Summary
Defensiva beteendemässiga svar är beroende av hotintensitet, närhet och exponeringskontext. Baserat på dessa faktorer utvecklade vi ett klassiskt konditioneringsparadigm som framkallar tydliga övergångar mellan betingad frysning och flygbeteende inom enskilda ämnen. Denna modell är avgörande för förståelsen av de patologier som är involverade i ångest, panik och posttraumatiska stressstörningar.
Abstract
Rädsla- och ångestrelaterade beteenden bidrar avsevärt till en organisms överlevnad. Överdrivna defensiva svar på uppfattat hot är dock karakteristiska för olika ångestsyndrom, som är den vanligaste formen av psykisk sjukdom i USA. Att upptäcka de neurobiologiska mekanismerna som är ansvariga för defensiva beteenden kommer att bidra till utvecklingen av nya terapeutiska interventioner. Pavlovian fear conditioning är ett allmänt använt laboratorieparadigm för att studera rädsla-relaterat lärande och minne. En stor begränsning av traditionella pavlovska skräckkonditioneringsparadigmer är att frysning är det enda defensiva beteendet som övervakas. Vi utvecklade nyligen ett modifierat pavlovskt skräckkonditioneringsparadigm som gör att vi kan studera både konditionerat frysning och flyktbeteende (även känt som flykt) inom enskilda ämnen. Denna modell använder högre intensitet footshocks och ett större antal parningar mellan den konditionerade stimulansen och okonditionerad stimulans. Dessutom använder detta betingade flygparadigm seriell presentation av ren ton och vitt brus auditiva stimuli som den betingade stimulansen. Efter konditionering i detta paradigm uppvisar möss frysningsbeteende som svar på tonstimulansen och flygsvar under det vita bruset. Denna konditioneringsmodell kan tillämpas på studier av snabba och flexibla övergångar mellan beteendemässiga svar som är nödvändiga för överlevnad.
Introduction
Rädsla är ett evolutionärt bevarat adaptivt svar på ett omedelbart hot1,2. Medan organismer har medfödda defensiva svar på ett hot, är lärda föreningar avgörande för att framkalla lämpliga defensiva svar på stimuli som förutsäger fara3. Dysreglering i hjärnkretsar som styr defensiva svar kommer sannolikt att bidra till maladapektiva reaktioner i samband med flera försvagande ångestsyndrom, såsom posttraumatiskt stressyndrom (PTSD),panikångest 4, och specifika fobier5,6. Prevalensen i USA för ångestsyndrom är 19,1% för vuxna och 31,9% hos ungdomar7,8. Bördan av dessa sjukdomar är extremt hög på individernas dagliga rutin och påverkar deras livskvalitet negativt.
Under de senaste decennierna har Pavlovian fear conditioning fungerat som ett kraftfullt modellsystem för att få enorm inblick i de neurala mekanismerna bakom rädsla-relaterat lärande ochminne 9,10,11. Pavlovian rädsla konditionering innebär att para ihop en konditionerad stimulans (CS, såsom en auditiv stimulans) med en aversiv okonditionerad stimulans (USA; till exempel en elektrisk fotskocka)12. Eftersom frysning är det dominerande beteendet som framkallas och mäts i standard Pavlovian konditionering paradigm, de neurala kontroll mekanismerna för aktiva former av defensiva beteende såsom flykt / flyg svar förblir till stor del outforskade. Tidigare studier visar att olika former av defensivt beteende, såsom flygning, framkallas beroende på hotintensitet, närhet ochsammanhang 13,14. Att studera hur hjärnan kontrollerar olika typer av defensivt beteende kan avsevärt bidra till förståelsen av de neuronala processer som är dysreglerade i rädsla och ångeststörningar.
För att ta itu med detta kritiska behov utvecklade vi ett modifierat pavlovskt konditioneringsparadigm som framkallar flyg- och flykthopp, förutom att frysa15. I detta paradigm konditioneras möss med en seriell sammansatt stimulans (SCS) bestående av en ren ton följt av vitt brus. Efter två dagars parkoppling av SCS med en stark elektrisk fotskocka uppvisar möss frysning som svar på tonkomponenten och flygningen under det vita bruset. Beteendemässiga växlar mellan konditionerad frysning och flygbeteende är snabba och konsekventa. Intressant nog uppvisar möss flygbeteende endast när det vita bruset CS presenteras i samma sammanhang som en tidigare levererad fotskocka (konditioneringskontexten) men inte i ett neutralt sammanhang. I stället dominerar frysande svar i detta neutrala sammanhang, med betydligt högre nivåer av frysning som svar på det vita bruset jämfört med tonen. Detta är förenligt med kontextens roll för att modulera defensiv responsintensitet och med den kontextuella informationens regleringsroll i rädsla-relaterat lärande och minne som finns i traditionella hotkonditioneringsparadigmer16,17. Denna modell möjliggör direkta jämförelser inom ämnet av flera defensiva beteenden på ett kontextspecifikt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande steg/förfaranden genomfördes i enlighet med institutionella riktlinjer efter godkännande från Tulane Universitys kommitté för institutionell djurvård och användning.
1. Beredning av möss
- Använd vuxna möss för män och/eller kvinnor i åldern 3-5 månader. I den aktuella studien använde vi manliga C57BL/ 6J möss som erhållits från Jackson Laboratory, men alla musstammar från en ansedd leverantör kan användas.
- Minst en vecka före experimentet, hus alla möss individuellt på en 12:12 h ljus / mörk cykel under hela studien. Ge mössen ad libitum tillgång till mat och vatten.
- Utför alla beteendeexperiment under ljuscykeln. Utför alla sessioner samtidigt på dagen inom en enskild kohort. Om du till exempel startar experimentet kl. 09.00 på dag 1 fortsätter du att starta vid den tidpunkten tills experimentet är slutfört.
2. Beredning av studiematerial
- Studiesammanhang
- Välj två olika sammanhang att utföra experimenten i.
- Använd en cylindrisk kammare bestående av klart plexiglas (diameter 30 cm) som sammanhang A, med ett slät plexiglasgolv. Kammarens höjd bör vara tillräcklig för att förhindra utrymning (minst 30 cm hög).
- För sammanhang B använd ett rektangulärt hölje (25 cm x 30 cm) med ett elnätsgolv som används för att leverera växelströmsfotsockar. Höjden på denna kammare är mycket viktig och bör vara minst 35 cm hög. Alternativt kan du använda ett genomskinligt tak (se till att video kan spelas in genom detta material).
OBS: Använd en kammare med släta väggytor som enkelt kan rengöras. - Använd en annan rengöringslösning för att rengöra sammanhangen. Till exempel rent sammanhang A med 1% ättiksyra och sammanhang B med 70% etanol. Rengör sammanhangen innan du börjar den första sessionen, mellan testning av enskilda möss och efter avslutad dags sessioner. Detta är viktigt för att ta bort luktsignalerna från tidigare möss. Noggrann rengöring hjälper också till att förhindra urinskalning på chocknätet, vilket kommer att äventyra konditioneringssessionerna.
OBS: Rengöringslösningarna fungerar också som en luktsignal, använd därför samma rengöringsvätska för ett visst sammanhang. - Placera sammanhang A eller sammanhang B i en ljuddämpande ruta under respektive studiesessioner.
- Ljudgenerator
- Montera en overheadhögtalare ovanför sammanhangen för att leverera auditiva stimuli vid 75 dB.
- Använd en programmerbar ljudgenerator för att generera auditiva stimuli enligt ett fördefinierat schema. Den rena tonen på 7,5 kHz är ett ljud med en sinusformad vågform, medan det vita bruset är en slumpmässig signal med samma intensitet vid olika frekvenser, från 1-20 000 Hz.
- Använd TTL-pulser för att leverera hörselstimuli och chocksignaler med temporal precision.
OBS: Innan du påbörjar experimenten, mät ljudintensitetsutgången från den monterade högtalaren i varje kammare med en dB-mätare.
- Stötdämpare: Anslut stötdämparen till elnätets golv som används för att leverera 0,9 mA AC-stöten. Definiera frekvens, inset och varaktighet för stötar i ett datorprogram. Leverera varje chockstimulans i slutet av varje SCS under en varaktighet av 1 s, totalt fem SCS-chockpar per konditioneringssession.
3. Förberedelse av datorprogram och videospårning
- Generera beteendeprotokoll med kodning i ett program.
- I programmet definierar du den seriella sammansatta stimulansen SCS. Denna stimulans är en seriell presentation av en 10 s ren ton (varje pip presenteras för 500 ms, med frekvensen 7,5 kHz och hastigheten 1 Hz) och 10 s vitt brus (500 ms pips vid 1 Hz).
- Definiera intervallen mellan försök (ITI) som presenteras efter varje försök, pseudorandomly.
- Under studien spelar du in allt musbeteende till video för efterföljande analys.
Obs: Kommersiellt tillgängliga skräckkonditioneringslådor kanske inte ställs in för att spela in beteenden genom den toppmonterade kameran. Detta är mycket viktigt eftersom den inspelade videon används för att beräkna horisontell rörelse, hastighet och total sträcka som djuret färdas. - Om du vill ställa in programspårningen placerar du en testmus i varje relevant sammanhang, justerar konturspårningskänsligheten och definierar tyngdpunkten. Detta kommer att säkerställa förvärv av tillförlitliga uppgifter om relativ ställning. Definiera dessutom hela det sammanhangsområde som är tillgängligt för ämnet.
OBS: Justeringen av konturstorleken för båda sammanhangen är viktig eftersom förändringen i ljusstyrka i olika sammanhang kommer att ändra konturstorleken. - Bestäm en kalibreringskoefficient med hjälp av kamrarnas kända storlekar och kamerans pixeldimensioner som kan användas för att beräkna hastighet (cm/s).
- Synkronisera datainsamlingsdatorns tidsstämpelhändelser med deras realtidsförekomster.
4. Beteendeexperiment
- Slå på all utrustning: datorer, fear conditioning box controller, shocker och video och timestamp inspelningsprogram. Se till att instrumenten är på på på rätt sätt.
- Kontrollera alla funktioner, inklusive ton, vitt brus och chockleverans, och konfigurera systemet för datainsamlingen.
- Transportera djuren från deras förråd till konditioneringsrummet. Låt dem acklimatisera sig där i minst 10 minuter.
- Ta ut djuret från hemburen, placera det försiktigt i respektive sammanhang och aktivera sedan omedelbart datorprogrammen.
OBS: Initieringen av både fear conditioning system och datainsamling (tidsstämplar, musspårning och videoinspelning) programvara i taget kan synkroniseras med TTL puls medierade aktiveringar. - Förkonditionering/förexponering
- På dag 1 placerar du ämnet i sammanhang A (neutralt sammanhang). Låt den acklimatisera sig till kammaren i 3 minuter (baslinjeperioden) och exponera den sedan för 4 försök med en SCS på 20 s total varaktighet (figur 1A-1B).
- Behåll en 90 s genomsnittlig pseudorandom ITI (intervall 80-100 s). Den totala varaktigheten för varje session före exponering är 590 s.
- Rädsla konditionering
- På dag 2 och dag 3 placerar du ämnet i sammanhang B. Efter en 3 min baslinjeperiod, exponera ämnet för fem parningar av SCS co-terminating med en 1 s, 0,9 mA AC fotskara.
- Behåll en 120 s genomsnittlig pseudorandom ITI (intervall 90-150 s). Se till att varje konditioneringssession varar i totalt 820 s (figur 1A).
- Beroende på experimentens mål, försök möss på dag 4 till antingen ett återkallelsetest (se steg 4.7) eller att frukta utrotning (se steg 4.8).
- Återkallande av rädsla (för att testa kontextberoende)
- På dag 4 placerar du ämnet i sammanhang A. Efter 3 min baslinjeperioden, presentera den med 4 prövningar av SCS utan footshock, över 590 s.
- Behåll en 90 s genomsnittlig pseudorandom ITI (intervall 80-100 s).
- Rädsla utrotning
- På dag 4 placerar du ämnet i sammanhang B. Efter 3 min baslinjeperioden, presentera 16 prövningar av SCS utan footshock, över 1910 s.
- Behåll en 90 s genomsnittlig pseudorandom ITI (intervall 60-120 s).
- Återvänd djuret till sin hembur och upprepa proceduren för alla djur.
5. Kvantifiering av beteende
- Ha en observatör blind för experimentet poäng de inspelade videorna för frysning beteende med automatisk frysning detektor trösklar följt av en bildruta-för-bildruta analys av pixel ändringar.
OBS: Andra programvarupaket kan också användas för att beräkna frysning automatiskt med hjälp av 2 kamerasystem. Det är också möjligt för en observatör att manuellt poängsyla frysningsbeteende. - Definiera frysning som ett fullständigt upphörande av kroppsrörelser, med undantag för de som krävs för andning, i minst 1 s.
- Poängen hoppar när alla 4 tassarna lämnar golvet, vilket resulterar i en vertikal och / eller horisontell rörelse.
- Exportera den markerade filen med frysnings-, hopp- och händelsemarkörer.
- Extrahera relevanta händelser (frysning och hopp) från definierade tidsperioder (t.ex. 10 s varaktighet för pre-SCS, ton och vitt brus för varje försök).
- Med hjälp av de extraherade startstoppslängderna för händelser i en kalkylbladsfil beräknar du varaktigheten för frysning (i s) genom att subtrahera starttiden från sluttiden från respektive provperioder.
- Representera dessa data försöksmässigt eller dagmässigt, genom att summera frys varaktighet från alla försök.
OBS: Beroende på studiens syfte kan flyg- eller frysbeteenden poängsättas och beräknas utifrån eventuella försök/varaktighet från studiesessionen. - Summera det totala antalet hopp från en viss provperiod.
- Extrahera filen som genereras av musspårningskoordinater från bildruta för bildruta X-Y-axelrörelse i musens tyngdpunkt och beräkna musens hastighet (cm/s).
OBS: Hastighetsdata kan finnas antingen i cm/s- eller pixel/s-format. Konvertera pixelenheten till cm/s med hjälp av tum- eller cm/pixelvärde som definierats i videon för den testkontexten (se avsnitt 3.6). - Efter att ha extraherat hastighetsdata för ram för djurets ram-förflyttning, baserat på videons bildhastighet (helst 30 bilder/ s), beräkna djurets genomsnittliga hastighet i ett specifikt bildnummerfäste (multiplicera start- och sluttiderna i s med 30 för att få start- och slutramnumret).
- Beräkna flygpoängen genom att dividera medelhastigheten under varje SCS med medelhastigheten under 10 s pre-SCS (baslinje, BL) och lägg sedan till 1 poäng för varje escape jump (speedCS/speedBL + # av hopp). En flygpoäng på 1 indikerar därför ingen förändring i flygbeteendet från perioden före SCS.
- Du kan också poängsändera videor manuellt för andra beteenden som uppfödning och grooming.
6. Statistisk analys
- Analysera data för statistisk signifikans med hjälp av programvara för statistisk analys. För alla tester är definitionen av statistisk signifikans P<0,05.
- Kontrollera data för normal distribution med shapiro-wilk normalitetstestet (α=0,05).
- För att testa effekten av signaler, utför parvis jämförelser med lämpligt parametertest (parat t-test) eller icke-parametriskt (Wilcoxon signerat rankningstest).
- För att bedöma 2-vägsinteraktion av faktorer (cue X-studie), utför en 2-vägs ANOVA följt av post-hoc-tester (t.ex. Bonferronis multipla jämförelsetest/Tukeys test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrivs i diagrammet (figur 1A) börjar sessionen med förexponering (dag 1), följt av rädsla konditionering (dag 2 och 3), och sedan antingen utrotning eller hämtning (dag 4).
Presentationer av scs under sessionen före exponering (dag 1) framkallade inte flyg- eller frysrespons hos mössen (figur 2A-2B). Beteendeanalys under konditionering (dag 2 och 3) visade att tonkomponenten i SCS avsevärt förbättrade frysningen jämfört med frysning under pre-SCS (Figur 2B,2E). Flygpoängen ändrades avsevärt under sessionerna (dag 1 till dag 3, n = 20; Figur 2A). Möss visade högre hastighet och fler hopp, och därmed större flygpoäng, till den vita brussignalen jämfört med tonen (Figur 2C-2D). Möss visade en tydlig övergång av defensivt beteende - uppvisar lägre flygpoäng under tonen följt av högre flygpoäng under vitt brus (Figur 2F) och vice versa för frysande svar (Figur 2G).
För att testa effekten av hot närhet och sammanhang på konditionerad flygning delades möss in i två grupper: en grupp genomgick utrotningsträning i konditioneringssammanhang (figur 3A-3B), och en annan grupp testades av rädsla minne återkallande genom att utsätta dem för SCS i ett neutralt sammanhang (Figur 3C-3D). Möss som utsattes för de 16 försöken med utrotningsträning visade snabb utrotning av konditionerad flygning (n = 12). Flygpoängen under det första blocket av fyra försök var högre under vitt brus jämfört med tonen (figur 3A). Flygbeteendet framkallades inte längre av någon av ledtrådarna i slutet av utrotningssessionen. Det fanns en allmän minskning av ton-inducerad frysning och en ökning av vit brus-medierad frysning under utrotning sessionen. Frysningen för det första blocket av fyra försök var betydligt högre än tonen jämfört med det vita bruset (figur 3B). Detta tyder på att hotet är avgörande för flygresponsen.
Flygresponsen minskades på ett kontextberoende sätt. Exponering för det vita bruset i det neutrala sammanhanget framkallade inte flygning (n = 8). I stället framkallade vita bruspresentationer i det neutrala sammanhanget frysande svar som var högre än de som framkallades av tonen (figur 3C-3D). Detta visar hur viktigt sammanhanget är för att modulera defensiva svar.
Figur 1: Studiedesign för att bedöma frysning och flygparadigm.
A) Diagram över beteendesessionerna. B) Diagram som beskriver sammansättningen av den seriella sammansatta stimulansen (SCS), liksom tidpunkten för USA. C) Sammanhang A - fungerade som ett neutralt sammanhang och användes under sessioner före exponering och återkallande. D) Sammanhang B – används för rädsla konditionering. Denna siffra har ändrats från Fadok et al. 2017. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Betingad flygrespons.
A) Jämförelse av genomsnittliga försöksvis flygpoäng (n = 20) efter presentation av tonen och vitt brus över dag 1-3. En betydande förändring av flygpoängen över sessioner har noterats (dag 1 till dag 3; tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA, cue × trial interaction, F (13, 266) = 5.795; P<0.0001). Post-hoc Bonferronis multipla jämförelsetest visar en betydande skillnad mellan ton och vitt brus inducerad flygpoäng vid rädsla konditionering dag 1 (försök 4, P < 0,05) och dag 2 (försök 2-5, P < 0,001). B) Jämförelse av genomsnittlig försöksvis % frysning under ton- och vitljudsperioderna under dag 1-3. Observera en statistiskt signifikant förändring av % frysning under sessionerna (dag 1 till dag 3, n = 20; tvåvägs upprepade mått ANOVA, cue × trial interaction, F (13, 266) = 20,81; P < 0.001; Figur 2B). Post-hoc Bonferronis multipla jämförelsetest visar en betydande skillnad mellan ton och vitt brus inducerad frysning vid rädsla konditionering dag 1 (försök 4 och 5, P < 0.001) och dag 2 (alla prövningar, P < 0.001). C) Jämförelse av antalet hopputrymningssvar under pre-SCS, ton, vitt brus och chockperioder på dag 3. Enkelvägs ANOVA följt av Bonferronis flera jämförelser visade att flykthopp var betydligt högre under vitt brus och chock jämfört med tonperioden (P < 0,01 respektive P < 0,001). D) Jämförelse av flygpoäng under presentationen av ton och vitt brus på dag 3. Observera en betydligt högre flygpoäng på dag 3 under vit brusperiod (P < 0.001, Wilcoxon matchade par signerade rankningstest). E) Jämförelse av % frysning under pre-SCS, ton och vitt brus på dag 3. Frysningsbeteende på dag 3 avslöjar betydande effekt av ton och vitt brus (enkelvägs upprepade mått ANOVA, F = 56,82, P<0,01). Bonferronis multipla jämförelsetest visade att tonpresentationen avsevärt ökar frysningen jämfört med perioden före SCS (P < 0,01), medan frysningen av % minskade betydligt jämfört med perioden före SCS och tonerna (både P < 0,001). De representativa försöksmässigt data visar övergångar av flygning (F) och frysning (G) beteende efter presentationen av ton och vitt brus i musen på dag 3. De representerade värdena är ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Pre-exp, Förexponering. Panelerna A-E är modifierade från Fadok m.fl., 2017. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Utrotning och återkallelse efter flygkonditionering (dag 4).
A) Jämförelse av flygpoäng under utrotningsträning visade snabb utrotning av konditionerad flygning (n = 12; 16 försök, tvåvägs upprepade mått ANOVA, cue × försöksinteraktion, F(15,165) = 3,05, P < 0,01). Flygpoäng från första blocket av fyra försök (studie 1-4) av utrotning observerades betydligt högre för vitt brus jämfört med tonen (P < 0,05, Wilcoxon matchade par signerade rankningstest). B) Jämförelse av frysning visade en statistiskt signifikant effekt på frysning (%) efter vitt brus (n = 12; 16 försök, dubbelvägs upprepade mått ANOVA, cue × trial interaction, F(15,165) = 3,55, P < 0,01). Frysningen för det första blocket av fyra försök (studie 1-4) under utrotningen visade sig vara betydligt lägre under vit ljudperiod jämfört med tonen (Parat t-test, P < 0,01). C) Förändringar i sammanhanget påverkar flygpoängen avsevärt (n = 8; 4 försök, tvåvägs upprepade mått ANOVA, cue × trial interaction, F(1,7) = 27.44, P < 0.01). Flygpoängen minskade avsevärt under vitt brus jämfört med tonperioden i det neutrala sammanhanget (tvåstjärtat parat t-test, P < 0,01) D). Frysning svar över prövningar under hämtning var också betydande (n = 8, 4 prövningar, tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA, effekten av cue F(1,7) = 27,67, P < 0,01). Exponeringen av WN i neutralt sammanhang ökade avsevärt frysningssvaren jämfört med tonen (tvåsidiga parade t-test, P < 0,001). De representerade värdena är ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Panelerna A-D är modifierade från Fadok et al. 2017. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrivna ljud- och chockparametrarna är viktiga delar av detta protokoll. Det är därför viktigt att testa chockamlituden och ljudtrycksnivån innan experimenten påbörjas. Studier av skräckkonditionering använder vanligtvis ljudtrycksnivåer på 70-80 dB och 0,1-1 mA chockintensitet18; Således ligger de beskrivna parametrarna inom gränserna för traditionella skräckkonditioneringsparadigmer. I ett tidigare CS-only (no footshock) kontrollexperiment observerade vi inte flyg- eller fryssvar hos mössen, vilket indikerar att hörselstimuli inte är aversiva när de presenteras enligtbeskrivningen 15. Att öka dB-nivån för det vita bruset över 80 dB kan inducera medfödd aversion. Bullerstimuli som presenteras vid 75 dB framkallar dock inte stress i form av undertryckt beteendeaktivitet hos möss19.
De auditiva stimuli som ingår i SCS måste väljas noggrant. I vår tidigare studie bestämde vi att single-CS-konditionering med vitt brus inducerar högre flygpoäng än konditionering med en ren ton15. Detta illustrerar vikten av stimulans salience i detta protokoll20. En ny studie visade dock att konditionering med en återföring av SCS-sekvensen (vit bruston) resulterar i flygning till tonen och frysning till det vitabruset 21. Dessa data stöder att det lärda temporala förhållandet mellan ledtrådarna också är en viktig faktor.
Eftersom burbyten är en potentiell källa till stress, rekommenderas att börja konditionera minst 2 dagar efter den senaste burbytet. För att ytterligare minimera effekten av stress hos möss som genomgår studie bör lämplig försiktighet vidtas för att minska de luktsignaler som återstår från tidigare försökspersoner, inklusive lukten av avföring och urin. Därför är rengöring av kammaren före och efter varje mus avgörande. För att undvika andra potentiella störningskällor är det bäst att genomföra detta protokoll i ett rum som är skilt från andra pågående experiment. Möss bör uppvisa mycket låg baslinjefrysning15. För att testa försöksförhållandena bör varje laboratorium genomföra ett pilotförsök för att testa frysning av utgångsvärdet i varje sammanhang.
Förutom C57BL/6J och andra transgena linjer som används av Fadok et al. (2017)15,bör denna metod vara lämplig för anpassning till andra stammar av möss och råttor20,21. Nya data (Borkar et al. 2020)22 tyder på att både manliga och kvinnliga möss visar jämförbara flygsvar, därför är paradigmet lämpligt för båda könen. Som nämnts i steg 2.1.2, som svar på högintensiva stötar, hoppar möss mycket högt och väljer därmed noggrant kammarens höjd för att förhindra att mössen flyr sammanhanget. Det är också viktigt att säkerställa en konsekvent och exakt timing av signaler och chockstimulanser. Både AC- och DC-stötar är effektiva; Vid användning av DC-stötar kan det dock vara nödvändigt att öka fotskockintensiteten för att nå liknande flygpoäng som för AC-stötar. Eftersom DC-stötar har en mindre skadlig effekt på elektrofysiologiska inspelningar rekommenderas användning av DC-chock för studier som kräver elektrofysiologiska data. Det är viktigt att notera att en minskning av fotskockens intensitet kan minska intensiteten i flygresponsen.
Som betecknas i protokollet beräknas flygpoäng genom att normalisera hastighetsdata under ton och vitt brus genom att dela dem med individuella testvärden före SCS-hastighet. Men om en mus uppvisar extremt höga nivåer av frysning under pre-SCS, kan de resulterande flygpoängen vara mycket höga, vilket ökar datavariationen. Detta kan kringgås med hjälp av en annan baslinjemätning, till exempel medelhastighetsdata från baslinjeperioden på 3 minuter i början av sessionen eller med hjälp av medelhastigheten för övergripande pre-SCS (i genomsnitt 5 försök), i stället för enskilda testvärden före SCS.
Flexibel och snabb beteendemässig anpassning till hot är avgörande för överlevnad. De flesta klassiska skräckkonditioneringsprotokoll använder förhållanden som inducerar frysning som en enda avgörande faktor för rädsla lärande. Fördelen med detta protokoll är att det möjliggör studier av komplexa defensiva tillstånd övergångar inom ämnen. Tidigare användes denna modell för att upptäcka att beteendeövergångar bearbetas av lokala återkommande hämmande kretsar i centrala amygdala15,23. Detta paradigm gjorde det också möjligt för forskare att klargöra kortiko-thalamic kretsar för valet av defensivt beteende21. Dessa studier visar att denna metod kommer att underlätta studier som undersöker neural kretskontroll av snabba övergångar mellan defensiva beteenden inom ett ämne. Detta har potentiella tillämpningar för att utveckla en bättre förståelse för de neurobiologiska grunderna för ångest, panikångest eller PTSD24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Louisiana Board of Regents genom Board of Regents supportfond (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) och National Institute of Mental Health of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer R01MH122561. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
- Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
- LeDoux, J.
- Maren, S.
- Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
- Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
- Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
- Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
- National Institute of Mental Health.
- Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
- Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
- Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
- Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
- Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
- Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C.
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
- Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
- Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
- Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
- Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
- Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).
