80 dB ses basıncı seviyeleri ve 0.1-1 mA şok yoğunluğu18kullanır; bu nedenle, açıklanan parametreler geleneksel korku şartlandırma paradigmalarının sınırları içindedir. Önceki bir CS-only (ayakçık yok) kontrol deneyinde, farelerde uçuş veya donma tepkilerini gözlemlemedik, bu da işitsel uyaranların açıklandığı gibi sunulduğunda averil olmadığını gösteriyor15. Beyaz gürültünün dB seviyesinin 80 dB'nin üzerine çıkarılması doğuştan nefrete neden olabilir. Bununla birlikte, 75 dB'de sunulan gürültü uyaranları, farelerde bastırılmış davranışsal aktivite şeklinde stres ortaya çıkarmaz19.
SCS'yi oluşturan işitsel uyaranlar dikkatlice seçilmelidir. Önceki çalışmamızda, beyaz gürültü ile tek CS koşullandırmanın, saf bir ton ile koşullandırmadan daha yüksek uçuş puanları neden olduğunu belirledik15. Bu, bu protokolde uyaran belirginliğinin önemini göstermektedir20. Bununla birlikte, yeni bir çalışma, SCS dizisinin tersine çevrilmesiyle (beyaz gürültü tonu) koşullandırmanın tona uçuş ve beyaz gürültüye donma ile sonuçlendiğinigöstermiştir 21. Bu veriler, ipuçlarının öğrenilen zamansal ilişkisinin de önemli bir faktör olduğunu onaylar.
Kafes değişiklikleri potansiyel bir stres kaynağı olduğundan, en son kafes değişiminden en az 2 gün sonra kondisyona başlanmanız önerilir. Çalışma yapılan farelerde stresin etkisini daha da azaltmak için, dışkı ve idrar kokusu da dahil olmak üzere önceki deneklerden kalan koku ipuçlarını azaltmak için uygun özen verilmelidir. Bu nedenle, her fareden önce ve sonra odanın temizlenmesi çok önemlidir. Diğer potansiyel rahatsızlık kaynaklarından kaçınmak için, bu protokolü devam eden diğer deneylerden ayrılmış bir odada yapmak en iyisidir. Fareler çok düşük taban çizgisi dondurma sergilemelidir15. Deneysel koşulları test etmek için, her laboratuvar her bağlamda temel dondurmayı test etmek için bir pilot deney yapmalıdır.
Fadok ve ark. (2017)15tarafından kullanılan C57BL / 6J ve diğer transgenik çizgiler dışında, bu yöntem diğer fare ve sıçan suşlarına adaptasyon için uygun olmalıdır20,21. Son veriler (Borkar ve ark. 2020)22, hem erkek hem de dişi farelerin karşılaştırılabilir uçuş yanıtları gösterdiğini, bu nedenle paradigmanın her iki cinsiyet için de uygun olduğunu göstermektedir. Adım 2.1.2'de belirtildiği gibi, yüksek yoğunluklu şoklara yanıt olarak, fareler çok yükseğe atlar, böylece farelerin bağlamdan kaçmasını önlemek için odanın yüksekliğini dikkatlice seçerler. İşaretlerin ve şok uyaranlarının tutarlı ve doğru zamanlamasını sağlamak da önemlidir. Hem AC hem de DC şokları etkilidir; bununla birlikte, DC şokları kullanırken, AC şoklarınınkine benzer uçuş puanlarına ulaşmak için ayakçık yoğunluğunu artırmak gerekebilir. DC şokları elektrofizyolojik kayıtlar üzerinde daha az zararlı bir etkiye sahip olduğundan, elektrofizyoloji verileri gerektiren çalışmalar için DC şokunun kullanılması önerilir. Ayakçık yoğunluğunun azaltılmasının uçuş tepkisinin yoğunluğunu azaltabileceğini belirtmek önemlidir.
Protokolde belirtildiği gibi, uçuş puanları, ton ve beyaz gürültü sırasında hız verilerinin scs öncesi bireysel deneme öncesi hız değerleriyle bölünmesiyle hesaplanır. Bununla birlikte, bir fare SCS öncesi sırasında son derece yüksek donma seviyeleri gösterirse, sonuçta elde eden uçuş puanları çok yüksek olabilir, böylece veri değişkenliğini artırabilir. Bu, oturumun başındaki 3 dakikalık temel dönemdeki ortalama hız verileri veya bireysel deneme Öncesi SCS değerleri yerine genel SCS öncesi ortalama hızı (ortalama 5 deneme) kullanılarak farklı bir taban çizgisi ölçümü kullanılarak atlatılabilir.
Tehdide esnek ve hızlı davranışsal adaptasyon hayatta kalmak için çok önemlidir. Klasik korku şartlandırma protokollerinin çoğu, korku öğreniminin tek belirleyicisi olarak donmaya neden olan koşulları kullanır. Bu protokolün yararı, denekler içindeki karmaşık savunma durumu geçişlerinin incelenmesine izin sağlamasıdır. Daha önce, bu model davranışsal geçişlerin merkezi amigdala15,23'teki lokal tekrarlayan inhibitör devreler tarafından işlendiğini keşfetmek için kullanılmıştır. Bu paradigma aynı zamanda araştırmacıların savunma davranışının seçimi için kortiko-talamik devreleri aydınlatmasını sağladı21. Bu çalışmalar, bu yöntemin bir konudaki savunma davranışları arasındaki hızlı geçişlerin sinir devresi kontrolünü araştıran çalışmaları kolaylaştıracağını göstermektedir. Bu, anksiyete, panik bozukluk veya TSSB24,25'innörobiyolojik temellerinin daha iyi anlaşılması için potansiyeluygulamalarasahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Louisiana Vekiller Kurulu tarafından Vekiller Kurulu destek fonu (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü tarafından R01MH122561 ödül numarası altında desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
- Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
- LeDoux, J.
- Maren, S.
- Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
- Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
- Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
- Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
- National Institute of Mental Health.
- Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
- Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
- Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
- Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
- Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
- Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C.
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
- Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
- Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
- Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
- Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
- Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).
