Summary
Defensieve gedragsreacties zijn afhankelijk van dreigingsintensiteit, nabijheid en context van blootstelling. Op basis van deze factoren ontwikkelden we een klassiek conditioneringsparadigma dat duidelijke overgangen oproept tussen geconditioneerd bevriezing en vlieggedrag binnen individuele onderwerpen. Dit model is cruciaal voor het begrijpen van de pathologieën die betrokken zijn bij angst, paniek en posttraumatische stressstoornissen.
Abstract
Angst- en angstgerelateerd gedrag draagt aanzienlijk bij aan het voortbestaan van een organisme. Overdreven defensieve reacties op waargenomen dreiging zijn echter kenmerkend voor verschillende angststoornissen, die de meest voorkomende vorm van psychische aandoeningen in de Verenigde Staten zijn. Het ontdekken van de neurobiologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor defensief gedrag zal helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies. Pavloviaanse angstconditionering is een veelgebruikt laboratoriumparadigma om angstgerelateerd leren en geheugen te bestuderen. Een belangrijke beperking van traditionele Pavloviaanse angstconditioneringsparadigma's is dat bevriezing het enige defensieve gedrag is dat wordt gecontroleerd. We hebben onlangs een aangepast Pavloviaans angstconditioneringsparadigma ontwikkeld dat ons in staat stelt om zowel geconditioneerd bevriezing als vluchtgedrag (ook bekend als ontsnappingsgedrag) binnen individuele proefpersonen te bestuderen. Dit model maakt gebruik van voetshocks met een hogere intensiteit en een groter aantal koppelingen tussen de geconditioneerde stimulus en ongeconditioneerde stimulus. Bovendien maakt dit geconditioneerde vluchtparadigma gebruik van seriële presentatie van zuivere toon en witte ruis auditieve stimuli als de geconditioneerde stimulus. Na conditionering in dit paradigma vertonen muizen vriesgedrag als reactie op de toonprikkel en vluchtreacties tijdens het witte geluid. Dit conditioneringsmodel kan worden toegepast op de studie van snelle en flexibele overgangen tussen gedragsreacties die nodig zijn om te overleven.
Introduction
Angst is een evolutionair geconserveerde adaptieve reactie op een onmiddellijke dreiging1,2. Terwijl organismen aangeboren defensieve reacties op een bedreiging bezitten, zijn geleerde associaties cruciaal om geschikte defensieve reacties op stimuli te ontlokken die voorspellend zijn voor gevaar3. Dysregulatie in hersencircuits die defensieve reacties beheersen, zal waarschijnlijk bijdragen aan maladaptive reacties geassocieerd met meerdere slopende angststoornissen, zoals posttraumatische stressstoornis (PTSS), paniekstoornis4en specifieke fobieën5,6. Het prevalentiepercentage in de Verenigde Staten voor angststoornissen is 19,1% voor volwassenen en 31,9% bij adolescenten7,8. De last van deze ziekten is extreem hoog op de dagelijkse routine van individuen en heeft een negatieve invloed op hun kwaliteit van leven.
In de afgelopen decennia heeft Pavloviaanse angstconditionering gediend als een krachtig modelsysteem om enorm inzicht te krijgen in de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan angstgerelateerd leren en geheugen9,10,11. Pavloviaanse angstconditionering houdt in dat een geconditioneerde stimulus (CS, zoals een auditieve stimulus) wordt gecombineerd met een aversieve ongeconditioneerde stimulus (VS; bijvoorbeeld een elektrische voetschok)12. Omdat bevriezing het dominante gedrag is dat wordt opgeroepen en gemeten in standaard Pavloviaanse conditioneringsparadigma's, blijven de neurale controlemechanismen van actieve vormen van defensief gedrag zoals ontsnappings-/vluchtreacties grotendeels onontgonnen. Eerdere studies tonen aan dat verschillende vormen van defensief gedrag, zoals vlucht, worden opgeroepen, afhankelijk van de dreigingsintensiteit, nabijheid en context13,14. Het bestuderen van hoe de hersenen verschillende soorten defensief gedrag beheersen, kan aanzienlijk bijdragen aan het begrip van de neuronale processen die worden gereguleerd in angst- en angststoornissen.
Om aan deze kritieke behoefte te komen, ontwikkelden we een aangepast Pavloviaans conditioneringsparadigma dat vlucht- en ontsnappingssprongen uitlokt, naast het bevriezenvan 15. In dit paradigma worden muizen geconditioneerd met een seriële verbindingsprikkel (SCS) bestaande uit een zuivere toon gevolgd door witte ruis. Na twee dagen van het koppelen van de SCS met een sterke elektrische voetenschok, vertonen muizen bevriezing als reactie op de tooncomponent en vlucht tijdens het witte geluid. Gedragswisselingen tussen geconditioneerde bevriezing en vlieggedrag zijn snel en consistent. Interessant is dat muizen vluchtgedrag alleen vertonen wanneer de witte ruis CS wordt gepresenteerd in dezelfde context als een eerder geleverde voetschok (de conditioneringscontext), maar niet in een neutrale context. In plaats daarvan domineren bevriezingsreacties hierin de neutrale context, met aanzienlijk hogere niveaus van bevriezing als reactie op de witte ruis in vergelijking met de toon. Dit is in overeenstemming met de rol van context bij het moduleren van defensieve responsintensiteit en met de regulerende rol van contextuele informatie in angstgerelateerd leren en geheugen in traditionele dreigingsconditioneringsparadigma 's16,17. Dit model maakt directe, binnen-subject vergelijkingen van meerdere defensieve gedragingen op een contextspecifieke manier mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende stappen/procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen na goedkeuring door de Institutional Animal Care & Use Committee van Tulane University.
1. Bereiding van muizen
- Gebruik mannelijke en/of vrouwelijke volwassen muizen in de leeftijd van 3-5 maanden. In deze studie gebruikten we mannelijke C57BL/6J muizen verkregen van Jackson Laboratory, maar elke muizenstam van een gerenommeerde leverancier kan worden gebruikt.
- Huis ten minste een week voor het experiment alle muizen individueel op een licht/donkere cyclus van 12:12 uur gedurende de hele studie. Geef de muizen ad libitum toegang tot voedsel en water.
- Voer alle gedragsexperimenten uit tijdens de lichtcyclus. Voer alle sessies op hetzelfde tijdstip van de dag uit binnen een individueel cohort. Als u het experiment bijvoorbeeld op dag 1 om 9.00 uur start, gaat u op dat moment door tot het experiment is voltooid.
2. Voorbereiding van studiemateriaal
- Studiecontexten
- Kies twee verschillende contexten om de experimenten in uit te voeren.
- Gebruik een cilindrische kamer bestaande uit helder plexiglas (diameter 30 cm) als context A, met een gladde plexiglas vloer. De hoogte van de kamer moet voldoende zijn om ontsnapping (minstens 30 cm hoog) te voorkomen.
- Gebruik voor Context B een rechthoekige behuizing (25 cm x 30 cm) met een elektriciteitsnetvloer die wordt gebruikt om wisselstroomvoetshocks te leveren. De hoogte van deze kamer is erg belangrijk en moet minstens 35 cm. hoog zijn. U ook een transparant dak gebruiken (zorg ervoor dat video via dit materiaal kan worden opgenomen).
OPMERKING: Gebruik een kamer met gladde wandoppervlakken die gemakkelijk kan worden gereinigd. - Gebruik een andere reinigingsoplossing om de contexten schoon te maken. Bijvoorbeeld schone context A met 1% azijnzuur en context B met 70% ethanol. Reinig de contexten voor het begin van de eerste sessie, tussen het testen van individuele muizen en na voltooiing van de sessies van de dag. Dit is van vitaal belang om de reuksignalen van eerdere muizen te verwijderen. Grondige reiniging zal ook helpen voorkomen dat urine op het schokraster wordt opgeschaald, wat de conditioneringssessies in gevaar brengt.
OPMERKING: De reinigingsoplossingen dienen ook als een reukkeu, gebruik daarom dezelfde reinigingsvloeistof voor een bepaalde context. - Plaats context A of context B in een geluidsdempende box tijdens de respectieve studiesessies.
- Audiogenerator
- Monteer een overheadluidspreker boven de contexten om auditieve stimuli te leveren bij 75 dB.
- Gebruik een programmeerbare audiogenerator om auditieve stimuli te genereren volgens een vooraf gedefinieerd schema. De zuivere toon van 7,5 kHz is een geluid met een sinusoïdale golfvorm, terwijl het witte geluid een willekeurig signaal is met gelijke intensiteit op verschillende frequenties, variërend van 1-20.000 Hz.
- Gebruik TTL-pulsen om auditieve stimuli en schoksignalen met temporele precisie te leveren.
OPMERKING: Meet voordat u met de experimenten begint de geluidsintensiteitsuitgang van de gemonteerde luidspreker in elke kamer met behulp van een dB-meter.
- Schokbreker: Sluit de schokbreker aan op de vloer van het elektriciteitsnet die wordt gebruikt om de 0,9 mA AC-schok te leveren. Definieer de frequentie, het begin en de duur van schokken in een computerprogramma. Lever elke schokprikkel aan het einde van elke SCS voor een duur van 1 s, in totaal vijf SCS-schokcombinaties per conditioneringssessie.
3. Voorbereiding van computerprogramma en videotracking
- Genereer gedragsprotocollen met behulp van codering in een softwareprogramma.
- Definieer in het programma de seriële samengestelde stimulus SCS. Deze stimulus is een seriële presentatie van een zuivere toon van 10 s (elke pip wordt gepresenteerd voor 500 ms, met een frequentie van 7,5 kHz en een snelheid van 1 Hz) en 10 s witte ruis (500 ms pips bij 1 Hz).
- Definieer de inter-trial intervallen (ITI) die na elke studie worden gepresenteerd, pseudorandomly.
- Neem tijdens het onderzoek al het muisgedrag op video op voor verdere analyse.
OPMERKING: In de handel verkrijgbare angstconditioneringsboxen kunnen niet worden ingesteld om het gedrag via de camera aan de bovenkant vast te leggen. Dit is erg belangrijk omdat de opgenomen video wordt gebruikt om horizontale beweging, snelheid en totale afgelegde afstand door het dier te berekenen. - Voor het instellen van de softwaretracking plaatst u een testmuis in elke relevante context, past u de gevoeligheid voor contourtracking aan en definieert u het zwaartepunt. Dit zorgt voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens over de relatieve positie. Definieer bovendien het hele contextgebied dat toegankelijk is voor het onderwerp.
OPMERKING: De aanpassing van de contourgrootte voor beide contexten is belangrijk omdat de verandering in helderheid in verschillende contexten de contourgrootte zal veranderen. - Bepaal een kalibratiecoëfficiënt aan de hand van de bekende afmetingen van de kamers en de pixelafmetingen van de camera die kunnen worden gebruikt om de snelheid (cm/s) te berekenen.
- Synchroniseer de tijdstempelgebeurtenissen van de gegevensverwervingscomputer met hun realtime gebeurtenissen.
4. Gedragsexperiment
- Schakel alle apparatuur in: computers, angstconditioneringsboxcontroller, schokker en video- en tijdstempelopnamesoftware. Zorg ervoor dat instrumenten in de juiste volgorde zijn ingeschakeld.
- Controleer alle functies, inclusief toon, witte ruis en schokafgifte, en stel het systeem in voor de gegevensverwerving.
- Vervoer de dieren van hun berging naar de conditioneringsruimte. Laat ze daar minstens 10 minuten acclimatiseren.
- Haal het dier uit de huiskooi, plaats het voorzichtig in de betreffende context en activeer vervolgens onmiddellijk de computerprogramma's.
OPMERKING: De initialisatie van zowel angstconditioneringssysteem als gegevensverzameling (tijdstempels, muistracking en video-opname) software tegelijk kan worden gesynchroniseerd met behulp van TTL-pulsgemedieerde activeringen. - Preconditionering/Pre-exposure
- Plaats het onderwerp op dag 1 in context A (neutrale context). Laat het gedurende 3 minuten (de basisperiode) aan de kamer acclimatiseren en stel het vervolgens bloot aan 4 proeven met een SCS van een totale duur van 20 s (figuur 1A-1B).
- Handhaaf een 90 s gemiddelde pseudorandom ITI (bereik 80-100 s). De totale duur van elke pre-exposure sessie is 590 s.
- Angst conditionering
- Plaats het onderwerp op dag 2 en dag 3 in context B. Stel na een basisperiode van 3 minuten het onderwerp bloot aan vijf combinaties van de SCS die samen eindigen met een AC-voetschok van 1 s, 0,9 mA.
- Handhaaf een gemiddelde pseudorandom ITI van 120 s (bereik 90-150 s). Laat elke conditioneringssessie in totaal 820 s duren (figuur 1A).
- Afhankelijk van het doel van het experiment, onderwerp muizen op dag 4 aan een terugroeptest (zie stap 4.7) of aan angst voor uitsterven (zie stap 4.8).
- Angstherinnering (om contextafhankelijkheid te testen)
- Plaats het onderwerp op dag 4 in context A. Na de basisperiode van 3 minuten, presenteer het met 4 proeven van de SCS zonder voetschok, meer dan 590 s.
- Handhaaf een 90 s gemiddelde pseudorandom ITI (bereik 80-100 s).
- Angst uitsterven
- Plaats het onderwerp op dag 4 in context B. Na de 3 min baseline periode, presenteren 16 proeven van de SCS zonder voetschok, meer dan 1910 s.
- Houd een gemiddelde pseudorandom ITI van 90 s aan (bereik 60-120 s).
- Breng het dier terug naar zijn huiskooi en herhaal de procedure voor alle dieren.
5. Kwantificering van gedrag
- Laat een waarnemer die blind is voor het experiment de opgenomen video's scoren voor bevriezingsgedrag met behulp van automatische bevriezingsdetectordrempels, gevolgd door een frame-voor-frame analyse van pixelveranderingen.
OPMERKING: Andere softwarepakketten kunnen ook worden gebruikt om automatisch bevriezing te berekenen met behulp van 2 camerasystemen. Het is ook mogelijk voor een waarnemer om handmatig vriesgedrag te scoren. - Definieer bevriezing als een volledige stopzetting van lichamelijke bewegingen, met uitzondering van die welke nodig zijn voor de ademhaling, voor een minimum van 1 s.
- Scoresprongen wanneer alle 4 de poten de vloer verlaten, wat resulteert in een verticale en/of horizontale beweging.
- Exporteer het gemarkeerde bestand met markeringen voor bevriezing, springen en gebeurtenissen.
- Haal relevante gebeurtenissen (bevriezing en sprongen) uit gedefinieerde tijdsperioden (bijv. 10 s duur van pre-SCS, toon en witte ruis, voor elke proef).
- Bereken met behulp van de geëxtraheerde start-stop-duur van gebeurtenissen in een spreadsheetbestand de duur van het bevriezen (in s) door de begintijd af te trekken van de eindtijd, van de respectieve proefperioden.
- Vertegenwoordig deze gegevens trial-wise of dag-wise, door het samenvatten van bevriezingsduur van alle proeven.
OPMERKING: Afhankelijk van het doel van het onderzoek kan het vlucht- of bevriezingsgedrag worden gescoord en berekend op basis van elke proef/duur van de studiesessie. - Som het totale aantal sprongen op van een bepaalde proefperiode.
- Haal het bestand gegenereerd door muisvolgcoördinaten van frame voor frame X-Y-asbeweging van het zwaartepunt van de muis en bereken de snelheid van de muis (cm/s).
OPMERKING: De snelheidsgegevens kunnen aanwezig zijn in het cm/s- of pixel/s-formaat. Converteer de pixel/s-eenheid naar cm/s met behulp van inch- of cm/pixelwaarde die in de video is gedefinieerd voor die testcontext (zie paragraaf 3.6). - Na het extraheren van snelheidsgegevens voor frame voor framebeweging van het dier, op basis van de framesnelheid van de video (bij voorkeur 30 frames/s), berekent u de gemiddelde snelheid van het dier in een specifieke framenummerbeugel (vermenigvuldig begin- en eindtijden in s met 30 om het begin- en eindframenummer te krijgen).
- Bereken de vluchtscores door de gemiddelde snelheid tijdens elke SCS te delen door de gemiddelde snelheid tijdens de 10 s pre-SCS (baseline, BL) en voeg vervolgens 1 punt toe voor elke ontsnappingssprong (speedCS/speedBL + # sprongen). Een vluchtscore van 1 duidt dus op geen verandering in vlieggedrag ten opzichte van de pre-SCS periode.
- Scoor optioneel video's handmatig voor ander gedrag, zoals opfok en verzorging.
6. Statistische analyse
- Analyseer gegevens voor statistische significantie met behulp van statistische analysesoftware. Voor alle tests is de definitie van statistische significantie P<0,05.
- Controleer de gegevens op normale distributie met behulp van de Shapiro-Wilk normaliteitstest (α=0,05).
- Om het effect van cues te testen, voert u de paarsgewijze vergelijkingen uit met behulp van de juiste parametrische (gekoppelde t-test) of niet-parametrische (Wilcoxon signed-rank test).
- Om de 2-weg interactie van factoren te beoordelen (cue X-studie), voert u een 2-weg ANOVA uit, gevolgd door post-hoctests (bijv. Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest / Tukey's test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals beschreven in het diagram (figuur 1A), begint de sessie met pre-exposure (dag 1), gevolgd door angstconditionering (dag 2 en 3), en vervolgens uitsterven of ophalen (dag 4).
Presentaties van het SCS in de sessie vóór blootstelling (dag 1) leidden niet tot vlucht- of bevriezingsreactie bij de muizen (figuur 2A-2B). Gedragsanalyse tijdens conditionering (dag 2 en 3) toonde aan dat de tooncomponent van het SCS de bevriezing aanzienlijk verbeterde in vergelijking met bevriezing tijdens de pre-SCS (figuur 2B,2E). Vluchtscores veranderden aanzienlijk in sessies (dag 1 tot dag 3, n = 20; Figuur 2A). Muizen vertoonden hogere snelheid en meer sprongen, en dus hogere vluchtscores, naar de witte ruiskeu in vergelijking met toon (Figuur 2C-2D). Muizen vertoonden een duidelijke overgang van defensief gedrag - met lagere vluchtscores tijdens de toon gevolgd door hogere vluchtscores tijdens witte ruis (figuur 2F) en vice versa voor bevriezingsreacties (figuur 2G).
Om te testen op het effect van dreigingsnabijheid en context op geconditioneerde vlucht, werden muizen opgesplitst in twee groepen: een groep onderging een uitstervingstraining in de conditioneringscontext (figuur 3A-3B), en een andere groep werd getest op het terugroepen van het angstgeheugen door ze in een neutrale context aan het SCS bloot te stellen (figuur 3C-3D). Muizen onderworpen aan de 16 proeven van uitsterven training toonden snelle uitsterving van geconditioneerde vlucht (n = 12). De vluchtscores tijdens het eerste blok van vier proeven waren hoger tijdens witte ruis in vergelijking met de toon (figuur 3A). Vluchtgedrag werd niet langer uitgelokt door een van beide aanwijzingen aan het einde van de uitstervingssessie. Er was een algemene afname van toongeïnduceerde bevriezing en een toename van witte ruisgemedieerde bevriezing tijdens de uitstervingssessie. Het bevriezen voor het eerste blok van vier proeven was aanzienlijk hoger dan de toon in vergelijking met het witte geluid (figuur 3B). Dit suggereert dat imminentie van de dreiging van vitaal belang is voor de vluchtrespons.
De vluchtrespons werd op een contextafhankelijke manier verminderd. Blootstelling aan het witte geluid in de neutrale context lokte geen vlucht uit (n = 8). In plaats daarvan lokten witte ruispresentaties in de neutrale context bevriezingsreacties uit die hoger waren dan die welke door de toon werden uitgelokt (figuur 3C-3D). Dit toont het belang van context aan bij het moduleren van defensief reageren.
Figuur 1: Studieontwerp om bevriezing en vluchtparadigma te beoordelen.
A) Diagram van de gedragssessies. B) Diagram met details over de samenstelling van de seriële samengestelde stimulus (SCS), evenals de timing van de VS. C) Context A - diende als een neutrale context en werd gebruikt tijdens pre-exposure- en recallsessies. D) Context B – gebruikt voor angstconditionering. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Fadok et al. 2017. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geconditioneerde vluchtrespons.
A) Vergelijking van de gemiddelde proef-wise vluchtscores (n = 20) na presentatie van de toon en witte ruis over Dag 1-3. Er is een significante verandering in de vluchtscores tussen sessies opgemerkt (dag 1 tot dag 3; tweerichtings herhaalde metingen ANOVA, cue × proefinteractie, F (13, 266) = 5.795; P<0,0001). Post-hoc Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest onthult een significant verschil tussen toon en witte ruis geïnduceerde vluchtscores bij fear conditioning Day 1 (trial 4, P < 0.05) en Day 2 (trials 2-5, P < 0.001). B) Vergelijking van het gemiddelde proef-wise % bevriezen tijdens de toon- en witte ruisperioden in dag 1-3. Let op een statistisch significante verandering in % bevriezing gedurende de sessies (dag 1 tot dag 3, n = 20; tweerichtings herhaalde metingen ANOVA, cue × proefinteractie, F (13, 266) = 20,81; P < 0,001; Figuur 2B). Post-hoc Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest onthult een significant verschil tussen toon en witte ruis geïnduceerd bevriezing bij angstconditionering Dag 1 (proef 4 en 5, P < 0.001) en Dag 2 (alle proeven, P < 0.001). C) Vergelijking van het aantal jump escape-reacties tijdens de pre-SCS-, toon-, witte ruis- en schokperioden op dag 3. Eenrichtings-ANOVA gevolgd door Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest toonde aan dat ontsnappingssprongen aanzienlijk hoger waren tijdens witte ruis en schokken in vergelijking met de toonperiode (respectievelijk P < 0,01 en P < 0,001). D) Vergelijking van vluchtscores tijdens de presentatie van toon en witte ruis op dag 3. Let op een aanzienlijk hogere vluchtscore op dag 3 tijdens de witte ruisperiode (P < 0,001, Wilcoxon matched-pairs signed-rank test). E) Vergelijking van % bevriezing tijdens de pre-SCS, toon en witte ruis op dag 3. Bevriezingsgedrag op dag 3 onthult een significant effect van toon en witte ruis (eenrichtingsgeluid ANOVA, F = 56,82, P<0,01). Uit de meervoudige vergelijkingstest van Bonferroni bleek dat de presentatie van de toon significant toeneemt tot de bevriezing ten opzichte van de pre-SCS-duur (P < 0,01), terwijl het bevriezen van % aanzienlijk was verminderd in vergelijking met de duur vóór SCS en de toon (zowel P < 0,001"). De representatieve trial-wise gegevens tonen overgangen van vlucht (F) en bevriezing (G) gedrag na de presentatie van toon en witte ruis in de muis op dag 3. De weergegeven waarden zijn middelen ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Pre-exp, Pre-belichting. Panelen A-E zijn aangepast van Fadok et al., 2017. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Uitsterven en terugroepen na vluchtconditionering (dag 4).
A) Vergelijking van vluchtscores tijdens uitstervingstraining toonde snel uitsterven van geconditioneerde vlucht (n = 12; 16 proeven, tweerichtings herhaalde metingen ANOVA, cue × proefinteractie, F(15.165) = 3,05, P < 0,01). Vluchtscores van het eerste blok van vier proeven (proef 1-4) van uitsterven waargenomen significant hoger voor witte ruis in vergelijking met de toon (P < 0.05, Wilcoxon matched-pairs signed-rank test). B) Vergelijking van bevriezing toonde een statistisch significant effect op bevriezing (%) na witte ruis (n = 12; 16 proeven, tweeweg herhaalde metingen ANOVA, cue × proefinteractie, F(15.165) = 3,55, P < 0,01). Het bevriezen voor het eerste blok van vier proeven (proef 1-4) tijdens uitsterven bleek aanzienlijk lager te zijn tijdens de witte ruisperiode in vergelijking met de toon (Gekoppelde t-test, P < 0,01). C) Veranderingen in de context hebben een aanzienlijke invloed op de vluchtscores (n = 8; 4 proeven, tweeweg herhaalde metingen ANOVA, cue × proefinteractie, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Vluchtscores aanzienlijk verminderd tijdens witte ruis in vergelijking met de toonperiode in de neutrale context (tweezijdig gepaarde t-test, P < 0,01) D). Bevriezingsreacties tijdens proeven tijdens het ophalen waren ook significant (n = 8, 4 proeven, tweerichtings herhaalde metingen ANOVA, effect van cue F(1,7) = 27,67, P < 0,01). Blootstelling van WN in neutrale context verhoogde de bevriezingsreacties aanzienlijk in vergelijking met de toon (tweezijdig gepaarde t-test, P < 0,001). De weergegeven waarden zijn middelen ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Panelen A-D zijn aangepast vanaf Fadok et al. 2017. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven geluids- en schokparameters zijn belangrijke elementen van dit protocol. Het is daarom van cruciaal belang om de schokamplitude en het geluidsdrukniveau te testen voordat u met de experimenten begint. Angstconditioneringsstudies gebruiken doorgaans 70-80 dB geluidsdrukniveaus en 0,1-1 mA schokintensiteit18; zo liggen de beschreven parameters binnen de grenzen van traditionele angstconditioneringsparadigma's. In een eerder CS-only (geen voetschok) controle-experiment hebben we geen vlucht- of vriesreacties bij de muizen ge waargezien, wat erop wijst dat de auditieve stimuli niet aversief zijn wanneer ze worden gepresenteerd zoals beschreven15. Het verhogen van het dB-niveau van het witte geluid boven 80 dB kan aangeboren aversie veroorzaken. Geluidsprikkels gepresenteerd bij 75 dB veroorzaken echter geen stress in de vorm van onderdrukte gedragsactiviteit bij muizen19.
De auditieve stimuli die deel uitmaken van het SCS moeten zorgvuldig worden geselecteerd. In onze vorige studie hebben we vastgesteld dat single-CS conditionering met witte ruis hogere vluchtscores veroorzaakt dan conditionering met een zuivere toon15. Dit illustreert het belang van stimuleringssalience in dit protocol20. Een recente studie toonde echter aan dat conditionering met een omkering van de SCS-reeks (witte ruistoon) resulteert in een vlucht naar de toon en bevriezing tot de witte ruis21. Deze gegevens onderschrijven dat de geleerde temporele relatie van de cues ook een belangrijke factor is.
Omdat kooiveranderingen een potentiële bron van stress zijn, wordt aanbevolen om ten minste 2 dagen na de meest recente kooiverandering te beginnen met conditioneren. Om de impact van stress bij de muizen die een studie ondergaan verder te minimaliseren, moet de nodige zorg worden genomen om de reuksignalen van eerdere proefpersonen, waaronder de geur van uitwerpselen en urine, te verminderen. Daarom is het reinigen van de kamer voor en na elke muis cruciaal. Om andere potentiële bronnen van verstoring te voorkomen, is het het beste om dit protocol uit te voeren in een ruimte gescheiden van andere lopende experimenten. Muizen moeten een zeer lage baseline bevriezing vertonen15. Om de experimentele omstandigheden te testen, moet elk laboratorium een proefexperiment uitvoeren om de bevriezing van de basislijn in elke context te testen.
Met uitzondering van de C57BL/6J en andere transgene lijnen die door Fadok et al. (2017)15worden gebruikt , moet deze methode geschikt zijn voor aanpassing aan andere soorten muizen en ratten20,21. Recente gegevens (Borkar et al. 2020)22 suggereren dat zowel mannelijke als vrouwelijke muizen vergelijkbare vluchtreacties vertonen, daarom is het paradigma geschikt voor beide geslachten. Zoals vermeld in stap 2.1.2, springen muizen als reactie op schokken met hoge intensiteit erg hoog, dus selecteer voorzichtig de hoogte van de kamer om te voorkomen dat de muizen uit de context ontsnappen. Het is ook belangrijk om de consistente en nauwkeurige timing van signalen en schokprikkels te garanderen. Zowel AC- als DC-schokken zijn effectief; bij het gebruik van DC-schokken kan het echter nodig zijn om de intensiteit van de voetshock te verhogen om vergelijkbare vluchtscores te bereiken als die van AC-schokken. Omdat DC-schokken een minder schadelijk effect hebben op elektrofysiologische opnames, wordt het gebruik van DC-shock aanbevolen voor studies waarvoor elektrofysiologiegegevens nodig zijn. Het is belangrijk op te merken dat het verminderen van de intensiteit van de voetshock de intensiteit van de vluchtrespons kan verminderen.
Zoals aangegeven in het protocol, worden vluchtscores berekend door snelheidsgegevens tijdens toon- en witte ruis te normaliseren door ze te delen met individuele pre-SCS-snelheidswaarden voor de proef. Als een muis echter extreem hoge niveaus van bevriezing vertoont tijdens de pre-SCS, kunnen de resulterende vluchtscores zeer hoog zijn, waardoor de gegevensvariabiliteit toeneemt. Dit kan worden omzeild door een andere nulmeting te gebruiken, zoals gemiddelde snelheidsgegevens van de basislijnperiode van 3 minuten aan het begin van de sessie of met behulp van de gemiddelde snelheid van de totale pre-SCS (gemiddelde van 5 proeven), in plaats van individuele pre-SCS-waarden van de proef.
Flexibele en snelle gedragsaanpassing aan dreiging is cruciaal om te overleven. De meeste klassieke angstconditioneringsprotocollen gebruiken omstandigheden die bevriezing veroorzaken als enige bepalende factor voor het leren van angst. Het voordeel van dit protocol is dat het het mogelijk maakt om complexe defensieve staatsovergangen binnen proefpersonen te bestuderen. Voorheen werd dit model gebruikt om te ontdekken dat gedragsovergangen worden verwerkt door lokale terugkerende remmende circuits in de centrale amygdala15,23. Dit paradigma stelde onderzoekers ook in staat om cortico-thalamische circuits op te helderen voor de selectie van defensief gedrag21. Deze studies tonen aan dat deze methode studies zal vergemakkelijken die neurale circuitcontrole van snelle overgangen tussen defensief gedrag binnen een onderwerp onderzoeken. Dit heeft potentiële toepassingen voor het ontwikkelen van een beter begrip van de neurobiologische onderbouwing van angst, paniekstoornis of PTSS24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Louisiana Board of Regents via het Board of Regents support fund (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) en het National Institute of Mental Health van de National Institutes of Health onder awardnummer R01MH122561. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
- Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
- LeDoux, J. Rethinking the Emotional Brain. Neuron. , (2012).
- Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annual Review of Neuroscience. 24, 897-931 (2001).
- Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
- Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
- Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
- Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
- National Institute of Mental Health. Generalized anxiety disorder. National Institute of Mental Health. , 3-8 (2017).
- Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
- Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
- Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
- Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
- Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
- Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C. Noise avoidance in the C57BL/6J mouse. Animal Learning & Behavior. 20 (1), 25-32 (1992).
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
- Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
- Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
- Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
- Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
- Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).
