Summary
Defensive Verhaltensreaktionen sind abhängig von Bedrohungsintensität, Nähe und Kontext der Exposition. Basierend auf diesen Faktoren haben wir ein klassisches Konditionierungsparadigma entwickelt, das klare Übergänge zwischen konditioniertem Einfrieren und Flugverhalten innerhalb einzelner Subjekte hervorruft. Dieses Modell ist entscheidend für das Verständnis der Pathologien, die an Angstzuständen, Panik und posttraumatischen Belastungsstörungen beteiligt sind.
Abstract
Angst- und Angstverhalten tragen wesentlich zum Überleben eines Organismus bei. Übertriebene abwehrende Reaktionen auf wahrgenommene Bedrohungen sind jedoch charakteristisch für verschiedene Angststörungen, die die häufigste Form psychischer Erkrankungen in den Vereinigten Staaten sind. Die Entdeckung der neurobiologischen Mechanismen, die für defensive Verhaltensweisen verantwortlich sind, wird bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen helfen. Pavlovian Angst Konditionierung ist ein weit verbreitetes Labor paradigma, um Angst-bezogenes Lernen und Gedächtnis zu studieren. Eine große Einschränkung der traditionellen Pavlovian Angst Konditionierung Paradigmen ist, dass das Einfrieren ist das einzige defensive Verhalten überwacht. Wir haben vor kurzem ein modifiziertes Pavlovian Fear Conditioning Paradigma entwickelt, das es uns ermöglicht, sowohl konditioniertes Einfrieren als auch Fluchtverhalten (auch als Flucht) Verhalten innerhalb einzelner Probanden zu studieren. Dieses Modell verwendet eine höhere Intensität Fußschocks und eine größere Anzahl von Paarungen zwischen dem konditionierten Stimulus und unkonditionierten Stimulus. Darüber hinaus nutzt dieses konditionierte Flugparadigma die serielle Darstellung von reinem Ton und weißen Rauschen-Hörreizen als konditionierten Stimulus. Nach der Konditionierung in diesem Paradigma zeigen Mäuse ein gefrierendes Verhalten als Reaktion auf den Tonreiz und Flugreaktionen während des weißen Rauschens. Dieses Konditionierungsmodell kann auf die Untersuchung von schnellen und flexiblen Übergängen zwischen Verhaltensreaktionen angewendet werden, die für das Überleben notwendig sind.
Introduction
Angst ist eine evolutionär konservierte adaptive Antwort auf eine unmittelbare Bedrohung1,2. Während Organismen angeborene abwehrende Reaktionen auf eine Bedrohung besitzen, sind gelehrte Assoziationen entscheidend, um geeignete defensive Reaktionen auf Reize zu auslösen, die die Gefahr vorhersagen3. Dysregulation in Gehirnkreisen, die defensive Reaktionen steuern, trägt wahrscheinlich zu maladaptiven Reaktionen bei, die mit multiplen schwächenden Angststörungen verbunden sind, wie posttraumatische Belastungsstörung (PTSD), Panikstörung4und spezifische Phobien5,6. Die Prävalenzrate in den Vereinigten Staaten für Angststörungen beträgt 19,1% bei Erwachsenen und 31,9% bei Jugendlichen7,8. Die Belastung durch diese Krankheiten ist extrem hoch für den Alltag des Einzelnen und wirkt sich negativ auf ihre Lebensqualität aus.
In den letzten Jahrzehnten hat Pavlovian Angst konditionierung als ein leistungsfähiges Modellsystem gedient, um enorme Einblicke in die neuronalen Mechanismen zugrunde angstbezogenes Lernen und Gedächtnis9,10,11zu gewinnen. Pavlovian Angst Konditionierung beinhaltet die Kombination eines konditionierten Stimulus (CS, wie ein auditiver Stimulus) mit einem aversiven unkonditionierten Stimulus (US; zum Beispiel ein elektrischer Fußschock)12. Da das Einfrieren das vorherrschende Verhalten ist, das in den üblichen Pavlovian-Konditionierungsparadigmen evoziert und gemessen wird, bleiben die neuronalen Steuerungsmechanismen aktiver Formen des Abwehrverhaltens wie Flucht-/Flugreaktionen weitgehend unerforscht. Frühere Studien zeigen, dass verschiedene Formen des Abwehrverhaltens, wie z. B. Flucht, in Abhängigkeit von der Bedrohungsintensität, Der Nähe und dem Kontext13,14evoziert werden. Das Studium, wie das Gehirn verschiedene Arten von Abwehrverhalten steuert, kann erheblich zum Verständnis der neuronalen Prozesse beitragen, die bei Angst- und Angststörungen dysreguliert sind.
Um diesem kritischen Bedürfnis gerecht zu werden, haben wir ein modifiziertes Pavlovian Konditionierungsparadigma entwickelt, das neben dem Einfrierenvon 15auch Flucht- und Fluchtsprünge hervorruft. In diesem Paradigma werden Mäuse mit einem seriellen zusammengesetzten Stimulus (SCS) konditioniert, der aus einem reinen Ton besteht, gefolgt von weißem Rauschen. Nach zwei Tagen der Paarung des SCS mit einem starken elektrischen Fußschock zeigen Mäuse Frieren als Reaktion auf die Tonkomponente und den Flug während des weißen Rauschens. Verhaltensschalter zwischen konditioniertem Gefrieren und Flugverhalten sind schnell und konsistent. Interessanterweise zeigen Mäuse Flugverhalten nur, wenn das weiße Rauschen CS im gleichen Kontext wie ein zuvor gelieferter Fußschock (der Konditionierungskontext) dargestellt wird, aber nicht in einem neutralen Kontext. Stattdessen dominieren gefrierende Reaktionen in diesem neutralen Kontext, mit deutlich höheren Niveaus des Einfrierens als Reaktion auf das weiße Rauschen im Vergleich zum Ton. Dies steht im Einklang mit der Rolle des Kontextes bei der Modulation der Defensive Response Intensität und mit der regulatorischen Rolle der kontextbezogenen Information in angstbezogenen Lernen und Gedächtnis in traditionellen Bedrohungskonditionierung Paradigmengefunden 16,17gefunden. Dieses Modell ermöglicht direkte, innerhalb des Subjekts durchgeführte Vergleiche mehrerer Defensivverhalten auf kontextspezifische Weise.
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Protocol
Die folgenden Schritte/Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien nach Genehmigung durch das Institutional Animal Care & Use Committee der Tulane University durchgeführt.
1. Zubereitung von Mäusen
- Verwenden Sie männliche und/oder weibliche erwachsene Mäuse im Alter zwischen 3-5 Monaten. In der vorliegenden Studie verwendeten wir männliche C57BL/6J-Mäuse, die vom Jackson Laboratory gewonnen wurden, aber jeder Mausstamm von einem seriösen Lieferanten kann verwendet werden.
- Mindestens eine Woche vor dem Experiment, beherbergen alle Mäuse einzeln auf einem 12:12 h Licht/Dunkel-Zyklus während der gesamten Studie. Bieten Sie den Mäusen ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser.
- Führen Sie alle Verhaltensexperimente während des Lichtzyklus durch. Führen Sie alle Sitzungen zur gleichen Tageszeit innerhalb einer einzelnen Kohorte durch. Wenn Sie das Experiment beispielsweise am ersten Tag um 9 Uhr starten, beginnen Sie zu diesem Zeitpunkt, bis das Experiment abgeschlossen ist.
2. Erstellung von Studienmaterialien
- Studienkontexte
- Wählen Sie zwei verschiedene Kontexte aus, in denen die Experimente durchgeführt werden sollen.
- Verwenden Sie eine zylindrische Kammer aus klarem Plexiglas (Durchmesser 30 cm) als Kontext A, mit einem glatten Plexiglasboden. Die Höhe der Kammer sollte ausreichen, um ein Entweichen zu verhindern (mindestens 30 cm hoch).
- Verwenden Sie für Kontext B ein rechteckiges Gehäuse (25 cm x 30 cm) mit einem elektrischen Gitterboden, mit dem wechsellaufende Stromschocks geliefert werden. Die Höhe dieser Kammer ist sehr wichtig und sollte mindestens 35 cm hoch sein. Alternativ können Sie ein transparentes Dach verwenden (stellen Sie sicher, dass Videos über dieses Material aufgezeichnet werden können).
HINWEIS: Verwenden Sie eine Kammer mit glatten Wandflächen, die leicht gereinigt werden können. - Verwenden Sie eine andere Reinigungslösung, um die Kontexte zu säubern. Zum Beispiel sauberer Kontext A mit 1% Essigsäure und Kontext B mit 70% Ethanol. Reinigen Sie die Kontexte, bevor Sie mit der ersten Sitzung, zwischen dem Testen einzelner Mäuse und nach Abschluss der Tagessitzungen beginnen. Dies ist wichtig, um die olfaktorischen Hinweise von früheren Mäusen zu entfernen. Eine gründliche Reinigung wird auch dazu beitragen, urinierende Skalierung auf dem Schockgitter zu verhindern, was Konditionierungssitzungen beeinträchtigt.
HINWEIS: Die Reinigungslösungen dienen auch als geruchsbezogener Hinweis, daher verwenden Sie die gleiche Reinigungsflüssigkeit für einen bestimmten Kontext. - Platzieren Sie Kontext A oder Kontext B während der jeweiligen Studiensitzungen in einer schalldämpfenden Box.
- Audiogenerator
- Montieren Sie einen Overhead-Lautsprecher über den Kontexten, um auditive Reize bei 75 dB zu liefern.
- Verwenden Sie einen programmierbaren Audiogenerator, um auditive Reize nach einem vordefinierten Zeitplan zu erzeugen. Der 7,5 kHz reine Ton ist ein Klang mit einer sinusförmigen Wellenform, während das weiße Rauschen ein zufälliges Signal mit gleicher Intensität bei verschiedenen Frequenzen ist, das von 1-20.000 Hz reicht.
- Verwenden Sie TTL-Impulse, um akustische Reize und Schocksignale mit zeitlicher Präzision zu liefern.
HINWEIS: Messen Sie vor Beginn der Experimente die Schallintensitätsausgabe des montierten Lautsprechers in jeder Kammer mit einem dB-Meter.
- Dämpfer: Schließen Sie den Dämpfer mit dem elektrischen Netzboden an, mit dem der 0,9 mA AC-Schock geliefert wird. Definieren Sie die Häufigkeit, den Beginn und die Dauer von Schocks in einem Computerprogramm. Liefern Sie jeden Schockreiz am Ende jedes SCS für eine Dauer von 1 s, insgesamt fünf SCS-Schockpaarungen pro Konditionierungssitzung.
3. Vorbereitung von Computerprogramm und Video-Tracking
- Generieren Sie Verhaltensprotokolle mithilfe der Codierung in einem Softwareprogramm.
- Definieren Sie im Programm den seriellen zusammengesetzten Stimulus SCS. Dieser Stimulus ist eine serielle Darstellung eines 10 s reinen Tons (jeder Pip wird für 500 ms, bei einer Frequenz von 7,5 kHz und einer Rate von 1 Hz) und 10 s weißem Rauschen (500 ms Pips bei 1 Hz) dargestellt.
- Definieren Sie die Inter-Trial-Intervalle (ITI), die nach jeder Studie pseudozufällig dargestellt werden.
- Zeichnen Sie während der Studie das gesamte Mausverhalten für die nachfolgende Analyse auf Video auf.
HINWEIS: Kommerziell erhältliche Angstkonditionierungsboxen können möglicherweise nicht eingerichtet werden, um das Verhalten über die oben montierte Kamera aufzuzeichnen. Dies ist sehr wichtig, da das aufgenommene Video verwendet wird, um horizontale Bewegung, Geschwindigkeit und Gesamtstrecke des Tieres zu berechnen. - Um die Softwareverfolgung einzustellen, platzieren Sie eine Testmaus in jedem relevanten Kontext, passen Sie die Konturverfolgungsempfindlichkeit an und definieren Sie den Schwerpunkt. Dadurch wird die Erfassung zuverlässiger Daten über die relative Position sichergestellt. Definieren Sie außerdem den gesamten Kontextbereich, der für das Thema zugänglich ist.
HINWEIS: Die Anpassung der Konturgröße für beide Kontexte ist wichtig, da die Helligkeitsänderung in verschiedenen Kontexten die Konturgröße ändert. - Bestimmen Sie einen Kalibrierkoeffizienten anhand der bekannten Größen der Kammern und der Pixelabmessungen der Kamera, die zur Berechnung der Geschwindigkeit (cm/s) verwendet werden können.
- Synchronisieren Sie die Zeitstempelereignisse des Datenerfassungscomputers mit ihren Echtzeitereignissen.
4. Verhaltensexperiment
- Schalten Sie alle Geräte ein: Computer, Angst-Konditionierungsbox-Controller, Schocker und Video- und Zeitstempel-Aufnahmesoftware. Stellen Sie sicher, dass die Instrumente in der entsprechenden Reihenfolge eingeschaltet sind.
- Überprüfen Sie alle Funktionen, einschließlich Ton, Weißrauschen und Stoßzustellung, und richten Sie das System für die Datenerfassung ein.
- Transportieren Sie die Tiere aus ihrem Abstellraum in den Konditionierungsraum. Lassen Sie sie dort für mindestens 10 min akklimatisieren.
- Nehmen Sie das Tier aus dem heimischen Käfig, legen Sie es vorsichtig in den jeweiligen Kontext und aktivieren Sie dann sofort die Computerprogramme.
HINWEIS: Die Initialisierung sowohl der Angstkonditionierungssystem als auch der Datenerfassung (Zeitstempel, Mausverfolgung und Videoaufzeichnung) kann gleichzeitig mit TTL-Puls-vermittelten Aktivierungen synchronisiert werden. - Vorkonditionierung/Vorbelichtung
- Stellen Sie das Thema an Tag 1 in den Kontext A (neutraler Kontext). Lassen Sie es sich 3 min lang (der Basiszeitraum) an die Kammer akklimatisieren und setzen Sie es dann 4 Versuchen eines SCS mit einer Gesamtdauer von 20 s aus (Abbildung 1A-1B).
- Halten Sie einen durchschnittlichen Pseudozufalls-ITI von 90 s (Bereich 80-100 s). Die Gesamtdauer jeder Pre-Exposure-Sitzung beträgt 590 s.
- Angstkonditionierung
- Platzieren Sie das Thema an Tag 2 und Tag 3 in Kontext B. Nach einer 3-min-Baseline-Periode, setzen Sie das Subjekt auf fünf Paarungen des SCS Co-Abschluss mit einem 1 s, 0,9 mA AC Fußschock.
- Aufrechterhaltung eines durchschnittlichen Pseudozufalls ITI mit 120 s (Bereich 90-150 s). Lassen Sie jede Konditionierungssitzung für insgesamt 820 s dauern (Abbildung 1A).
- Je nach Ziel des Experiments, unterziehen Sie Mäuse an Tag 4 entweder einem Rückruftest (siehe Schritt 4.7) oder um das Aussterben zu befürchten (siehe Schritt 4.8).
- Angstrückruf (zum Testen der Kontextabhängigkeit)
- Platzieren Sie das Thema an Tag 4 in Kontext A. Nach der 3 min Baseline-Periode, präsentieren Sie es mit 4 Tests der SCS ohne Fußschock, über 590 s.
- Halten Sie einen durchschnittlichen Pseudozufalls-ITI von 90 s (Bereich 80-100 s).
- Angst vor dem Aussterben
- Stellen Sie das Thema an Tag 4 in den Kontext B. Nach der 3 min Baseline-Periode, präsentieren 16 Versuche der SCS ohne Fußschock, über 1910 s.
- Halten Sie einen durchschnittlichen Pseudozufalls-ITI von 90 s (Bereich 60-120 s).
- Bringen Sie das Tier in seinen Heimischen Käfig zurück und wiederholen Sie den Vorgang für alle Tiere.
5. Quantifizierung des Verhaltens
- Lassen Sie einen Beobachter blind für das Experiment die aufgenommenen Videos für das Gefrierverhalten mit automatischer Gefriermelderschwelle punkten, gefolgt von einer Frame-by-Frame-Analyse von Pixeländerungen.
HINWEIS: Andere Softwarepakete können auch verwendet werden, um das Einfrieren automatisch mit 2 Kamerasystem zu berechnen. Es ist auch möglich, dass ein Beobachter das Einfrieren manuell einnimmt. - Definieren Sie das Einfrieren als vollständige Einstellung der Körperbewegungen, mit Ausnahme der für die Atmung erforderlichen, für mindestens 1 s.
- Score springt, wenn alle 4 Pfoten den Boden verlassen, was zu einer vertikalen und/oder horizontalen Bewegung führt.
- Exportieren Sie die markierte Datei mit Gefrier-, Sprung- und Ereignismarkierungen.
- Extrahieren Sie relevante Ereignisse (Einfrieren und Sprünge) aus definierten Zeiträumen (z. B. 10 s Dauer von Pre-SCS, Ton und Weißrauschen, für jede Studie).
- Berechnen Sie anhand der extrahierten Start-Stopp-Dauern von Ereignissen in einer Tabellenkalkulationsdatei die Dauer des Einfrierens (in s), indem Sie die Startzeit von der Endzeit von den jeweiligen Testzeiträumen subtrahieren.
- Stellen Sie diese Daten versuchsweise oder tagweise dar, indem Sie die Gefrierdauer aus allen Versuchen zusammenfassen.
HINWEIS: Je nach Zweck der Studie können flug- oder gefrierende Verhaltensweisen aus jeder Studie/Dauer aus der Studiensitzung bewertet und berechnet werden. - Summiert die Gesamtzahl der Sprünge aus einer bestimmten Testdauer.
- Extrahieren Sie die Datei, die durch Mausverfolgungskoordinaten erzeugt wird, aus Frame für Frame X-Y-Achsenbewegung des Schwerpunkts der Maus und berechnen Sie die Geschwindigkeit der Maus (cm/s).
HINWEIS: Die Geschwindigkeitsdaten können entweder im cm/s- oder Pixel/s-Format vorhanden sein. Konvertieren Sie die Pixel/s-Einheit in cm/s, indem Sie den im Video für diesen Testkontext definierten Zoll- oder Cm/Pixel-Wert verwenden (siehe Abschnitt 3.6). - Nach dem Extrahieren von Geschwindigkeitsdaten für die Frame-für-Frame-Bewegung des Tieres, basierend auf der Bildrate des Videos (vorzugsweise 30 Frames/s), berechnen Sie die Durchschnittsgeschwindigkeit des Tieres in einer bestimmten Frame-Nummernhalterung (Beginn- und Endzeiten in s mit 30 multiplizieren, um die Start- und Endbildnummer zu erhalten).
- Berechnen Sie die Flugergebnisse, indem Sie die Durchschnittsgeschwindigkeit während jedes SCS durch die Durchschnittsgeschwindigkeit während der 10 s Pre-SCS (Baseline, BL) dividieren und dann 1 Punkt für jeden Escapesprung hinzufügen (speedCS/speedBL + . Eine Flugpunktzahl von 1 weist daher auf keine Änderung des Flugverhaltens aus der Vor-SCS-Periode hin.
- Optional können Sie Videos manuell für andere Verhaltensweisen wie Aufzucht und Pflege bewerten.
6. Statistische Analyse
- Analysieren Sie Daten für die statistische Signifikanz mit hilfe statistischer Analysesoftware. Für alle Tests ist die Definition der statistischen Signifikanz P<0.05.
- Überprüfen Sie die Daten auf Die Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk Normalitätstest (α=0,05).
- Um die Wirkung von Cues zu testen, führen Sie die paarweisen Vergleiche mit dem entsprechenden parametrischen (gekoppelten t-Test) oder nicht-parametrischen (Wilcoxon signed-rank test) Test durch.
- Um die 2-Wege-Wechselwirkung von Faktoren zu bewerten (Cue-X-Studie), führen Sie eine 2-Wege-ANOVA durch, gefolgt von Post-hoc-Tests (z. B. Bonferronis Mehrfachvergleichstest/Tukeys Test).
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Representative Results
Wie im Diagramm beschrieben (Abbildung 1A), beginnt die Sitzung mit der Vorbelichtung (Tag 1), gefolgt von Angstkonditionierung (Tage 2 und 3) und dann entweder Auslöschung oder Abruf (Tag 4).
Die Präsentationen des SCS in der Sitzung vor der Exposition (Tag 1) lösten bei den Mäusen keine Flug- oder Gefrierreaktion aus (Abbildung 2A-2B). Die Verhaltensanalyse während der Konditionierung (Tage 2 und 3) ergab, dass die Tonkomponente des SCS das Einfrieren im Vergleich zum Einfrieren während des Pre-SCS signifikant verbesserte (Abbildung 2B,2E). Die Flugergebnisse haben sich in den Sitzungen signifikant verändert (Tag 1 bis Tag 3, n = 20; Abbildung 2A). Mäuse zeigten höhere Geschwindigkeit und mehr Sprünge und damit höhere Flugwerte, um das weiße Rauschen Cue im Vergleich zu Ton(Abbildung 2C-2D). Mäuse zeigten einen klaren Übergang des defensiven Verhaltens - mit niedrigeren Flugwerten während des Tons gefolgt von höheren Flugwerten während des weißen Rauschens (Abbildung 2F) und umgekehrt für Gefrierreaktionen (Abbildung 2G).
Um die Auswirkungen der Bedrohungsnähe und des Kontextes auf den konditionierten Flug zu testen, wurden die Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt: Eine Gruppe unterzog sich im Konditionierungskontext einem Aussterbetraining (Abbildung 3A-3B), und eine andere Gruppe wurde auf Angstgedächtniserinnerung getestet, indem sie sie dem SCS in einem neutralen Kontext aussetzten ( Abbildung3C-3D). Mäuse, die den 16 Versuchen des Aussterbens unterzogen wurden, zeigten ein schnelles Aussterben des konditionierten Fluges (n = 12). Die Flugwerte während des ersten Blocks von vier Versuchen waren bei weißem Rauschen höher als im Ton (Abbildung 3A). Das Flugverhalten wurde am Ende der Auslöschungssitzung nicht mehr durch einen der beiden Hinweise ausgelöst. Es gab einen allgemeinen Rückgang des toninduzierten Einfrierens und eine Zunahme des weißen Rauschens vermittelten Einfrierens während der Auslöschungssitzung. Das Einfrieren für den ersten Block von vier Versuchen war deutlich höher als der Ton als das weiße Rauschen (Abbildung 3B). Dies deutet darauf hin, dass die bevorstehende Bedrohung für die Flugreaktion von entscheidender Bedeutung ist.
Die Flugreaktion wurde kontextabhängig verringert. Die Exposition gegenüber dem weißen Rauschen im neutralen Kontext löste keinen Flug aus (n = 8). Stattdessen lösten Weiße-Rausch-Präsentationen im neutralen Kontext Gefrierreaktionen aus, die höher waren als die durch den Ton ausgelösten (Abbildung 3C-3D). Dies zeigt, wie wichtig kontextbezogen er ist, um defensive Reaktionen zu modulieren.
Abbildung 1: Studiendesign zur Bewertung des Gefrier- und Flugparadigmas.
A) Diagramm der Verhaltenssitzungen. B) Diagramm, das die Zusammensetzung des seriellen zusammengesetzten Stimulus (SCS) sowie das Timing der USA detailliert dargibt. C) Kontext A - diente als neutraler Kontext und wurde während der Pre-Exposure- und Recall-Sitzungen verwendet. D) Kontext B – verwendet für Angstkonditionierung. Diese Zahl wurde von Fadok et al. 2017 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bedingte Flugantwort.
A) Vergleich der durchschnittlichen versuchsweisen Flugwerte (n = 20) nach Darstellung des Tons und des weißen Rauschens in den Tagen 1-3. Es wurde eine signifikante Veränderung der Flugergebnisse über die Sitzungen hinweg festgestellt (Tag 1 bis Tag 3; zweiseitig wiederholte Messungen ANOVA, Cue ×-Testinteraktion, F (13, 266) = 5.795; P<0.0001). Der Mehrfachvergleichstest von Post-hoc Bonferroni zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen ton- und weißrauscheninduzierten Flugwerten bei der Angstkonditionierung Tag 1 (Studie 4, P < 0,05) und Tag 2 (Versuche 2-5, P < 0,001). B) Vergleich des durchschnittlichen Versuchs- und -gefrierens während der Ton- und Weißrauschenperioden in den Tagen 1-3. Beachten Sie eine statistisch signifikante Veränderung des Einfrierens von % während der Sitzungen (Tag 1 bis Tag 3, n = 20; zweiseitig wiederholte Messungen ANOVA, Cue ×-Studie-Interaktion, F (13, 266) = 20,81; P < 0,001; Abbildung 2B). Der Mehrfachvergleichstest von Post-hoc Bonferroni zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Ton und weißem Rauschen, das beim Frost bei der Angstkonditionierung Tag 1 (Studie 4 und 5, P < 0,001) und Tag 2 (alle Versuche, P < 0,001) verursacht wird. C) Vergleich der Anzahl der Sprungescape-Antworten während der Vor-SCS-, Ton-, Weiß- und Schockzeiten an Tag 3. Einweg-ANOVA gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest zeigte, dass Fluchtsprünge bei weißem Rauschen und Schock im Vergleich zur Tonperiode signifikant höher waren (P < 0,01 bzw. P < 0,001). D) Vergleich der Flugergebnisse bei der Darstellung von Ton und weißem Rauschen an Tag 3. Beachten Sie eine deutlich höhere Flugpunktzahl an Tag 3 während der weißen Rauschenperiode (P < 0.001, Wilcoxon matched-pairs signed-rank test). E) Vergleich von % Gefrieren während des Vor-SCS-, Ton- und Weißrauschens an Tag 3. Das Gefrierverhalten an Tag 3 zeigt signifikante Auswirkungen von Ton und weißem Rauschen (einwegwiederholte Messungen ANOVA, F = 56,82, P<0,01). Bonferronis Mehrfachvergleichstest zeigte, dass die Darstellung des Tons das Einfrieren von % gegenüber der Dauer vor dem SCS signifikant erhöht (P < 0,01), während % des Einfrierens im Vergleich zu Vor-SCS- und Tondauern signifikant reduziert wurde (sowohl P < 0,001). Die repräsentativen versuchsweisen Daten zeigen Übergänge von Flug (F) und Einfrieren (G) Verhalten nach der Darstellung von Ton und weißem Rauschen in der Maus an Tag 3. Die dargestellten Werte sind Mittel werte ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Pre-exp, Pre-Exposition. Panels A-E werden von Fadok et al., 2017 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Aussterben und Rückruf nach Flugkonditionierung (Tag 4).
A) Der Vergleich der Flugergebnisse während des Aussterbetrainings zeigte ein schnelles Aussterben des konditionierten Fluges (n = 12; 16 Versuche, Zwei-Wege-Wiederholungsmessungen ANOVA, Cue ×-Trial-Interaktion, F(15,165) = 3,05, P < 0,01). Flugergebnisse aus dem ersten Block von vier Versuchen (Studie 1-4) des Aussterbens beobachtet deutlich höher für weißes Rauschen im Vergleich zum Ton (P < 0.05, Wilcoxon matched-pairs signed-rank test). B) Der Vergleich des Gefrierens zeigte einen statistisch signifikanten Effekt auf das Einfrieren (%) nach weißem Rauschen (n = 12; 16 Versuche, zweiseitig wiederholte Messungen ANOVA, Cue ×-Trial-Interaktion, F(15,165) = 3,55, P < 0,01). Das Einfrieren des ersten Blocks von vier Versuchen (Versuch 1-4) während des Aussterbens ergab, dass es während der weißen Rauschperiode im Vergleich zum Ton deutlich niedriger war (Paired t-test, P < 0.01). C) Veränderungen im Kontext beeinflussen die Flugergebnisse signifikant (n = 8; 4 Versuche, zweiseitig wiederholte Messungen ANOVA, Cue ×-Trial-Interaktion, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Die Flugwerte reduzierten sich während des weißen Rauschens im Vergleich zur Tonperiode im neutralen Kontext signifikant (zweischwanzig gepaarter t-Test, P < 0,01) D). Gefrierreaktionen während der Versuche während des Abrufs waren ebenfalls signifikant (n = 8, 4 Studien, zweiseitig wiederholte Messungen ANOVA, Wirkung von Cue F(1,7) = 27,67, P < 0,01). Die Exposition von WN im neutralen Kontext erhöhte die Gefrierreaktionen im Vergleich zum Ton signifikant (zweischwanzig gepaarter t-Test, P < 0,001). Die dargestellten Werte sind Mittel werte ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Die Panels A-D werden von Fadok et al. 2017 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die beschriebenen Schall- und Schockparameter sind wichtige Elemente dieses Protokolls. Daher ist es wichtig, die Stoßamplitude und den Schalldruckpegel zu testen, bevor die Experimente beginnen. Fear-Konditionierungsstudien verwenden in der Regel 70-80 dB Schalldruckpegel und 0,1-1 mA Stoßintensität18; Die beschriebenen Parameter liegen somit innerhalb der Grenzen traditioneller Angstkonditionierungsparadigmen. In einem früheren CS-only-Kontrollexperiment (kein Fußschock) haben wir keine Flug- oder Gefrierreaktionen bei den Mäusen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die akustischen Reize nicht aversiv sind, wenn sie wie beschrieben15dargestellt werden. Die Erhöhung des dB-Pegels des weißen Rauschens über 80 dB kann eine angeborene Abneigung auslösen. Lärmreize, die bei 75 dB dargestellt werden, lösen jedoch keinen Stress in Form von unterdrückter Verhaltensaktivität bei Mäusen19aus.
Die akustischen Reize, aus denen sich der SCS zusammensetzt, müssen sorgfältig ausgewählt werden. In unserer vorherigen Studie haben wir festgestellt, dass Eine-CS-Konditionierung mit weißem Rauschen höhere Flugwerte induziert als Konditionierung mit einem reinen Ton15. Dies verdeutlicht die Bedeutung der Stimulus-Salience in diesem Protokoll20. Eine aktuelle Studie zeigte jedoch, dass eine Konditionierung mit einer Umkehrung der SCS-Sequenz (weißer Rauschton) dazu führt, dass der Flug in den Ton und das Einfrieren zum weißen Rauschen21führt. Diese Daten bestätigen, dass die erlernte zeitliche Beziehung der Cues auch ein wichtiger Faktor ist.
Da Käfigänderungen eine potenzielle Stressquelle sind, wird empfohlen, mindestens 2 Tage nach dem letzten Käfigwechsel mit der Konditionierung zu beginnen. Um die Auswirkungen von Stress bei den Mäusen, die untersucht werden, weiter zu minimieren, sollte angemessen darauf geachtet werden, die olfaktorischen Hinweise zu reduzieren, die von früheren Probanden übrig geblieben sind, einschließlich des Geruchs von Kot und Urin. Daher ist die Reinigung der Kammer vor und nach jeder Maus von entscheidender Bedeutung. Um andere potenzielle Störquellen zu vermeiden, ist es am besten, dieses Protokoll in einem Raum durchzuführen, der von allen anderen laufenden Experimenten getrennt ist. Mäuse sollten sehr niedrige Ausgangselage Gefrieren15aufweisen. Um die Versuchsbedingungen zu testen, sollte jedes Labor ein Pilotexperiment durchführen, um das Einfrieren der Ausgangswerte in jedem Kontext zu testen.
Anders als die C57BL/6J und andere transgene Linien, die von Fadok et al. (2017)15verwendet werden, sollte diese Methode für die Anpassung an andere Stämme von Mäusen und Ratten20,21geeignet sein. Jüngste Daten (Borkar et al. 2020)22 deuten darauf hin, dass sowohl männliche als auch weibliche Mäuse vergleichbare Flugreaktionen zeigen, daher ist das Paradigma für beide Geschlechter geeignet. Wie in Schritt 2.1.2 erwähnt, springen Mäuse als Reaktion auf hohe Intensitätsschocks sehr hoch und wählen daher sorgfältig die Höhe der Kammer aus, um zu verhindern, dass die Mäuse aus dem Kontext entkommen. Es ist auch wichtig, das konsistente und genaue Timing von Hinweisen und Stoßreizen zu gewährleisten. Sowohl AC- als auch DC-Schocks sind wirksam; Bei verwendung von DC-Schocks kann es jedoch notwendig sein, die Fußschockintensität zu erhöhen, um ähnliche Flugergebnisse wie AC-Schocks zu erreichen. Da DC-Schocks eine weniger nachteilige Wirkung auf elektrophysiologische Aufnahmen haben, wird die Verwendung von DC-Schock für Studien empfohlen, die elektrophysiologische Daten erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass eine Verringerung der Intensität des Fußschocks die Intensität der Flugreaktion verringern kann.
Wie im Protokoll angegeben, werden Flugergebnisse berechnet, indem Geschwindigkeitsdaten während Desonston und Weißrauschen normalisiert werden, indem sie durch individuelle Test-Vor-SCS-Geschwindigkeitswerte geteilt werden. Wenn jedoch eine Maus während des Pre-SCS extrem hohe Gefrierraten aufweist, können die resultierenden Flugwerte sehr hoch sein, was die Datenvariabilität erhöht. Dies kann umgangen werden, indem eine andere Basismessung verwendet wird, z. B. Durchschnittsgeschwindigkeitsdaten aus dem 3-min-Basiszeitraum zu Beginn der Sitzung oder die Durchschnittsgeschwindigkeit von vorSCS (Durchschnitt von 5 Versuchen) anstelle einzelner Testwerte vor DEM SCS.
Eine flexible und schnelle Verhaltensanpassung an Bedrohungen ist entscheidend für das Überleben. Die meisten klassischen Angstkonditionierungsprotokolle verwenden Bedingungen, die das Einfrieren als alleinige Determinante des Angstlernens induzieren. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die Untersuchung komplexer Defensivzustandsübergänge innerhalb der Fächer ermöglicht. Zuvor wurde dieses Modell verwendet, um zu entdecken, dass Verhaltensübergänge durch lokale rezidivierende hemmende Schaltkreise in der zentralen Amygdala15,23verarbeitet werden. Dieses Paradigma ermöglichte es den Forschern auch, kortizo-thalamische Schaltungen für die Auswahl des Defensive-Verhaltens zu klären21. Diese Studien zeigen, dass diese Methode Studien zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreissteuerung von schnellen Übergängen zwischen defensiven Verhaltensweisen innerhalb eines Subjekts erleichtern wird. Dies hat mögliche Anwendungen für die Entwicklung eines besseren Verständnisses der neurobiologischen Grundlagen von Angst, Panikstörung, oder PTSD24,25.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Louisiana Board of Regents durch den Board of Regents Support Fund (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) und das National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter der Nummer R01MH122561 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
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