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Behavior

Un nouveau paradigme pavlovien de conditionnement de la peur pour étudier le gel et le comportement de vol

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61536
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Psychology, Tulane University, 2Tulane Brain Institute, Tulane University

Summary

Les réactions comportementales défensives dépendent de l’intensité de la menace, de la proximité et du contexte d’exposition. Sur la base de ces facteurs, nous avons développé un paradigme de conditionnement classique qui suscite des transitions claires entre le gel conditionné et le comportement de vol chez les sujets individuels. Ce modèle est crucial pour comprendre les pathologies impliquées dans l’anxiété, la panique et les troubles de stress post-traumatique.

Abstract

Les comportements liés à la peur et à l’anxiété contribuent de façon significative à la survie d’un organisme. Cependant, les réponses défensives exagérées à la menace perçue sont caractéristiques de divers troubles anxieux, qui sont la forme la plus répandue de maladie mentale aux États-Unis. La découverte des mécanismes neurobiologiques responsables des comportements défensifs facilitera le développement de nouvelles interventions thérapeutiques. Le conditionnement pavlovien de la peur est un paradigme de laboratoire largement utilisé pour étudier l’apprentissage et la mémoire liés à la peur. Une limitation majeure des paradigmes traditionnels de conditionnement de la peur pavlovienne est que le gel est le seul comportement défensif surveillé. Nous avons récemment développé un paradigme modifié de conditionnement de la peur pavlovienne qui nous permet d’étudier à la fois le gel conditionné et le comportement de vol (également connu sous le nom d’évasion) chez les sujets individuels. Ce modèle utilise des contreforts de plus grande intensité et un plus grand nombre d’appariements entre le stimulus conditionné et le stimulus non conditionné. En outre, ce paradigme de vol conditionné utilise la présentation en série de tonalité pure et de stimuli auditifs de bruit blanc comme stimulus conditionné. Après conditionnement dans ce paradigme, les souris présentent un comportement glacial en réponse au stimulus de tonalité, et les réponses de vol pendant le bruit blanc. Ce modèle de conditionnement peut être appliqué à l’étude des transitions rapides et flexibles entre les réponses comportementales nécessaires à la survie.

Introduction

La peur est une réponse adaptative conservée de façon évolutionnelle à une menaceimmédiate 1,2. Alors que les organismes possèdent des réponses défensives innées à une menace, les associations savantes sont cruciales pour obtenir des réponses défensives appropriées aux stimuli prédictifs du danger3. La dysrégulation dans les circuits cérébraux contrôlant les réponses défensives est susceptible de contribuer aux réactions inadaptées associées à de multiples troubles anxieux débilitants, tels que le syndrome de stress post-traumatique(SSPT),le trouble panique 4 et les phobiesspécifiques 5,6. Le taux de prévalence aux États-Unis pour les troubles anxieux est de 19,1 % chez les adultes et de 31,9 % chez les adolescentsde 7à8 ans. Le fardeau de ces maladies est extrêmement élevé sur la routine quotidienne des individus et a des répercussions négatives sur leur qualité de vie.

Au cours des dernières décennies, le conditionnement de la peur pavlovienne a servi de système modèle puissant pour obtenir un aperçu énorme des mécanismes neuronaux sous-jacents à l’apprentissage et à lamémoire liés à la peur 9,10,11. Le conditionnement pavlovien de crainte implique l’appariement d’un stimulus conditionné (CS, tel qu’un stimulus auditif) avec un stimulus aversif non conditionné (ETATS-UNIS ; par exemple, un choc électrique de pied)12. Parce que le gel est le comportement dominant évoqué et mesuré dans les paradigmes de conditionnement pavloviens standard, les mécanismes de contrôle neuronal des formes actives de comportement défensif tels que les réponses d’évasion/vol restent largement inexplorés. Des études antérieures montrent que différentes formes de comportement défensif, comme le vol, sont évoquées en fonction de l’intensité de la menace, de la proximité et ducontexte 13,14. L’étude de la façon dont le cerveau contrôle différents types de comportement défensif peut contribuer de manière significative à la compréhension des processus neuronaux qui sont dysregulated dans les troubles de la peur et de l’anxiété.

Pour répondre à ce besoin critique, nous avons développé un paradigme de conditionnement pavlovien modifié qui suscite des sauts de vol et d’évasion, en plus degeler 15. Dans ce paradigme, les souris sont conditionnées par un stimulus composé en série (SCS) composé d’un ton pur suivi d’un bruit blanc. Après deux jours d’appariement du SCS avec un fort choc électrique, les souris présentent un gel en réponse au composant de tonalité et au vol pendant le bruit blanc. Les commutateurs comportementaux entre le gel conditionné et le comportement de vol sont rapides et cohérents. Fait intéressant, les souris présentent un comportement de vol seulement lorsque le bruit blanc CS est présenté dans le même contexte qu’un choc de pied précédemment livré (le contexte de conditionnement) mais pas dans un contexte neutre. Au lieu de cela, les réponses de congélation dominent dans ce contexte neutre, avec des niveaux significativement plus élevés de gel en réponse au bruit blanc par rapport au ton. Cela est conforme au rôle du contexte dans la modulation de l’intensité de la réponse défensive et au rôle réglementaire de l’information contextuelle dans l’apprentissage et la mémoire liés à la peur que l’on retrouve dans les paradigmes traditionnels de conditionnementdes menaces 16,17. Ce modèle permet des comparaisons directes, à l’intérieur du sujet, de multiples comportements défensifs d’une manière spécifique au contexte.

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Protocol

Les étapes/procédures suivantes ont été menées conformément aux lignes directrices institutionnelles après approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Tulane.

1. Préparation de souris

  1. Utilisez des souris adultes mâles et/ou femelles âgées de 3 à 5 mois. Dans la présente étude, nous avons utilisé des souris mâles C57BL/6J obtenues auprès de Jackson Laboratory, mais toute souche de souris provenant d’un fournisseur réputé peut être utilisée.
  2. Au moins une semaine avant l’expérience, abritez toutes les souris individuellement sur un cycle lumière/obscurité de 12:12 h tout au long de l’étude. Fournir aux souris ad libitum l’accès à la nourriture et à l’eau.
  3. Effectuez toutes les expériences comportementales pendant le cycle de lumière. Effectuez toutes les séances à la même heure de la journée au sein d’une cohorte individuelle. Par exemple, si vous démarrez l’expérience à 9 h le jour 1, continuez à partir de ce moment-là jusqu’à ce que l’expérience soit terminée.

2. Préparation du matériel d’étude

  1. Contextes d’étude
    1. Choisissez deux contextes différents pour effectuer les expériences.
    2. Utilisez une chambre cylindrique composée de plexiglas clairs (diamètre 30 cm) comme contexte A, avec un plancher en plexiglas lisse. La hauteur de la chambre doit être suffisante pour empêcher l’évasion (au moins 30 cm de haut).
    3. Pour le contexte B, utilisez une enceinte rectangulaire (25 cm x 30 cm) avec un plancher de réseau électrique utilisé pour fournir des contreforts de courant alternatifs. La hauteur de cette chambre est très importante et devrait être d’au moins 35 cm de haut. Vous pouvez également utiliser un toit transparent (assurez-vous que la vidéo peut être enregistrée à travers ce matériel).
      REMARQUE : Utilisez une chambre avec des surfaces murales lisses qui peuvent être facilement nettoyées.
    4. Utilisez une solution de nettoyage différente pour nettoyer les contextes. Par exemple, contexte propre A avec 1% d’acide acétique et contexte B avec 70% d’éthanol. Nettoyez les contextes avant de commencer la première session, entre tester des souris individuelles et après la fin des sessions de la journée. Ceci est essentiel pour enlever les indices olfactifs des souris précédentes. Un nettoyage en profondeur aidera également à prévenir l’échelle de l’urine sur la grille de choc, ce qui compromettra les séances de conditionnement.
      REMARQUE : Les solutions de nettoyage servent également de signal olfactif, donc utiliser le même liquide nettoyant pour un contexte particulier.
    5. Placer le contexte A ou le contexte B dans une boîte atténuante pendant les sessions d’étude respectives.
  2. Générateur audio
    1. Montez un haut-parleur au-dessus des contextes pour fournir des stimuli auditifs à 75 dB.
    2. Utilisez un générateur audio programmable pour générer des stimuli auditifs sur un calendrier prédéfini. Le ton pur de 7,5 kHz est un son avec une forme d’onde sinusoïde, tandis que le bruit blanc est un signal aléatoire ayant une intensité égale à différentes fréquences, allant de 1-20.000 Hz.
    3. Utilisez des impulsions TTL pour délivrer des stimuli auditifs et des signaux de choc avec une précision temporelle.
      REMARQUE : Avant de commencer les expériences, mesurez la sortie d’intensité sonore du haut-parleur monté dans chaque chambre à l’aide d’un compteur dB.
  3. Shocker: Connectez le shocker avec le plancher du réseau électrique qui est utilisé pour fournir le choc AC de 0,9 mA. Définissez la fréquence, l’apparition et la durée des chocs dans un programme informatique. Offrez chaque stimulus de choc à la fin de chaque SCS pour une durée de 1 s, totalisant cinq paires SCS-choc par séance de conditionnement.

3. Préparation d’un programme informatique et d’un suivi vidéo

  1. Générer des protocoles comportementaux à l’aide du codage dans un logiciel.
  2. Dans le programme, définissez le SCS de stimulus composé en série. Ce stimulus est une présentation en série d’un ton pur de 10 s (chaque pip est présenté pour 500 ms, à une fréquence de 7,5 kHz et taux de 1 Hz) et 10 s de bruit blanc (500 ms pips à 1 Hz).
  3. Définissez les intervalles inter-essais (ITI) présentés après chaque essai, pseudorandomly.
  4. Au cours de l’étude, enregistrez tous les comportements de la souris à la vidéo pour analyse ultérieure.
    REMARQUE : Les boîtes de conditionnement de la peur disponibles dans le commerce ne peuvent pas être installées pour enregistrer les comportements à l’intermédiaire de la caméra montée en haut. Ceci est très important puisque la vidéo enregistrée est utilisée pour calculer le mouvement horizontal, la vitesse et la distance totale parcourue par l’animal.
  5. Pour définir le suivi logiciel, placez une souris de test dans chaque contexte pertinent, ajustez la sensibilité au suivi du contour et définissez le centre de gravité. Cela permettra d’assurer l’acquisition de données fiables sur la position relative. En outre, définissez l’ensemble du contexte accessible au sujet.
    REMARQUE : L’ajustement de la taille du contour pour les deux contextes est important car le changement de luminosité dans différents contextes changera la taille du contour.
  6. Déterminez un coefficient d’étalonnage à l’aide des tailles connues des chambres et des dimensions pixel de la caméra qui peuvent être utilisées pour calculer la vitesse (cm/s).
  7. Synchronisez les événements de l’ordinateur d’acquisition de données en temps réel avec leurs occurrences en temps réel.

4. Expérience comportementale

  1. Allumez tout l’équipement : ordinateurs, contrôleur de boîte de conditionnement de peur, shocker, et logiciel d’enregistrement vidéo et de timestamp. Assurez-vous que les instruments sont allumés dans l’ordre approprié.
  2. Vérifiez toutes les fonctions, y compris le ton, le bruit blanc et la livraison de choc, et configurez le système pour l’acquisition de données.
  3. Transportez les animaux de leur salle de stockage à la salle de conditionnement. Laissez-leur s’y acclimater pendant au moins 10 min.
  4. Sortez l’animal de la cage de la maison, placez-le doucement dans le contexte respectif, puis activez immédiatement les programmes informatiques.
    REMARQUE : L’initialisation du système de conditionnement de la peur et du logiciel de collecte de données (timestamps, suivi de souris et enregistrement vidéo) à la fois peut être synchronisée à l’aide d’activations pulsées TTL.
  5. Pré-conditionnement/pré-exposition
    1. Le jour 1, placez le sujet dans le contexte A (contexte neutre). Laissez-le s’acclimater à la chambre pendant 3 min (la période de référence), puis exposez-le à 4 essais d’un SCS de 20 s de durée totale (figure 1A-1B).
    2. Maintenir une ITI pseudorandom moyenne de 90 s (plage 80-100 s). La durée totale de chaque séance de pré-exposition est de 590 s.
  6. Conditionnement de la peur
    1. Le jour 2 et le jour 3, placez le sujet dans le contexte B. Après une période de référence de 3 min, exposez le sujet à cinq appariements de la co-terminaison SCS avec un 1 s, 0,9 mA ac footshock.
    2. Maintenir une ITI pseudorandom moyenne de 120 s (plage 90-150 s). Avoir chaque séance de conditionnement durer pendant 820 s au total (Figure 1A).
    3. Selon l’objectif de l’expérience, soumettre les souris le jour 4 à un test de rappel (voir étape 4.7) ou craindre l’extinction (voir l’étape 4.8).
  7. Rappel de la peur (pour tester la dépendance au contexte)
    1. Le jour 4, placez le sujet dans le contexte A. Après la période de référence de 3 min, présentez-le avec 4 essais du SCS sans réplique, plus de 590 s.
    2. Maintenir une ITI pseudorandom moyenne de 90 s (plage 80-100 s).
  8. Peur de l’extinction
    1. Le jour 4, placez le sujet dans le contexte B. Après la période de référence de 3 min, présenter 16 essais du SCS sans réplique, plus de 1910 s.
    2. Maintenir une ITI pseudorandom moyenne de 90 s (plage 60-120 s).
  9. Retournez l’animal dans sa cage et répétez la procédure pour tous les animaux.

5. Quantification du comportement

  1. Avoir un observateur aveugle à l’expérience marquer les vidéos enregistrées pour le comportement de congélation à l’aide de seuil de détecteur de congélation automatique suivie d’une analyse image par image des changements de pixels.
    REMARQUE : D’autres logiciels peuvent également être utilisés pour calculer automatiquement le gel à l’aide d’un système de 2 caméras. Il est également possible pour un observateur de marquer manuellement le comportement de congélation.
  2. Définissez le gel comme une cessation complète des mouvements corporels, à l’exception de ceux requis pour la respiration, pour un minimum de 1 s.
  3. Score saute lorsque les 4 pattes quittent le sol, ce qui entraîne un mouvement vertical et / ou horizontal.
  4. Exportez le fichier marqué avec des marqueurs de congélation, de saut et d’événement.
  5. Extraire les événements pertinents (gel et sauts) des périodes définies (p. ex., durée de 10 s de pré-SCS, ton et bruit blanc, pour chaque essai).
  6. À l’aide des durées d’arrêt de démarrage extraites des événements dans un fichier de feuille de calcul, calculer la durée du gel (en s) en soustrayant l’heure de début de l’heure de fin, à partir des périodes d’essai respectives.
  7. Représenter ces données du point de vue de l’essai ou du jour, en résumant la durée de gel de tous les essais.
    REMARQUE : Selon le but de l’étude, les comportements de vol ou de congélation peuvent être notés et calculés à partir de n’importe quel essai/durée de la session d’étude.
  8. Résumez le nombre total de sauts d’une durée d’essai particulière.
  9. Extraire le fichier généré par les coordonnées de suivi de la souris à partir du mouvement de l’axe X-Y image par image du centre de gravité de la souris et calculer la vitesse de la souris (cm/s).
    REMARQUE : Les données de vitesse peuvent être présentes dans le format cm/s ou pixel/s. Convertissez l’unité pixel/s en cm/s en utilisant la valeur de pouce ou cm/pixel définie dans la vidéo pour ce contexte de test (veuillez voir la section 3.6).
  10. Après avoir extrait des données de vitesse pour le mouvement image par image de l’animal, en fonction de la fréquence d’image de la vidéo (de préférence 30 images/s), calculer la vitesse moyenne de l’animal dans un support de nombre d’images spécifique (multiplier les heures de début et de fin en s par 30 pour obtenir le numéro d’image de début et de fin).
  11. Calculez les scores de vol en divisant la vitesse moyenne pendant chaque SCS par la vitesse moyenne pendant le 10 s pré-SCS (ligne de base, BL) puis en ajoutant 1 point pour chaque saut d’échappement (speedCS/speedBL + # de sauts). Un score de vol de 1 n’indique donc aucun changement dans le comportement de vol par rapport à la période pré-SCS.
  12. En option, marquer des vidéos manuellement pour d’autres comportements tels que l’élevage et le toilettage.

6. Analyse statistique

  1. Analyser les données pour la signification statistique à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Pour tous les tests, la définition de la signification statistique est P<0.05.
  2. Vérifiez les données pour une distribution normale à l’aide du test de normalité Shapiro-Wilk (α=0,05).
  3. Pour tester l’effet des indices, effectuez les comparaisons dans le sens pair à l’aide du test paramétrique approprié (t-test apparié) ou non paramétrique (test de rang signé Wilcoxon).
  4. Pour évaluer l’interaction à deux entre les facteurs (essai cue X), effectuez un ANOVA à deux, suivi de tests post-hoc (p. ex., le test de comparaison multiple de Bonferroni/test de Tukey).

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Representative Results

Comme décrit dans le diagramme (Figure 1A), la session commence par la pré-exposition (Jour 1), suivie par le conditionnement de la peur (jours 2 et 3), puis soit l’extinction ou la récupération (Jour 4).

Les présentations du SCS lors de la séance de pré-exposition (jour 1) n’ont pas suscité de réaction de vol ou de congélation chez les souris (figure 2A-2B). L’analyse comportementale pendant le conditionnement (jours 2 et 3) a révélé que la composante tonalité du SCS a considérablement amélioré le gel par rapport au gel pendant le pré-SCS (figure 2B,2E). Les scores de vol ont considérablement changé d’une séance à l’autre (jour 1 au jour 3, n = 20; Figure 2A). Les souris ont montré une vitesse plus élevée et plus de sauts, et donc des scores de vol plus élevés, à la queue de bruit blanc par rapport à la tonalité (Figure 2C-2D). Les souris ont montré une transition claire du comportement défensif - présentant des scores de vol inférieurs pendant le ton suivi de scores de vol plus élevés pendant le bruit blanc (Figure 2F) et vice-versa pour les réponses de congélation (Figure 2G).

Pour tester l’effet de la proximité de la menace et du contexte sur le vol conditionné, les souris ont été divisées en deux groupes : un groupe a suivi une formation sur l’extinction dans le contexte de conditionnement (figure 3A-3B), et un autre groupe a été testé pour le rappel de la mémoire de peur en les exposant au SCS dans un contexte neutre (figure 3C-3D). Les souris soumises aux 16 essais de formation à l’extinction ont montré l’extinction rapide du vol conditionné (n = 12). Les scores de vol au cours du premier bloc de quatre essais étaient plus élevés pendant le bruit blanc que le ton( Figure 3A). Le comportement de vol n’a plus été obtenu par l’un ou l’autre des indices à la fin de la session d’extinction. Il y a eu une diminution globale du gel induit par le tonus et une augmentation du gel par le bruit blanc pendant la session d’extinction. Le gel pour le premier bloc de quatre essais était significativement plus élevé que le ton par rapport au bruit blanc (Figure 3B). Cela donne à penser que l’imminence de la menace est essentielle à l’intervention en vol.

L’intervention en vol a été diminuée d’une manière dépendante du contexte. L’exposition au bruit blanc dans le contexte neutre n’a pas suscité de vol (n = 8). Au lieu de cela, les présentations de bruit blanc dans le contexte neutre ont suscité des réponses glaciales qui étaient plus élevées que celles obtenues par le ton (Figure 3C-3D). Cela démontre l’importance du contexte dans la modulation de la réponse défensive.

Figure 1
Figure 1 : Conception de l’étude pour évaluer le gel et le paradigme de vol.
A) Diagramme des sessions comportementales. B) Diagramme détaillant la composition du stimulus composé en série (SCS), ainsi que le moment des États-Unis. C)Contexte A - a servi de contexte neutre et a été utilisé lors des séances de pré-exposition et de rappel. D) Contexte B – utilisé pour le conditionnement de la peur. Ce chiffre a été modifié à partir de Fadok et coll. 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Réponse de vol conditionnée.
A) Comparaison des scores moyens de vol du point de vue de l’essai (n = 20) après présentation du ton et du bruit blanc pendant les jours 1 à 3. Un changement important dans les scores de vol entre les sessions a été noté (jour 1 au jour 3; mesures répétées dans les deux sens ANOVA, indice × interaction d’essai, F (13, 266) = 5,795; P<0.0001). Le test comparatif multiple de Bonferroni post-hoc révèle une différence significative entre les scores de vol induits par le ton et le bruit blanc au jour 1 de conditionnement de la peur (essai 4, P < 0,05) et au jour 2 (essais 2-5, P < 0,001). B)Comparaison du gel moyen du point de congélation du point de vue de l’essai pendant les périodes de tonalité et de bruit blanc entre les jours 1 et 3. Notez un changement statistiquement significatif du gel en % au cours des sessions (jour 1 au jour 3, n = 20; mesures répétées dans les deux sens ANOVA, indice × interaction d’essai, F (13, 266) = 20,81; P < 0,001; Figure 2B). Le test comparatif multiple de Bonferroni post-hoc révèle une différence significative entre le gel induit par le ton et le bruit blanc au jour 1 de conditionnement de la peur (essai 4 et 5, P < 0,001) et le jour 2 (tous les essais, P < 0,001). C) Comparaison du nombre de réponses d’évasion de saut pendant les périodes de pré-SCS, de tonalité, de bruit blanc et de choc le jour 3. ANOVA à sens unique suivi du test de comparaisons multiples de Bonferroni a montré que les sauts d’évasion étaient significativement plus élevés pendant le bruit blanc et le choc par rapport à la période de tonalité (P < 0,01 et P < 0,001, respectivement). D) Comparaison des scores de vol lors de la présentation du ton et du bruit blanc le jour 3. Notez des scores de vol significativement plus élevés le jour 3 pendant la période de bruit blanc (P < 0.001, Wilcoxon appariés-paires signé-grade test). E) Comparaison du % de gel pendant le pré-SCS, le ton et le bruit blanc le jour 3. Le comportement de congélation le jour 3 révèle un effet significatif du ton et du bruit blanc (mesures répétées à sens unique ANOVA, F = 56,82, P<0,01). Le test de comparaisons multiples de Bonferroni a montré que la présentation du ton augmente considérablement % le gel par rapport à la durée antérieure au SCS (P < 0,01), tandis que le gel en % a été considérablement réduit par rapport aux durées antérieures au SCS et aux tonalités (P < et 0,001). Les données représentatives du point de vue de l’essai montrent les transitions du comportement de vol (F) etde congélation( G ) après la présentation du ton et du bruit blanc dans la souris le jour 3. Les valeurs représentées sont les ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Pré-exp, Pré-exposition. Les panneaux A-E sont modifiés à partir de Fadok et coll., 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Extinction et rappel après conditionnement de vol (jour 4).
A) La comparaison des scores de vol pendant l’entraînement à l’extinction a montré l’extinction rapide du vol conditionné (n = 12; 16 essais, des mesures répétées dans les deux sens ANOVA, l’interaction d’essai cue ×, F (15 165) = 3,05, P < 0,01). Les scores de vol du premier bloc de quatre essais (essai 1-4) d’extinction observés significativement plus élevés pour le bruit blanc par rapport au ton (P < 0,05, Wilcoxon appariés-paires signé-grade test). B) La comparaison du gel a montré un effet statistiquement significatif sur le gel (%) à la suite du bruit blanc (n = 12; 16 essais, mesures répétées dans les deux sens ANOVA, indice × interaction d’essai, F(15 165) = 3,55, P < 0,01). Le gel pour le premier bloc de quatre essais (essai 1-4) pendant l’extinction s’est révélé significativement plus faible pendant la période de bruit blanc par rapport à la tonalité (T-test apparié, P < 0,01). C) Les changements dans le contexte influent de façon significative sur les scores de vol (n = 8; 4 essais, les mesures répétées dans les deux sens ANOVA, l’interaction d’essai cue ×, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). Les scores de vol ont considérablement diminué pendant le bruit blanc par rapport à la période de tonalité dans le contexte neutre (t-test jumelé à deux queues, P < 0,01) D). Les réponses de congélation entre les essais pendant la récupération étaient également significatives (n = 8, 4 essais, mesures répétées dans les deux sens ANOVA, effet du signal F(1,7) = 27,67, P < 0,01). L’exposition du WN dans un contexte neutre a considérablement augmenté les réponses de congélation par rapport à la tonalité (t-test jumelé à deux queues, P < 0,001). Les valeurs représentées sont les ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. Les panneaux A-D sont modifiés à partir de Fadok et coll. 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les paramètres sonores et de choc décrits sont des éléments importants de ce protocole. Il est donc essentiel de tester l’amplitude de choc et le niveau de pression sonore avant de commencer les expériences. Les études sur le conditionnement de la peur utilisent généralement des niveaux de pression sonore de 70 à 80 dB et une intensité de choc de 0,1 à 1 mA18; ainsi, les paramètres décrits sont dans les limites des paradigmes traditionnels de conditionnement de la peur. Dans une expérience précédente de contrôle cs-only (pas de choc de pied), nous n’avons pas observé des réponses de vol ou de congélation chez les souris, indiquant que les stimulus auditifs ne sont pas aversifs lorsqu’ils sont présentéscomme décrit 15. L’augmentation du niveau dB du bruit blanc au-dessus de 80 dB peut induire une aversion innée. Cependant, les stimulus de bruit présentés à 75 dB ne provoquent pas le stress sous forme d’activité comportementale supprimée chez les souris19.

Les stimuli auditifs qui composent le SCS doivent être soigneusement sélectionnés. Dans notre étude précédente, nous avons déterminé que le conditionnement mono-CS avec le bruit blanc induit des scores de vol plus élevés que le conditionnement avec un ton pur15. Cela illustre l’importance de l’importance de la stimulation dans ceprotocole 20. Toutefois, une étude récente a montré que le conditionnement avec un renversement de la séquence SCS (bruit blanc-ton) entraîne un vol vers le ton et le gel au bruit blanc21. Ces données soutiennent que la relation temporelle apprise des indices est également un facteur important.

Étant donné que les changements de cage sont une source potentielle de stress, il est recommandé de commencer à conditionner au moins 2 jours après le changement de cage le plus récent. Afin de minimiser davantage l’impact du stress chez les souris en cours d’étude, il convient de prendre soin de réduire les indices olfactifs restants des sujets précédents, y compris l’odeur des selles et de l’urine. Par conséquent, le nettoyage de la chambre avant et après chaque souris est crucial. Pour éviter d’autres sources potentielles de perturbation, il est préférable de mener ce protocole dans une pièce séparée de toute autre expérience en cours. Les souris devraient présenter une congélation de base trèsfaible 15. Pour tester les conditions expérimentales, chaque laboratoire devrait mener une expérience pilote pour tester le gel de base dans chaque contexte.

Outre le C57BL/6J et d’autres lignées transgéniques utilisées par Fadok et coll. (2017)15, cette méthode devrait convenir à l’adaptation à d’autres souches de souris et de rats20,21. Des données récentes (Borkar et coll. 2020)22 suggèrent que les souris mâles et femelles montrent des réponses de vol comparables, c’est pourquoi le paradigme convient aux deux sexes. Comme mentionné à l’étape 2.1.2, en réponse à des chocs de haute intensité, les souris sautent très haut, sélectionnent donc soigneusement la hauteur de la chambre pour empêcher les souris d’échapper au contexte. Il est également important d’assurer le moment cohérent et précis des indices et des stimuli de choc. Les chocs AC et DC sont efficaces; toutefois, lors de l’utilisation de chocs DC, il peut être nécessaire d’augmenter l’intensité des chocs pour atteindre des scores de vol similaires à ceux des chocs AC. Puisque les chocs de DC ont un effet moins préjudiciable sur des enregistrements électrophysiologiques, l’utilisation du choc de DC est recommandée pour des études qui exigent des données d’électrophysiologie. Il est important de noter que la diminution de l’intensité du choc peut diminuer l’intensité de la réponse en vol.

Comme indiqué dans le protocole, les scores de vol sont calculés en normalisant les données de vitesse pendant le ton et le bruit blanc en les divisant avec les valeurs de vitesse avant SCS d’essai individuelles. Toutefois, si une souris présente des niveaux extrêmement élevés de congélation pendant le SCS avant, les scores de vol qui en résultent peuvent être très élevés, augmentant ainsi la variabilité des données. Cela peut être contourné en utilisant une mesure de base différente, comme les données de vitesse moyenne de la période de référence de 3 min au début de la session ou en utilisant la vitesse moyenne de l’ensemble pré-SCS (moyenne de 5 essais), au lieu des valeurs individuelles d’essai Pré-SCS.

L’adaptation comportementale flexible et rapide à la menace est cruciale pour la survie. La plupart des protocoles classiques de conditionnement de la peur utilisent des conditions qui induisent le gel comme seul déterminant de l’apprentissage de la peur. L’avantage de ce protocole est qu’il permet d’étudier les transitions complexes de l’état défensif dans les sujets. Précédemment, ce modèle a été employé pour découvrir que les transitions comportementales sont traitées par des circuits inhibiteurs récurrents locaux dans l’amygdalecentrale 15,23. Ce paradigme a également permis aux chercheurs d’élucider les circuits cortico-thalamiques pour la sélection du comportement défensif21. Ces études démontrent que cette méthode facilitera les études sur le contrôle des circuits neuronaux des transitions rapides entre les comportements défensifs au sein d’un sujet. Ceci a des applications potentielles pour développer une meilleure compréhension des fondements neurobiologiques de l’inquiétude, du désordre de panique, ou du PTSD24,25.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Louisiana Board of Regents par l’intermédiaire du Board of Regents support fund (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) et du National Institute of Mental Health des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01MH122561. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral context Plexiglass cylinder 30 X 30 cm 
Fear conditioning box Med Associates, Inc. VFC-008 25 X 30 X 35 cm dimentions
Audio generator  Med Associates, Inc. ANL-926 
Shocker Med Associates Inc. ENV-414S Stainless steel grid
Speaker Med Associates, Inc. ENV-224AM Suitable for pure tone and white noise 
C57/BL6J mice Jackson laboratory, USA 664 Aged 3-5 month
Cineplex software (Editor/ studio) Plexon CinePlex Studio v3.8.0 For video tracking and behavioral scoring analysis
MedPC software V Med Associates, Inc. SOF-736
Neuroexplorer Plexon Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc. Version 8 Statistical analysis software

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References

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Comportement Numéro 167 Conditionnement de la peur gel fuite anxiété peur panique comportement défensif
Un nouveau paradigme pavlovien de conditionnement de la peur pour étudier le gel et le comportement de vol
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Borkar, C. D., Fadok, J. P. A Novel… More

Borkar, C. D., Fadok, J. P. A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior. J. Vis. Exp. (167), e61536, doi:10.3791/61536 (2021).

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