Summary
As respostas comportamentais defensivas dependem da intensidade da ameaça, proximidade e contexto de exposição. Com base nesses fatores, desenvolvemos um paradigma de condicionamento clássico que provoca transições claras entre congelamento condicionado e comportamento de voo dentro de indivíduos. Esse modelo é crucial para a compreensão das patologias envolvidas em ansiedade, pânico e transtornos de estresse pós-traumático.
Abstract
Comportamentos relacionados ao medo e à ansiedade contribuem significativamente para a sobrevivência de um organismo. No entanto, respostas defensivas exageradas à ameaça percebida são características de vários transtornos de ansiedade, que são a forma mais prevalente de doença mental nos Estados Unidos. A descoberta dos mecanismos neurobiológicos responsáveis pelos comportamentos defensivos ajudará no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. O condicionamento do medo pavloviano é um paradigma laboratorial amplamente utilizado para estudar o aprendizado e a memória relacionados ao medo. Uma grande limitação dos paradigmas tradicionais de condicionamento do medo pavloviano é que o congelamento é o único comportamento defensivo monitorado. Recentemente desenvolvemos um paradigma de condicionamento do medo pavloviano modificado que nos permite estudar tanto o congelamento condicionado quanto o comportamento de fuga (também conhecido como fuga) dentro de indivíduos individuais. Este modelo emprega choques de pé de maior intensidade e maior número de pares entre o estímulo condicionado e o estímulo incondicionado. Além disso, esse paradigma de voo condicionado utiliza a apresentação serial de estímulos auditivos de tom puro e ruído branco como estímulo condicionado. Seguindo o condicionamento nesse paradigma, os ratos exibem comportamento de congelamento em resposta ao estímulo de tom e respostas de voo durante o ruído branco. Esse modelo de condicionamento pode ser aplicado ao estudo de transições rápidas e flexíveis entre as respostas comportamentais necessárias para a sobrevivência.
Introduction
O medo é uma resposta adaptativa evolutivamente conservada a uma ameaça imediata1,2. Embora os organismos possuam respostas defensivas inatas a uma ameaça, associações aprendidas são cruciais para obter respostas defensivas apropriadas a estímulos preditivos de perigo3. A desregulação nos circuitos cerebrais que controlam as respostas defensivas provavelmente contribuirá para reações mal adaptativas associadas a múltiplos transtornos de ansiedade debilitantes, como transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), transtorno de pânico4e fobias específicas5,6. A prevalência nos Estados Unidos para transtornos de ansiedade é de 19,1% para adultos e 31,9% em adolescentes7,8. A carga dessas doenças é extremamente elevada no cotidiano dos indivíduos e impacta negativamente sua qualidade de vida.
Nas últimas décadas, o condicionamento do medo pavloviano serviu como um poderoso sistema modelo para obter uma visão tremenda dos mecanismos neurais subjacentes ao aprendizado e memória relacionados ao medo9,10,11. O condicionamento do medo pavloviano implica emparelhar um estímulo condicionado (CS, como um estímulo auditivo) com um estímulo incondicionado aversivo (EUA; por exemplo, um choque elétrico)12. Como o congelamento é o comportamento dominante evocado e medido nos paradigmas de condicionamento pavloviano padrão, os mecanismos de controle neural de formas ativas de comportamento defensivo, como respostas de fuga/fuga permanecem em grande parte inexplorados. Estudos anteriores mostram que diferentes formas de comportamento defensivo, como o voo, são evocadas dependendo da intensidade da ameaça, proximidade e contexto13,14. Estudar como o cérebro controla diferentes tipos de comportamento defensivo pode contribuir significativamente para a compreensão dos processos neuronais que são desregulados nos transtornos de medo e ansiedade.
Para atender a essa necessidade crítica, desenvolvemos um paradigma de condicionamento pavloviano modificado que provoca saltos de voo e fuga, além de congelar15. Nesse paradigma, os camundongos são condicionados com um estímulo composto serial (SCS) consistindo em um tom puro seguido de ruído branco. Após dois dias emparelhando o SCS com um forte choque elétrico, os ratos exibem congelamento em resposta ao componente de tom e voo durante o ruído branco. Os interruptores comportamentais entre congelamento condicionado e comportamento de voo são rápidos e consistentes. Curiosamente, os ratos exibem comportamento de voo apenas quando o ruído branco CS é apresentado no mesmo contexto que um footshock anteriormente entregue (o contexto de condicionamento), mas não em um contexto neutro. Em vez disso, as respostas congelantes dominam neste contexto neutro, com níveis significativamente maiores de congelamento em resposta ao ruído branco em comparação com o tom. Isso é consistente com o papel do contexto na modulação da intensidade da resposta defensiva e com o papel regulatório da informação contextual na aprendizagem e memória relacionadas ao medo encontradas nos paradigmas tradicionais de condicionamento de ameaças16,17. Este modelo permite comparações diretas e dentro do assunto de múltiplos comportamentos defensivos de forma específica do contexto.
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Protocol
As seguintes etapas/procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais após aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tulane.
1. Preparação de ratos
- Use camundongos adultos do sexo masculino e/ou feminino com idade entre 3 e 5 meses. No presente estudo, utilizamos camundongos C57BL/6J machos obtidos do Laboratório Jackson, mas qualquer cepa de rato de um fornecedor respeitável pode ser usada.
- Pelo menos uma semana antes do experimento, abriga todos os ratos individualmente em um ciclo claro/escuro de 12:12 h ao longo do estudo. Forneça aos ratos acesso a ad libitum a comida e água.
- Realize todos os experimentos comportamentais durante o ciclo de luz. Realize todas as sessões na mesma hora do dia dentro de uma coorte individual. Por exemplo, se iniciar o experimento às 9:00 no dia 1, continue a partir desse momento até que o experimento seja concluído.
2. Preparação de materiais de estudo
- Contextos de estudo
- Escolha dois contextos diferentes para realizar os experimentos.
- Use uma câmara cilíndrica composta de plexiglas claras (diâmetro de 30 cm) como contexto A, com um piso plexiglas liso. A altura da câmara deve ser suficiente para evitar a fuga (pelo menos 30 cm de altura).
- Para o contexto B use um gabinete retangular (25 cm x 30 cm) com um piso de grade elétrica usado para fornecer choques de pé de corrente alternada. A altura desta câmara é muito importante e deve ter pelo menos 35 cm de altura. Alternativamente, use um teto transparente (certifique-se de que o vídeo possa ser gravado através deste material).
NOTA: Use uma câmara com superfícies de parede lisas que podem ser facilmente limpas. - Use uma solução de limpeza diferente para limpar os contextos. Por exemplo, contexto limpo A com ácido acético de 1% e contexto B com 70% de etanol. Limpe os contextos antes de iniciar a primeira sessão, entre testar ratos individuais e após a conclusão das sessões do dia. Isso é vital para remover as pistas olfativas de ratos anteriores. A limpeza completa também ajudará a evitar o dimensionamento da urina na rede de choque, o que comprometerá as sessões de condicionamento.
NOTA: As soluções de limpeza também servem como uma sugestão olfativa, portanto, use o mesmo líquido de limpeza para um contexto específico. - Coloque o contexto A ou o contexto B em uma caixa atenuante de som durante as respectivas sessões de estudo.
- Gerador de áudio
- Monte um alto-falante acima dos contextos para fornecer estímulos auditivos a 75 dB.
- Use um gerador de áudio programável para gerar estímulos auditivos em um cronograma pré-definido. O tom puro de 7,5 kHz é um som com uma forma de onda sinusoidal, enquanto o ruído branco é um sinal aleatório com intensidade igual em diferentes frequências, variando de 1 a 20.000 Hz.
- Use pulsos TTL para fornecer estímulos auditivos e sinais de choque com precisão temporal.
NOTA: Antes de iniciar os experimentos, meça a saída de intensidade sonora do alto-falante montado em cada câmara usando um medidor dB.
- Shocker: Conecte o amortecedor com o piso da rede elétrica que é usado para entregar o choque AC de 0,9 mA. Defina a frequência, o início e a duração dos choques em um programa de computador. Entregue cada estímulo de choque no final de cada SCS por uma duração de 1 s, totalizando cinco pares de choque SCS por sessão de condicionamento.
3. Preparação de programa de computador e rastreamento de vídeo
- Gerar protocolos comportamentais usando codificação em um programa de software.
- No programa, defina o estímulo composto serial SCS. Este estímulo é uma apresentação serial de um tom puro de 10 s (cada pip é apresentado para 500 ms, na frequência de 7,5 kHz e taxa de 1 Hz) e ruído branco de 10 s (500 ms pips a 1 Hz).
- Defina os intervalos inter-ensaio (ITI) apresentados após cada ensaio, pseudorandomly.
- Durante o estudo, registo todo o comportamento do mouse em vídeo para análise subsequente.
NOTA: As caixas de condicionamento de medo disponíveis comercialmente podem não ser configuradas para registrar os comportamentos através da câmera superior. Isso é muito importante, pois o vídeo gravado é usado para calcular o movimento horizontal, a velocidade e a distância total percorrida pelo animal. - Para definir o rastreamento do software, coloque um mouse de teste em cada contexto relevante, ajuste a sensibilidade de rastreamento do contorno e defina o centro de gravidade. Isso garantirá a aquisição de dados confiáveis sobre posição relativa. Além disso, defina toda a área de contexto acessível ao tema.
NOTA: O ajuste do tamanho do contorno para ambos os contextos é importante, pois a mudança de brilho em diferentes contextos mudará o tamanho do contorno. - Determine um coeficiente de calibração usando os tamanhos conhecidos das câmaras e as dimensões de pixel da câmera que podem ser usadas para calcular a velocidade (cm/s).
- Sincronize os eventos de datamp do computador de aquisição de dados às suas ocorrências em tempo real.
4. Experimento comportamental
- Ligue todos os equipamentos: computadores, controlador de caixa de condicionamento de medo, shocker e software de gravação de vídeo e cronograma. Certifique-se de que os instrumentos estão ligados na ordem apropriada.
- Verifique todas as funções, incluindo tom, ruído branco e entrega de choque, e configure o sistema para a aquisição de dados.
- Transporte os animais de seu depósito para a sala de condicionamento. Deixe-os aclimatar lá por pelo menos 10 minutos.
- Retire o animal da gaiola de casa, coloque-o suavemente no respectivo contexto e, em seguida, ative imediatamente os programas de computador.
NOTA: A inicialização do sistema de condicionamento do medo e da coleta de dados (timestamps, rastreamento do mouse e gravação de vídeo) de cada vez pode ser sincronizada usando ativações mediadas por pulso TTL. - Pré-condicionamento/pré-exposição
- No primeiro dia, coloque o assunto no contexto A (contexto neutro). Permita-o aclimatar-se à câmara por 3 minutos (período de linha de base) e, em seguida, expô-lo a 4 ensaios de uma SCS de 20 s de duração total(Figura 1A-1B).
- Mantenha um ITI pseudorandom médio de 90 s (faixa 80-100 s). A duração total de cada sessão de pré-exposição é de 590 s.
- Condicionamento do medo
- Nos dias 2 e 3, coloque o assunto no Contexto B. Após um período de 3 min de linha de base, exponha o sujeito a cinco pares do SCS co-terminando com um choque de 1 s, 0,9 mA AC.
- Mantenha um ITI pseudorandom médio de 120 s (faixa 90-150 s). Ter cada sessão de condicionamento durando 820 s no total(Figura 1A).
- Dependendo do objetivo do experimento, submá-los ratos no dia 4 para um teste de recall (ver passo 4.7) ou para temer a extinção (ver passo 4.8).
- Recordação do medo (para testar a dependência do contexto)
- No dia 4, coloque o assunto no Contexto A. Após o período de 3 min de linha de base, apresente-o com 4 ensaios do SCS sem choque de pé, acima de 590 s.
- Mantenha um ITI pseudorandom médio de 90 s (faixa 80-100 s).
- Extinção do medo
- No dia 4, coloque o assunto no contexto B. Após o período de 3 min de linha de base, apresentam 16 ensaios do SCS sem choque de pé, ao longo da década de 1910.
- Mantenha um ITI pseudorandom médio de 90 s (faixa 60-120 s).
- Devolva o animal para sua gaiola e repita o procedimento para todos os animais.
5. Quantificação do comportamento
- Tenha um observador cego para a pontuação do experimento os vídeos gravados para o comportamento de congelamento usando limiares automáticos de detector de congelamento seguido de uma análise quadro a quadro de alterações de pixels.
NOTA: Outros pacotes de software também podem ser usados para calcular o congelamento automaticamente usando o sistema de 2 câmeras. Também é possível para um observador pontuar manualmente o comportamento de congelamento. - Defina o congelamento como uma cessação completa dos movimentos corporais, exceto os necessários para a respiração, para um mínimo de 1 s.
- Saltos de pontuação quando todas as 4 patas saem do chão, resultando em um movimento vertical e/ou horizontal.
- Exporte o arquivo marcado com marcadores de congelamento, salto e evento.
- Extrair eventos relevantes (congelamento e saltos) de períodos de tempo definidos (por exemplo, 10 s duração de pré-SCS, tom e ruído branco, para cada ensaio).
- Utilizando as durações de início de parada extraídas de eventos em um arquivo de planilha, calcule a duração do congelamento (em s) subtraindo o tempo de início a partir do tempo final, a partir dos respectivos períodos de ensaio.
- Represente este teste de dados em termos de teste ou em dia, resumindo a duração do congelamento de todos os ensaios.
NOTA: Dependendo da finalidade do estudo, os comportamentos de voo ou congelamento podem ser pontuados e calculados a partir de qualquer ensaio/duração da sessão de estudo. - Soma o número total de saltos de uma duração de teste específica.
- Extrair o arquivo gerado pelas coordenadas de rastreamento do mouse a partir do movimento do eixo quadro X-Y do centro de gravidade do mouse e calcular a velocidade do mouse (cm/s).
NOTA: Os dados de velocidade podem estar presentes no formato cm/s ou pixel/s. Converta a unidade pixel/s em cm/s usando valor de polegada ou cm/pixel definido no vídeo para esse contexto de teste (consulte a seção 3.6). - Depois de extrair dados de velocidade para o movimento quadro por quadro do animal, com base na taxa de quadros do vídeo (preferencialmente 30 quadros/s), calcule a velocidade média do animal em um suporte específico de número de quadro (multiplique os tempos de início e fim em s por 30 para obter o número do quadro inicial e final).
- Calcule as pontuações de voo dividindo a velocidade média durante cada SCS pela velocidade média durante os 10 s pré-SCS (linha de base, BL) e, em seguida, adicionando 1 ponto para cada salto de fuga (speedCS/speedBL + # de saltos). Uma pontuação de voo de 1, portanto, não indica nenhuma mudança no comportamento de voo do período pré-SCS.
- Opcionalmente, marque vídeos manualmente para outros comportamentos, como criação e preparação.
6. Análise estatística
- Analisar dados para significância estatística utilizando software de análise estatística. Para todos os testes, a definição de significância estatística é P<0,05.
- Verifique os dados para distribuição normal usando o teste de normalidade Shapiro-Wilk (α=0,05).
- Para testar o efeito das pistas, realize as comparações pareadas usando o teste paramétrico apropriado (t-test emparelhado) ou não paramétrico (teste de classificação assinada de Wilcoxon).
- Para avaliar a interação de 2 vias de fatores (teste cue X), realize um ANOVA de 2 vias seguido de testes pós-hoc (por exemplo, teste de comparação múltipla de Bonferroni/teste de Tukey).
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Representative Results
Conforme descrito no diagrama(Figura 1A),a sessão começa com pré-exposição (Dia 1), seguida pelo condicionamento do medo (Dias 2 e 3), e depois extinção ou recuperação (dia 4).
As apresentações do SCS na sessão de pré-exposição (Dia 1) não provocaram voo ou resposta de congelamento nos camundongos(Figura 2A-2B). A análise comportamental durante o condicionamento (Dias 2 e 3) revelou que o componente de tom do SCS aumentou significativamente o congelamento em relação ao congelamento durante o pré-SCS (Figura 2B,2E). As pontuações dos voos mudaram significativamente nas sessões (Dia 1 ao Dia 3, n = 20; Figura 2A). Os ratos apresentaram maior velocidade e mais saltos, e, portanto, maiores pontuações de voo, para a deixa de ruído branco em comparação com o tom (Figura 2C-2D). Os ratos mostraram uma clara transição de comportamento defensivo - exibindo pontuações de voo mais baixas durante o tom seguido de pontuações de voo mais altas durante o ruído branco(Figura 2F) e vice-versa para respostas de congelamento(Figura 2G).
Para testar o efeito da proximidade e do contexto da ameaça no voo condicionado, os camundongos foram divididos em dois grupos: um grupo passou por treinamento de extinção no contexto de condicionamento (Figura 3A-3B), e outro grupo foi testado para recordação de memória de medo, expondo-os ao SCS em um contexto neutro(Figura 3C-3D). Camundongos submetidos aos 16 ensaios de treinamento de extinção mostraram rápida extinção do voo condicionado (n = 12). As pontuações de voo durante o primeiro bloco de quatro ensaios foram maiores durante o ruído branco em comparação com o tom (Figura 3A). O comportamento de voo não foi mais provocado por nenhuma das pistas no final da sessão de extinção. Houve uma diminuição geral do congelamento induzido pelo tom e um aumento no congelamento mediado pelo ruído branco durante a sessão de extinção. O congelamento para o primeiro bloco de quatro ensaios foi significativamente maior em relação ao tom em comparação com o ruído branco(Figura 3B). Isso sugere que a iminência da ameaça é vital para a resposta ao voo.
A resposta de voo foi diminuída de forma dependente do contexto. A exposição ao ruído branco no contexto neutro não provocou voo (n = 8). Em vez disso, apresentações de ruído branco no contexto neutro provocaram respostas de congelamento maiores do que as provocadas pelo tom (Figura 3C-3D). Isso demonstra a importância do contexto na modulação da resposta defensiva.
Figura 1: Estude o projeto para avaliar o congelamento e o paradigma de voo.
A) Diagrama das sessões comportamentais. B) Diagrama detalhando a composição do estímulo composto serial (SCS), bem como o tempo dos EUA. C) Contexto A - servido como um contexto neutro, e utilizado durante as sessões de pré-exposição e recall. D) Contexto B – usado para condicionamento do medo. Este número foi modificado a partir de Fadok et al. 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resposta de voo condicionada.
A) Comparação das pontuações médias de voo em termos de teste (n = 20) após a apresentação do tom e do ruído branco nos dias 1-3. Observou-se uma mudança significativa nos escores de voo ao longo das sessões (Dia 1 ao dia 3; medidas repetidas bidirecional ANOVA, sugestão × interação experimental, F (13.266) = 5.795; P<0,0001). O teste de comparação múltipla de Bonferroni pós-hoc revela uma diferença significativa entre o tom e os escores de voo induzidos por ruído branco no fear conditioning Day 1 (trial 4, P < 0.05) e Day 2 (ensaios 2-5, P < 0.001). B) Comparação do congelamento médio de % no estudo durante os períodos de tom e ruído branco nos dias 1-3. Observe uma mudança estatisticamente significativa no congelamento de % ao longo das sessões (Dia 1 a Dia 3, n = 20; duas formas de ANOVA, deixa × interação experimental, F (13,266) = 20,81; P < 0,001; Figura 2B). O teste de comparação múltipla de Bonferroni pós-hoc revela uma diferença significativa entre o tom e o ruído branco induzidos pelo congelamento no medo condicionando o dia 1 (teste 4 e 5, P < 0,001) e dia 2 (todos os ensaios, P < 0,001). C) Comparação do número de respostas de fuga de salto durante os períodos pré-SCS, tom, ruído branco e choque no dia 3. A ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de múltiplas comparações de Bonferroni, mostrou que os saltos de fuga foram significativamente maiores durante o ruído branco e o choque em comparação com o período de tom (P < 0,01 e P < 0,001, respectivamente). D) Comparação das pontuações de voo durante a apresentação do tom e do ruído branco no dia 3. Observe uma pontuação de voo significativamente maior no dia 3 durante o período de ruído branco (P < 0,001, Wilcoxon matched-pairs signed-rank test). E) Comparação de % congelamento durante o pré-SCS, tom e ruído branco no dia 3. O comportamento de congelamento no dia 3 revela um efeito significativo do tom e do ruído branco (medidas repetidas de mão única ANOVA, F = 56,82, P<0,01). O teste de comparações múltiplas de Bonferroni mostrou que a apresentação de tom aumenta significativamente % de congelamento versus duração pré-SCS (P < 0,01), enquanto o congelamento de % foi significativamente reduzido em comparação com as duraçãos pré-SCS e tom (ambos P < 0,001). Os dados representativos de teste mostram transições de comportamento de voo (F) e congelamento(G) após a apresentação de tom e ruído branco no mouse no dia 3. Os valores representados são ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P <0.001. Pré-exp, pré-exposição. Os painéis A-E são modificados da Fadok et al., 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Extinção e recall após o condicionamento do voo (Dia 4).
A) Comparação dos escores de voo durante o treinamento de extinção mostrou rápida extinção do voo condicionado (n = 12; 16 ensaios, anova de duas formas repetidas, a interação de teste de ×, F(15.165) = 3,05, P < 0,01). As pontuações de voo do primeiro bloco de quatro ensaios (teste 1-4) de extinção observaram significativamente mais alto para o ruído branco em comparação com o tom (P < 0,05, Wilcoxon matched-pairs signed-rank test). B) A comparação do congelamento mostrou efeito estatisticamente significativo no congelamento (%) seguindo o ruído branco (n = 12; 16 ensaios, duas formas repetidas ANOVA, deixa × interação experimental, F(15.165) = 3,55, P < 0,01). O congelamento para o primeiro bloco de quatro ensaios (teste 1-4) durante a extinção encontrou-se significativamente menor durante o período de ruído branco em comparação com o tom (T-test emparelhado, P < 0,01). C) As alterações no contexto afetam significativamente os escores de voo (n = 8; 4 ensaios, anova de duas formas, a sugestão × interação experimental, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Os escores de voo reduziram significativamente durante o ruído branco em comparação com o período de tom no contexto neutro (teste t-test emparelhado de duas caudas, P < 0,01) D). As respostas de congelamento em todos os ensaios durante a recuperação também foram significativas (n = 8, 4 ensaios, anova de duas formas repetidas, efeito da deixa F(1,7) = 27,67, P < 0,01). A exposição da WN em contexto neutro aumentou significativamente as respostas de congelamento em comparação com o tom (teste t emparelhado de duas caudas, P < 0,001). Os valores representados são ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P <0.001. Os painéis A-D são modificados a partir de Fadok et al. 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os parâmetros de som e choque descritos são elementos importantes deste protocolo. É fundamental, portanto, testar a amplitude de choque e o nível de pressão sonora antes de iniciar os experimentos. Estudos de condicionamento do medo normalmente usam níveis de pressão sonora de 70-80 dB e intensidade de choque de 0,1-1 mA18; assim, os parâmetros descritos estão dentro dos limites dos paradigmas tradicionais de condicionamento do medo. Em um experimento de controle anterior de CS (sem choque de pé), não observamos respostas de voo ou congelamento nos camundongos, indicando que os estímulos auditivos não são aversivos quando apresentados comodescritos 15. O aumento do nível dB do ruído branco acima de 80 dB pode induzir aversão inata. No entanto, os estímulos sonoritas apresentados a 75 dB não provocam estresse na forma de atividade comportamental suprimida em camundongos19.
Os estímulos auditivos que compõem o SCS devem ser cuidadosamente selecionados. Em nosso estudo anterior, determinamos que o condicionamento único de CS com ruído branco induz escores de voo mais altos do que o condicionamento com um tom puro15. Isso ilustra a importância da saliência de estímulo neste protocolo20. No entanto, um estudo recente mostrou que o condicionamento com uma reversão da sequência SCS (tom de ruído branco) resulta em voo para o tom e congelamento para o ruído branco21. Esses dados endossam que a relação temporal aprendida das pistas também é um fator importante.
Como as mudanças na gaiola são uma fonte potencial de estresse, recomenda-se iniciar o condicionamento pelo menos 2 dias após a mudança mais recente da gaiola. Para minimizar ainda mais o impacto do estresse nos camundongos submetidos ao estudo, deve-se tomar cuidado para reduzir as pistas olfativas remanescentes de indivíduos anteriores, incluindo o cheiro de fezes e urina. Portanto, limpar a câmara antes e depois de cada rato é crucial. Para evitar outras fontes potenciais de perturbação, é melhor conduzir este protocolo em uma sala separada de qualquer outro experimento em andamento. Os ratos devem exibir um congelamento muito baixo da linha de base15. Para testar as condições experimentais, cada laboratório deve realizar um experimento piloto para testar o congelamento da linha de base em cada contexto.
Além do C57BL/6J e outras linhas transgênicas utilizadas por Fadok et al. (2017)15, este método deve ser adequado para adaptação a outras cepas de camundongos e ratos20,21. Dados recentes (Borkar et al. 2020)22 sugerem que tanto os camundongos masculinos quanto os femininos apresentam respostas de voo comparáveis, portanto o paradigma é adequado para ambos os sexos. Como mencionado na etapa 2.1.2, em resposta a choques de alta intensidade, os ratos saltam muito alto, assim selecione cuidadosamente a altura da câmara para evitar que os ratos escapem do contexto. Também é importante garantir o tempo consistente e preciso de pistas e estímulos de choque. Tanto os choques AC quanto DC são eficazes; no entanto, ao usar choques DC, pode ser necessário aumentar a intensidade do choque do pé para atingir pontuações de voo semelhantes às dos choques CA. Como os choques dc têm um efeito menos prejudicial nas gravações eletrofisiológicas, o uso de choque DC é recomendado para estudos que requerem dados de eletrofisiologia. É importante notar que diminuir a intensidade do choque do pé pode diminuir a intensidade da resposta ao voo.
Como denotado no protocolo, os escores de voo são calculados pela normalização dos dados de velocidade durante o tom e o ruído branco, dividindo-os com valores de velocidade pré-SCS de teste individual. No entanto, se um mouse exibe níveis extremamente altos de congelamento durante o pré-SCS, as pontuações de voo resultantes podem ser muito altas, aumentando assim a variabilidade dos dados. Isso pode ser contornado usando uma medição de linha de base diferente, como dados de velocidade média do período de 3 minutos de linha de base no início da sessão ou usando a velocidade média do pré-SCS geral (média de 5 ensaios), em vez de valores pré-SCS de teste individual.
A adaptação comportamental flexível e rápida à ameaça é crucial para a sobrevivência. A maioria dos protocolos clássicos de condicionamento do medo usam condições que induzem o congelamento como um único determinante do aprendizado do medo. A vantagem deste protocolo é que permite o estudo de complexas transições de estado defensivo dentro dos sujeitos. Anteriormente, este modelo foi usado para descobrir que as transições comportamentais são processadas por circuitos inibitórios recorrentes locais na amígdala central15,23. Esse paradigma também permitiu aos pesquisadores elucidar circuitos cortico-tálâmicos para a seleção do comportamento defensivo21. Esses estudos demonstram que esse método facilitará estudos que investiguem o controle de circuito neural de transições rápidas entre comportamentos defensivos dentro de um assunto. Isso tem aplicações potenciais para desenvolver uma melhor compreensão dos fundamentos neurobiológicos da ansiedade, transtorno de pânico ou TEPT24,25.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Regentes da Louisiana através do Fundo de Apoio ao Conselho de Regentes (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) e pelo Instituto Nacional de Saúde Mental dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R01MH122561. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral context | Plexiglass cylinder 30 X 30 cm | ||
| Fear conditioning box | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 25 X 30 X 35 cm dimentions |
| Audio generator | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| Shocker | Med Associates Inc. | ENV-414S | Stainless steel grid |
| Speaker | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | Suitable for pure tone and white noise |
| C57/BL6J mice | Jackson laboratory, USA | 664 | Aged 3-5 month |
| Cineplex software (Editor/ studio) | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | For video tracking and behavioral scoring analysis |
| MedPC software V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | Version 8 | Statistical analysis software |
References
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