Summary
Defensive adfærdsmæssige reaktioner er betinget af trusselsintensitet, nærhed og kontekst af eksponering. Baseret på disse faktorer udviklede vi et klassisk konditioneringsparadigme, der fremkalder klare overgange mellem konditioneret frysning og flyveadfærd inden for de enkelte. Denne model er afgørende for forståelsen af de patologier, der er involveret i angst, panik og posttraumatisk stresslidelser.
Abstract
Frygt- og angstrelateret adfærd bidrager væsentligt til en organismes overlevelse. Men overdrevne defensive reaktioner på opfattet trussel er karakteristiske for forskellige angstlidelser, som er den mest udbredte form for psykisk sygdom i USA. At opdage de neurobiologiske mekanismer, der er ansvarlige for defensiv adfærd, vil hjælpe med udviklingen af nye terapeutiske interventioner. Pavlovian frygt conditioning er en udbredt laboratorium paradigme til at studere frygt-relaterede læring og hukommelse. En væsentlig begrænsning af traditionelle Pavlovian frygt conditioning paradigmer er, at indefrysning er den eneste defensive overvåget adfærd. Vi har for nylig udviklet en modificeret Pavlovian frygt conditioning paradigme, der giver os mulighed for at studere både konditioneret frysning og flyvning (også kendt som flugt) adfærd inden for de enkelte. Denne model anvender højere intensitet footshocks og et større antal bindinger mellem den betingede stimulus og ubetinget stimulus. Derudover er denne konditioneret flyvning paradigme udnytter seriel præsentation af ren tone og hvid støj auditive stimuli som konditioneret stimulus. Efter konditionering i dette paradigme udviser mus fryseadfærd som reaktion på tonestimuleringen og flyresponser under den hvide støj. Denne konditioneringsmodel kan anvendes til undersøgelse af hurtige og fleksible overgange mellem adfærdsmæssige reaktioner, der er nødvendige for overlevelse.
Introduction
Frygt er en evolutionært bevaret adaptiv reaktion på en umiddelbar trussel1,2. Mens organismer har medfødte defensive reaktioner på en trussel, er lærde foreninger afgørende for at fremkalde passende defensive reaktioner på stimuli, der forudsiger fare3. Dysregulering i hjernekredsløb, der styrer defensive reaktioner, vil sandsynligvis bidrage til maladaptive reaktioner forbundet med flere invaliderende angstlidelser, såsom posttraumatisk stresslidelse (PTSD), panikangst4, og specifikke fobier5,6. Prævalensen i USA for angstlidelser er 19,1% for voksne og 31,9% hos unge7,8. Byrden af disse sygdomme er ekstremt høj på den daglige rutine af enkeltpersoner og har en negativ indvirkning på deres livskvalitet.
I løbet af de sidste mange årtier har Pavlovian frygt conditioning fungeret som et kraftfuldt modelsystem for at få enorm indsigt i de neurale mekanismer, der ligger til grund for frygtrelateret læring og hukommelse9,10,11. Pavlovian frygt conditioning indebærer parring af en konditioneret stimulus (CS, såsom en auditiv stimulus) med en aversiv ubetinget stimulus (USA; for eksempel en elektrisk footshock)12. Fordi frysning er den dominerende adfærd fremkaldt og målt i standard Pavlovian conditioning paradigmer, de neurale kontrolmekanismer af aktive former for defensiv adfærd såsom flugt / flugt svar forbliver stort set uudforsket. Tidligere undersøgelser viser, at forskellige former for defensiv adfærd, såsom flyvning, fremkaldes afhængigt af trusselsintensiteten, nærheden og kontekst13,14. Undersøgelse af, hvordan hjernen styrer forskellige typer af defensiv adfærd kan bidrage væsentligt til forståelsen af de neuronale processer, der er dysreguleret i frygt og angstlidelser.
For at imødekomme dette kritiske behov udviklede vi et modificeret Pavlovian-konditioneringsparadigme, der fremkalder flugt- og flugtspring ud over at fryse15. I dette paradigme konditioneres mus med en seriel sammensat stimulus (SCS) bestående af en ren tone efterfulgt af hvid støj. Efter to dages parring af SCS med et stærkt elektrisk fodskamtel udviser mus frysning som reaktion på tonekomponenten og flyvning under den hvide støj. Adfærdsmæssige skift mellem konditioneret frysning og flyvning adfærd er hurtige og konsekvente. Interessant nok udviser mus kun flyveadfærd, når den hvide støj CS præsenteres i samme sammenhæng som et tidligere leveret fodsælk (konditioneringskonteksten), men ikke i en neutral sammenhæng. I stedet dominerer frysende reaktioner i denne neutrale sammenhæng med betydeligt højere niveauer af frysning som reaktion på den hvide støj sammenlignet med tonen. Dette er i overensstemmelse med kontekstens rolle med hensyn til at modulere defensiv responsintensitet og med kontekstuel informations regulerende rolle i frygtrelateret læring og hukommelse , der findes i traditionelle trusselskonditioneringsparadigmer16,17. Denne model giver mulighed for direkte, inden for emnet sammenligninger af flere defensive adfærd i en kontekst-specifik måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende trin/procedurer blev gennemført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer efter godkendelse fra Tulane Universitys udvalg for institutionel dyrepleje og -brug.
1. Forberedelse af mus
- Brug voksne hanmus og/eller hunmus i alderen 3-5 måneder. I denne undersøgelse brugte vi mandlige C57BL/6J mus opnået fra Jackson Laboratory, men enhver musestamme fra en velrenommeret leverandør kan bruges.
- Mindst en uge før eksperimentet, huser alle mus individuelt på en 12:12 h lys / mørk cyklus i hele undersøgelsen. Giv musene ad libitum adgang til mad og vand.
- Udfør alle adfærdseksperimenter under lyscyklussen. Udfør alle sessioner på samme tidspunkt af dagen inden for en individuel kohorte. Hvis du f.eks. starter eksperimentet kl. 9 på dag 1, skal du fortsætte med at starte på det tidspunkt, indtil eksperimentet er afsluttet.
2. Udarbejdelse af studiematerialer
- Studiekontekster
- Vælg to forskellige sammenhænge, som eksperimenterne skal udføres i.
- Brug et cylindrisk kammer bestående af klart Plexiglas (diameter 30 cm) som kontekst A med et glat Plexiglasgulv. Kammerets højde skal være tilstrækkelig til at forhindre flugt (mindst 30 cm høj).
- Til kontekst B skal du bruge et rektangulært kabinet (25 cm x 30 cm) med et elektrisk gittergulv, der bruges til at levere vekselstrømsskælv. Højden af dette kammer er meget vigtig og skal være mindst 35 cm. høj. Alternativt kan du bruge et gennemsigtigt tag (sørg for, at video kan optages gennem dette materiale).
BEMÆRK: Brug et kammer med glatte vægflader, der let kan rengøres. - Brug en anden rengøringsløsning til at rense konteksterne. For eksempel ren kontekst A med 1% eddikesyre og kontekst B med 70% ethanol. Rengør konteksterne, før du begynder den første session, mellem test af individuelle mus og efter afslutningen af dagens sessioner. Dette er vigtigt for at fjerne de olfaktoriske signaler fra tidligere mus. Grundig rengøring vil også hjælpe med at forhindre urinskalering på stødgitteret, hvilket vil kompromittere konditioneringssessioner.
BEMÆRK: Rengøringsløsningerne fungerer også som en olfaktorisk cue, og brug derfor den samme rengøringsvæske til en bestemt kontekst. - Placer kontekst A eller kontekst B i en lyddæmpningsboks under de respektive studiesessioner.
- Lydgenerator
- Monter en overhead højttaler over konteksterne for at levere auditive stimuli ved 75 dB.
- Brug en programmerbar lydgenerator til at generere auditive stimuli på en foruddefineret tidsplan. Den rene tone på 7,5 kHz er en lyd med en sinusformet bølgeform, mens den hvide støj er et tilfældigt signal med samme intensitet ved forskellige frekvenser, der spænder fra 1-20.000 Hz.
- Brug TTL-impulser til at levere auditive stimuli og stødsignaler med tidsmæssig præcision.
BEMÆRK: Før forsøgene påbegyndes, måles lydintensitetseffekten fra den monterede højttaler i hvert kammer ved hjælp af en dB meter.
- Shocker: Tilslut shocker med elnettet gulvet, som bruges til at levere 0,9 mA AC stød. Definer hyppigheden, starten og varigheden af stød i et computerprogram. Levere hver chok stimulus i slutningen af hver SCS for en varighed på 1 s, i alt fem SCS-chok bindinger pr conditioning session.
3. Forberedelse af edb-program og videosporing
- Generer adfærdsprotokoller ved hjælp af kodning i et softwareprogram.
- I programmet skal du definere den serielle sammensatte stimulus SCS. Denne stimulus er en seriel præsentation af en 10 s ren tone (hver pip præsenteres for 500 ms, med en frekvens på 7,5 kHz og en hastighed på 1 Hz) og 10 s hvid støj (500 ms kerner ved 1 Hz).
- Definer de inter-trial intervaller (ITI), der præsenteres efter hvert forsøg, pseudorandomly.
- Under undersøgelsen skal du optage al museadfærd til video til efterfølgende analyse.
BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige frygt conditioning kasser kan ikke sættes op til at registrere adfærd gennem top-monteret kamera. Dette er meget vigtigt, da den optagede video bruges til at beregne vandret bevægelse, hastighed og samlet afstand, der rejses af dyret. - Hvis du vil indstille softwaresporingen, skal du placere en testmus i hver relevant kontekst, justere kontursporingsfølsomheden og definere tyngdepunktet. Dette vil sikre, at der erhverves pålidelige data om den relative stilling. Derudover skal du definere hele det kontekstområde, der er tilgængeligt for emnet.
BEMÆRK: Justeringen af konturstørrelsen for begge sammenhænge er vigtig, da ændringen i lysstyrken i forskellige sammenhænge vil ændre konturstørrelsen. - Der skal fastsættes en kalibreringskoefficient ved hjælp af kamrenes kendte størrelser og kameraets pixeldimensioner, som kan bruges til at beregne hastigheden (cm/s).
- Synkroniser dataopsamlingscomputerens tidsstempelhændelser med deres forekomster i realtid.
4. Adfærdseksperiment
- Tænd alt udstyr: computere, frygt conditioning box controller, shocker, og video og tidsstempel optagelse software. Sørg for, at instrumenterne er tændt i den rigtige rækkefølge.
- Kontroller alle funktioner, herunder tone, hvid støj og stødlevering, og konfigurer systemet til dataindsamling.
- Transporter dyrene fra deres opbevaringsrum til konditioneringsrummet. Lad dem akklimatisere der i mindst 10 minutter.
- Tag dyret ud fra hjemmeburet, læg det forsigtigt i den respektive sammenhæng, og aktiver derefter straks computerprogrammerne.
BEMÆRK: Initialiseringen af både frygt conditioning system og dataindsamling (tidsstempler, musesporing og videooptagelse) software på et tidspunkt kan synkroniseres ved hjælp af TTL puls medieret aktiveringer. - Prækonditionering/præeksponering
- På dag 1 skal motivet sættes ind i kontekst A (neutral kontekst). Lad det akklimatisere sig til kammeret i 3 min. (basisperioden), og udsæt det derefter for 4 forsøg med en SCS på 20 s samlede varighed (figur 1A-1B).
- Vedligehold en gennemsnitlig 90'er-pseudorandom ITI (område 80-100 s). Den samlede varighed af hver session før eksponering er 590 s.
- Frygt conditioning
- På dag 2 og dag 3 skal emnet placeres i kontekst B. Efter en 3 min baseline periode, udsætte emnet for fem parringer af SCS co-afslutning med en 1 s, 0,9 mA AC fodsælk.
- Opretholde en gennemsnitlig PSEUDORANDOM ITI på 120 s (område 90-150 s). Få hver konditioneringssession til at vare i alt 820 s (figur 1A).
- Afhængigt af forsøgets mål, forsøgsperson mus på dag 4 til enten en tilbagekaldelse test (se trin 4.7) eller at frygte udryddelse (se trin 4.8).
- Frygt tilbagekaldelse (for at teste kontekst afhængighed)
- På dag 4 skal du placere emnet i kontekst A. Efter 3 min baseline periode, præsentere det med 4 forsøg med SCS uden fodsælv, over 590 s.
- Vedligehold en gennemsnitlig 90'er-pseudorandom ITI (område 80-100 s).
- Frygt udryddelse
- På dag 4 skal emnet placeres i kontekst B. Efter 3 min baseline periode, nuværende 16 forsøg med SCS uden fodsælv, over 1910 s.
- Opretholde en gennemsnitlig 90'er pseudorandom ITI (område 60-120 s).
- Returner dyret til sit hjemmebur og gentag proceduren for alle dyrene.
5. Kvantificering af adfærd
- Få en observatør blind for eksperimentet til at score de optagede videoer for fryseadfærd ved hjælp af automatisk frysningsdetektortærskel efterfulgt af en frame-by-frame-analyse af pixelændringer.
BEMÆRK: Andre softwarepakker kan også bruges til at beregne frysning automatisk ved hjælp af 2 kamerasystem. Det er også muligt for en observatør manuelt at score fryseadfærd. - Definer frysning som et fuldstændigt ophør af kropslige bevægelser, bortset fra dem, der kræves for åndedræt, i mindst 1 s.
- Score hopper, når alle 4 af poterne forlader gulvet, hvilket resulterer i en lodret og / eller vandret bevægelse.
- Eksporter den markerede fil med fryse-, jump- og hændelsesmærker.
- Uddrag relevante hændelser (frysning og spring) fra definerede tidsperioder (f.eks. 10 s varighed af præ-SCS, tone og hvid støj for hvert forsøg).
- Ved hjælp af de udpakkede startstopvarigheder for hændelser i en regnearksfil skal du beregne varigheden af frysning (i s) ved at trække starttidspunktet fra sluttidspunktet fra de respektive prøveperioder.
- Repræsentere disse data trial-wise eller dag-kloge, ved at opsummere indefrysning varighed fra alle forsøg.
BEMÆRK: Afhængigt af formålet med undersøgelsen kan flyve- eller fryseadfærden scores og beregnes ud fra ethvert forsøg/varighed fra studiesessionen. - Summere det samlede antal spring fra en bestemt prøvevarighed.
- Uddrag den fil, der genereres af musesporingskoordinater fra ramme for ramme X-Y-aksebevægelse af musens tyngdepunkt, og beregn musens hastighed (cm/s).
BEMÆRK: Hastighedsdataene kan være til stede enten i cm/s- eller pixel-/s-format. Konverter pixelenheden til cm/s ved hjælp af den tomme værdi eller cm/pixel-værdi, der er defineret i videoen for den pågældende testkontekst (se afsnit 3.6). - Efter udvinding af hastighedsdata for ramme for rammebevægelse af dyret, baseret på videoens billedhastighed (helst 30 billeder / s), skal du beregne dyrets gennemsnitshastighed i en bestemt rammenummerbeslag (gang start- og sluttider i s med 30 for at få start- og slutrammenummeret).
- Beregn flyveresultaterne ved at dividere gennemsnitshastigheden under hvert SCS med gennemsnitshastigheden i løbet af de 10 s pre-SCS (baseline, BL) og derefter tilføje 1 point for hvert escape jump (speedCS/speedBL + # af spring). En flyvescore på 1 indikerer derfor ingen ændring i flyveadfærden fra perioden før SCS.
- Du kan også score videoer manuelt for andre adfærdsmåder såsom opdræt og pleje.
6. Statistisk analyse
- Analyser data til statistisk signifikans ved hjælp af statistisk analysesoftware. For alle test er definitionen af statistisk signifikans P<0.05.
- Kontroller dataene for normal distribution ved hjælp af Shapiro-Wilk-normalitetstesten (α=0,05).
- For at teste virkningen af signaler skal du foretage sammenligninger med parvise formål ved hjælp af den relevante parametriske (parrede t-test) eller ikke-parametriske test (Wilcoxon signeret rang).
- For at vurdere 2-vejs interaktion mellem faktorer (cue X-forsøg) skal du udføre en 2-vejs ANOVA efterfulgt af post-hoc-tests (f.eks. Bonferronis multiple sammenligningstest / Tukeys test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i diagrammet (Figur 1A) starter sessionen med præeksponering (dag 1), efterfulgt af frygtkonditionering (dag 2 og 3) og derefter enten udryddelse eller genfinding (dag 4).
Præsentationer af SCS i sessionen før eksponering (dag 1) gav ikke adgang til flyvning eller fryserespons hos musene (figur 2A-2B). Adfærdsanalyse under konditionering (dag 2 og 3) viste, at tonekomponenten i SCS forbedrede frysningen betydeligt sammenlignet med frysning under præ-SCS(figur 2B,2E). Flyresultaterne ændrede sig betydeligt på tværs af sessioner (dag 1 til dag 3, n = 20; Figur 2A). Mus viste højere hastighed og flere spring, og dermed større flyvning score, til den hvide støj cue i forhold til tonen (Figur 2C-2D). Mus viste en klar overgang af defensiv adfærd - udviser lavere flyveresultater under tonen efterfulgt af højere flyveresultater under hvid støj (Figur 2F) og omvendt for frysende svar (Figur 2G).
For at teste for effekten af trusselsnærhed og kontekst på konditioneret flyvning blev mus opdelt i to grupper: en gruppe gennemgik udryddelsestræning i konditioneringssammenhængen (Figur 3A-3B), og en anden gruppe blev testet for tilbagekaldelse af frygthukommelse ved at udsætte dem for SCS i en neutral sammenhæng (Figur 3C-3D). Mus udsat for de 16 forsøg med udryddelsestræning viste hurtig udryddelse af konditioneret flyvning (n = 12). Flyveresultaterne i den første blok på fire forsøg var højere under hvid støj sammenlignet med tonen (figur 3A). Flight adfærd blev ikke længere fremkaldt af enten cue i slutningen af udryddelsen session. Der var et generelt fald i tone-induceret frysning og en stigning i hvid støj-medieret frysning under udryddelsen session. Frysningen i den første blok af fire forsøg var betydeligt højere end tonen sammenlignet med den hvide støj(figur 3B). Dette tyder på, at umiddelbarheden af truslen er afgørende for flyvningens reaktion.
Flyveresponset blev reduceret på en kontekstafhængig måde. Eksponering for den hvide støj i den neutrale sammenhæng gav ikke flyvende (n = 8). I stedet fremkaldte hvide støjpræsentationer i den neutrale sammenhæng frysende reaktioner, som var højere end dem, der blev fremkaldt af tonen (Figur 3C-3D). Dette viser betydningen af sammenhæng i modulere defensive reagerer.
Figur 1: Undersøgelsesdesign til vurdering af fryse- og flyveparadigme.
A) Diagram over de adfærdsmæssige sessioner. B) Diagram, der beskriver sammensætningen af den serielle sammensatte stimulus (SCS) samt timingen af USA. C) Kontekst A - fungerede som en neutral kontekst og bruges under sessioner før eksponering og tilbagekaldelse. D) Kontekst B – bruges til frygt conditioning. Dette tal er blevet ændret fra Fadok et al. 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Betinget flyrespons.
A)Sammenligning af gennemsnitlige prøve-kloge flyvning score (n = 20) efter præsentation af tonen og hvid støj på tværs af Dag 1-3. Der er konstateret en betydelig ændring i flyveresultaterne på tværs af sessioner (dag 1 til dag 3; tovejs gentagne målinger ANOVA, cue × forsøgsinteraktion, F (13, 266) = 5,795; P<0.0001). Post-hoc Bonferroni's multiple sammenligning test afslører en betydelig forskel mellem tone og hvid støj induceret flyvning score på frygt conditioning Dag 1 (forsøg 4, P < 0,05) og Dag 2 (forsøg 2-5, P < 0,001). B)Sammenligning af gennemsnitlig frysning af forsøg i % i tone- og hvidstøjsperioderne på tværs af dag 1-3. Bemærk en statistisk signifikant ændring i % frysning på tværs af sessionerne (dag 1 til dag 3, n = 20; tovejs gentagne målinger ANOVA, cue × forsøgsinteraktion, F (13, 266) = 20,81; P < 0,001; Figur 2B). Post-hoc Bonferroni's multiple sammenligning test afslører en betydelig forskel mellem tone og hvid støj induceret frysning på frygt conditioning Dag 1 (forsøg 4 og 5, P < 0,001) og Dag 2 (alle forsøg, P < 0,001). C) Sammenligning af antallet af jump escape-svar under præ-SCS, tone, hvid støj og stødperioder på dag 3. Envejs-ANOVA efterfulgt af Bonferronis test med flere sammenligninger viste, at flugtspringene var betydeligt højere under hvid støj og stød sammenlignet med toneperioden (henholdsvis P < 0,01 og P < 0,001). D) Sammenligning af flyveresultater under præsentationen af tone og hvid støj på dag 3. Bemærk en betydeligt højere flyvescore på dag 3 i hvid støjperiode (P < 0,001, Wilcoxon matchede par underskrevet rang test). E) Sammenligning af % frysning under præ-SCS, tone og hvid støj på dag 3. Fryseadfærd på dag 3 afslører signifikant effekt af tone og hvid støj (envejs gentagne målinger ANOVA, F = 56,82, P<0,01). Bonferronis multiple comparisontest viste, at præsentationen af tonen øger % frysning i forhold til varigheden af præ-SCS betydeligt (P < 0,01), mens % frysning blev reduceret betydeligt i forhold til varigheden før SCS og tonen (begge P < 0,001). De repræsentative forsøgsvise data viser overgange af flyvning (F) og frysning (G) adfærd efter præsentationen af tone og hvid støj i musen på dag 3. De repræsenterede værdier betyder ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P <0,001. Pre-exp, Præ-eksponering. Paneler A-E er modificeret fra Fadok et al., 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Udryddelse og tilbagekaldelse efter flyvekonditionering (dag 4).
A)Sammenligning af flyveresultater under udryddelsestræning viste hurtig udryddelse af konditioneret flyvning (n = 12; 16 forsøg, tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA, cue × forsøgsinteraktion, F(15,165) = 3,05, P < 0,01). Flight scores fra første blok af fire forsøg (forsøg 1-4) af udryddelse observeret betydeligt højere for hvid støj i forhold til tonen (P < 0,05, Wilcoxon matchede par underskrevet-rank test). B)Sammenligningen af frysepunktet viste en statistisk signifikant virkning på frysningen (%) efter hvid støj (n = 12; 16 forsøg, tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA, cue × forsøg interaktion, F(15,165) = 3,55, P < 0,01). Indefrysningen for den første blok af fire forsøg (forsøg 1-4) under udryddelse viste sig at være betydeligt lavere i hvid støj periode i forhold til tonen (Parret t-test, P < 0,01). C) Ændringer i konteksten påvirker flyveresultaterne betydeligt (n = 8; 4 forsøg, tovejs gentagne målinger ANOVA, cue × forsøgsinteraktion, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Flyvescores reduceret betydeligt under hvid støj sammenlignet med toneperioden i den neutrale kontekst (tosidet parret t-test, P < 0,01) D). Frysende reaktioner på tværs af forsøg under hentning var også signifikante (n = 8, 4 forsøg, tovejs gentagne målinger ANOVA, effekt af cue F(1,7) = 27,67, P < 0,01). Eksponeringen af WN i neutral sammenhæng øgede fryseresponserne betydeligt sammenlignet med tonen (tosidet parret t-test, P < 0,001). De repræsenterede værdier betyder ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P <0,001. Paneler A-D er modificeret fra Fadok et al. 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne lyd- og stødparametre er vigtige elementer i denne protokol. Det er derfor afgørende at teste stødforstærkning og lydtrykniveau, før forsøgene påbegyndes. Frygtkonditioneringsundersøgelser bruger typisk 70-80 dB lydtrykniveauer og 0,1-1 mA-stødintensitet18; Således er de beskrevne parametre inden for rammerne af traditionelle frygt conditioning paradigmer. I et tidligere CS-kun (ingen fodsæk) kontroleksperiment observerede vi ikke flyve- eller fryseresponser i musene, hvilket indikerer, at de auditive stimuli ikke er afvisende, når de præsenteres som beskrevet15. Forøgelse af dB-niveauet for den hvide støj over 80 dB kan fremkalde medfødt aversion. Imidlertid fremkalder støjstimuli præsenteret ved 75 dB ikke stress i form af undertrykt adfærdsaktivitet hos mus19.
De auditive stimuli, der udgør SCS, skal vælges omhyggeligt. I vores tidligere undersøgelse fastslog vi, at single-CS-konditionering med hvid støj fremkalder højere flyveresultater end konditionering med en ren tone15. Dette illustrerer betydningen af stimulussalience i denne protokol20. En nylig undersøgelse viste imidlertid, at konditionering med en vending af SCS-sekvensen (hvid støjtone) resulterer i flyvning til tonen og frysning til den hvide støj21. Disse data bekræfter, at cues lærte tidsmæssige forhold også er en vigtig faktor.
Da burskift er en potentiel kilde til stress, anbefales det at begynde at konditionere mindst 2 dage efter den seneste burændring. For yderligere at minimere virkningen af stress hos de mus, der gennemgår undersøgelsen, bør der udvises passende omhu for at reducere de olfaktoriske signaler, der er tilbage fra tidligere forsøgspersoner, herunder lugten af afføring og urin. Derfor er rengøring af kammeret før og efter hver mus afgørende. For at undgå andre potentielle kilder til forstyrrelser er det bedst at udføre denne protokol i et rum adskilt fra andre igangværende eksperimenter. Mus bør udvise meget lav baseline frysning15. For at teste forsøgsbetingelserne bør hvert laboratorium gennemføre et pilotforsøg for at teste baselinefrysning i hver sammenhæng.
Bortset fra C57BL/6J og andre transgene linjer, der anvendes af Fadok et al. (2017)15, bør denne metode være egnet til tilpasning til andre stammer af mus og rotter20,21. Nylige data (Borkar et al. 2020)22 tyder på, at både mandlige og kvindelige mus viser sammenlignelige flyveresponser, derfor er paradigmet velegnet til begge køn. Som nævnt i trin 2.1.2, som reaktion på højintensitetschok, hopper mus meget højt og vælger dermed omhyggeligt kammerets højde for at forhindre musene i at undslippe konteksten. Det er også vigtigt at sikre en konsekvent og præcis timing af signaler og chok stimuli. Både AC- og DC-stød er effektive; Når du bruger DC-stød, kan det dog være nødvendigt at øge footshock-intensiteten for at nå samme flyvescore som for AC-stød. Da DC-stød har en mindre skadelig virkning på elektrofysiologiske optagelser, anbefales det at bruge DC-stød til undersøgelser, der kræver elektrofysiologidata. Det er vigtigt at bemærke, at en reduktion af fodskælvens intensitet kan nedsætte intensiteten af flyveresponsen.
Som angivet i protokollen beregnes flyvescores ved at normalisere hastighedsdata under tone og hvid støj ved at dividere dem med individuelle pre-SCS-hastighedsværdier for forsøg. Men hvis en mus udviser ekstremt høje fryseniveauer under præ-SCS, kan de resulterende flyveresultater være meget høje, hvilket øger datavariationen. Dette kan omgås ved hjælp af en anden basismåling, f.eks.
Fleksibel og hurtig adfærdsmæssig tilpasning til trussel er afgørende for overlevelse. De fleste klassiske frygt conditioning protokoller bruge betingelser, der fremkalder frysning som en eneste afgørende faktor for frygt læring. Fordelen ved denne protokol er, at den giver mulighed for undersøgelse af komplekse defensive tilstandsovergange inden for. Tidligere blev denne model brugt til at opdage, at adfærdsmæssige overgange behandles af lokale tilbagevendende hæmmende kredsløb i den centrale amygdala15,23. Dette paradigme gjorde det også muligt for forskere at belyse kortico-thalamic kredsløb til udvælgelse af defensiv adfærd21. Disse undersøgelser viser, at denne metode vil lette undersøgelser, der undersøger neural kredsløbskontrol af hurtige overgange mellem defensiv adfærd inden for et emne. Dette har potentielle applikationer til udvikling af en bedre forståelse af det neurobiologiske fundament af angst, panikangst eller PTSD24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Louisiana Board of Regents gennem Bestyrelsen for Regents supportfond (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) og National Institute of Mental Health fra National Institutes of Health under tildelingsnummer R01MH122561. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
- Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
- LeDoux, J.
- Maren, S.
- Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
- Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
- Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
- Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
- National Institute of Mental Health.
- Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
- Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
- Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
- Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
- Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
- Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C.
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
- Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
- Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
- Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
- Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
- Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).
