Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

يتم قياس تكامل المدخلات المتشابكة المتنوعة إلى الخلايا العصبية على أفضل نحو في إعداد يحافظ على جميع النوى قبل متشابك التوقيت الطبيعي ولدونة الدائرة، ولكن شرائح الدماغ عادة قطع العديد من الاتصالات. قمنا بتطوير شريحة الدماغ المعدلة لمحاكاة في نشاط الدائرة الجسمية مع الحفاظ على القدرة على التجريب في المختبر.

Abstract

في في المختبر شريحة تقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية قياس نشاط خلية واحدة مع دقة دقيقة الكهربائية والزمانية. يجب أن تكون شرائح الدماغ رقيقة نسبيًا لتصور الخلايا العصبية والوصول إليها بشكل صحيح لقط اللصق أو التصوير ، ويقتصر الفحص المختبري للدوائر الدماغية على ما هو موجود فعليًا في الشريحة الحادة فقط. للحفاظ على فوائد التجريب شريحة في المختبر مع الحفاظ على جزء أكبر من النوى presynaptic، وضعنا إعداد شريحة جديدة. تم تصميم هذه "شريحة إسفين" لتسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية المشبك لتميز المدخلات المتنوعة التي تعتمد على الصوت إلى الخلايا العصبية أحادية الأمعاء (MOC) في جذع الدماغ. هذه الخلايا العصبية تلقي المدخلات الأولية afferent استثارة ومثبطة من الخلايا العصبية تنشيطها من قبل المحفزات في الأذن contralateralral ونواة القوقعة المقابلة (CN). تم تصميم شريحة الدماغ غير المتماثلة التي هي الأكثر سمكا في المجال الدوكوال روسترو على الحافة الجانبيه لنصف الكرة واحد ثم رقيقة نحو الحافة الجانبيه من نصف الكرة الأرضية المقابل. هذه الشريحة تحتوي, على الجانب السميك, جذر العصب السمعي نقل المعلومات حول المحفزات السمعية إلى الدماغ, الدوائر CN الجوهرية, وعلى حد سواء مثير disynaptic وtrisynaptic مسارات المثبطة التي تتلاقى على الخلايا العصبية موك contralateral. يتم إجراء التسجيل من الخلايا العصبية MOC على الجانب رقيقة من شريحة, حيث يتم تصورها باستخدام البصريات DIC للتجارب التصحيح المشبك نموذجي. يتم تنفيذ التحفيز المباشر للأعصاب السمعية عند دخولها إلى جذع الدماغ السمعي ، مما يسمح لنشاط الدائرة CN الجوهرية واللدونية متشابك أن يحدث في نقاط الاشتباك العصبي من الخلايا العصبية MOC. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن يحاكي في تنشيط الدائرة الكهربائية في الجسم الحي بأكبر قدر ممكن من القرب داخل شريحة. هذا إعداد شريحة إسفين ينطبق على دوائر الدماغ الأخرى حيث تحاليل الدوائر سوف تستفيد من الحفاظ على الاتصال المنبع والمدخلات طويلة المدى، في تركيبة مع المزايا التقنية من فيزيولوجيا شريحة في المختبر.

Introduction

يتم تنفيذ مراقبة نشاط الدوائر العصبية بشكل مثالي مع المدخلات الحسية الأصلية والتغذية المرتدة ، والاتصال السليم بين مناطق الدماغ ، في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن إجراء التجارب التي تعطي دقة الخلية الواحدة لوظيفة الدائرة العصبية لا يزال محدودًا بسبب التحديات التقنية في الدماغ السليم. بينما في الجسم الحي خارج الخلية electrophysiology أو طرق التصوير متعددة الصور يمكن استخدامها للتحقيق في النشاط في النظم العصبية سليمة، وتفسير كيفية دمج المدخلات المختلفة أو قياس المدخلات subthreshold متشابك يبقى من الصعب. في تسجيلات الخلية الكاملة في الجسم الحي تتغلب على هذه القيود ولكن تشكل تحديا لأداء، حتى في مناطق الدماغ التي يتم الوصول إليها بسهولة. تتضخم التحديات التقنية لتجارب دقة الخلايا المفردة في بعض مجموعات الخلايا العصبية التي تقع في عمق الدماغ، أو في مجموعات سكانية منتشرة مكانياً تتطلب إما أدوات جينية لتحديد مكان الخلايا في الجسم الحي (على سبيل المثال، التعبير الجيني للقناه البروتوpsين المقترن بتسجيل optrode) أو تحديد الهوية الهستوكيميائية بعد تسجيل العلامات (على سبيل المثال مع علامات خاصة بـ neurotransmission). يجري تقع على نحو منتشر بالقرب من السطح البطني للأدمغة, الخلايا العصبية olivocochlear الوسيط (MOC) تعاني من القيود المذكورة أعلاه1,مما يجعلها من الصعب للغاية للوصول لفي التجارب الحية.

شرائح الدماغ (~ 100-500 μm سمك) منذ فترة طويلة تستخدم لدراسة دوائر الدماغ، بما في ذلك الدوائر الدماغ السمعية، وذلك بسبب الفصل المادي للخلايا العصبية المتصلة التي ترد داخل نفس شريحة2،3،4،5،6،7،8،9. وقد استخدمت التجارب باستخدام شرائح أكثر سمكا بكثير (> 1 ملم) في مختبرات أخرى لفهم كيفية دمج المدخلات الثنائية في مناطق مجمع أوليفاري متفوقة (SOC) بما في ذلك الزيتون متفوقة الوسيط10،11. تم إعداد هذه الشرائح بحيث أن محاور عصبية من العصب السمعي (AN) ظلت سليمة داخل شريحة وحفزت كهربائيا لبدء إطلاق الناقل العصبي متشابك في CN, محاكاة نشاط الخلايا العصبية السمعية من الدرجة الأولى لأنها سوف تستجيب للصوت. عيب رئيسي واحد من هذه الشرائح سميكة هو رؤية الخلايا العصبية للتسجيلات الكهربائية التضيق المشبك ("الترقيع"). يصبح التصحيح صعبة بشكل متزايد كما تصبح محاور عصبية عديدة في هذا المجال النخاعي مع سن12,13,14,15, مما يجعل الأنسجة الخلايا العصبية الكثيفة بصريا وحجب حتى في نموذجي, شريحة الدماغ رقيقة. هدفنا هو خلق في تجهيزات في المختبر التي تشبه بشكل أوثق اتصال الدائرة في تسجيلات الجسم الحي، ولكن مع قدرات عالية الإنتاجية وتسجيل عالية الدقة من البصرية توجيه التصحيح المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا في شرائح الدماغ.

مختبرنا يحقق في فسيولوجيا الخلايا العصبية في النظام السمعي الـإفرازي، بما في ذلك الخلايا العصبية MOC. هذه الخلايا العصبية الكولينية تقديم ردود الفعل efferent إلى قوقعة الأذن عن طريق تحوير نشاط خلايا الشعر الخارجي (OHCs)16,17,18,19,20. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا التشكيل يلعب دوراً في السيطرة على القوقعة21،22،23،24،25،26 والحماية من الصدمة الصوتية27،28،29،30،31،32،33. في الفئران، تقع الخلايا العصبية MOC منتشر في النواة البطنية من الجسم شبه المنحرف (VNTB) في الدماغ السمعي1. وقد استخدمت مجموعتنا خط الماوس ChAT-IRES-Cre عبر مع خط الماوس مراسل tdTomato لاستهداف الخلايا العصبية MOC في شرائح جذع الدماغ تحت الإضاءة الظهارة. أظهرنا أن الخلايا العصبية MOC تلقي مدخلات مثبطة afferent من نواة الوسيطة ipsilateral من الجسم شبه المنحرف (MNTB)، وهو متحمس، بدوره، من قبل محاور عصبية من الخلايا شجيرة كروية (GBC) في نواة القوقعة contralateral (CN)34،35،36،38. بالإضافة إلى ذلك, الخلايا العصبية MOC من المرجح تلقي مدخلاتها استثارة من الخلايا التي تى-ممتاز في الـ CN contralateralral39,40,41. معا، وتظهر هذه الدراسات الخلايا العصبية MOC تلقي كل من المدخلات الإثارة والمثبطة المستمدة من نفس الأذن (contralateralral). ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية presynaptic، ومحور عصبيتها تتلاقى على الخلايا العصبية MOC، ليست قريبة جدا بما فيه الكفاية لبعضها البعض لتكون سليمة تماما في إعداد شريحة الإكلالية نموذجية. للتحقيق في كيفية دمج المدخلات متشابك لالخلايا العصبية MOC يؤثر على أنماط إطلاق النار المحتملة عملهم، مع التركيز على تثبيط وصفها حديثا، وضعنا إعداد التي يمكن أن تحفز afferents متنوعة إلى الخلايا العصبية MOC من أذن واحدة في الطريقة الأكثر واقعية من الناحية الفسيولوجية ممكن، ولكن مع الفوائد التقنية لتجارب شريحة الدماغ في المختبر.

شريحة إسفين هو إعداد شريحة سميكة معدلة مصممة للتحقيق في التكامل الدائرة في الخلايا العصبية MOC (المخطط في الشكل 1A). على الجانب السميك من الشريحة، يحتوي الإسفين على المحاور الحادة للأعصاب السمعية (التي يطلق عليها "جذر العصب السمعي" فيما بعد) عند دخولها جذع الدماغ من المحيط والمشابك في النفثالين. يمكن تحفيز جذر العصب السمعي كهربائيا لاستحضار الافراج عن الناقل العصبي وتفعيل متشابك من الخلايا من CN سليمة تماما42،43،44،45،46. هذا الشكل التحفيز له العديد من الفوائد لتحليل الدائرة. أولا، بدلا من تحفيز مباشرة من المحاور T-ممتاز و GBC التي توفر مدخلات من الداخل إلى الخلايا العصبية MOC، ونحن نحفز AN للسماح لتنشيط الدوائر الجوهرية وفيرة في CN. هذه الدوائر تعدل انتاج الخلايا العصبية CN لأهدافها في جميع أنحاء الدماغ، بما في ذلك الخلايا العصبية MOC46،47،48،49،50،51. ثانيا، التنشيط polysynaptic من الدوائر afferent من AN من خلال المنبع CN من الخلايا العصبية MOC يسمح لتوقيت التنشيط أكثر طبيعية ولدونة أن يحدث في هذه نقاط الاشتباك العصبي كما يفعلون في الجسم الحي خلال التحفيز السمعي. ثالثاً، يمكننا أن نختلف أنماط التحفيز لدينا لمحاكاة نشاط AN. وأخيرا، كل من الإسقاطات الإثارة والمثبطة إلى الخلايا العصبية MOC سليمة في شريحة إسفين، ويمكن قياس تكاملها في الخلايا العصبية MOC مع دقة الفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك. ككل، يوفر هذا المخطط التنشيط دائرة أكثر سلامة إلى الخلايا العصبية MOC مقارنة بإعداد شريحة الدماغ نموذجية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الشريحة إسفين جذع الدماغ للتحقيق في المناطق السمعية الأخرى التي تتلقى مدخلات المثبطة من IPSilateral MNTB بما في ذلك الزيتون الجانبي متفوقة، نواة أوليفاري متفوقة والزيتون متفوقة وسيطة10،11،52،53،54،55،56. أبعد من إعدادنا محددة، يمكن استخدام هذه الطريقة تشريح أو تعديل لتقييم أنظمة أخرى مع فوائد الحفاظ على الاتصال من المدخلات طويلة المدى وتحسين التصور من الخلايا العصبية لمجموعة متنوعة من الخلايا وحيدة الدقة الكهربائية أو تقنيات التصوير.

يتطلب هذا البروتوكول استخدام مرحلة هزاز أو منصة يمكن إمالة حوالي 15 درجة. هنا نستخدم مرحلة مغناطيسية متاحة تجاريا 2 قطعة حيث "المرحلة" هو قرص معدني مع أسفل منحني وضعت في "قاعدة مرحلة المرحلة" مقعرة المغناطيسي. يمكن بعد ذلك أن يتم نقل المرحلة لضبط زاوية الشريحة. وتستخدم الدوائر متحدة المركز على قاعدة المرحلة لتقدير زاوية reproducibly. يتم وضع مرحلة وقاعدة المرحلة في غرفة تشريح، حيث يمكن أيضا قاعدة المرحلة المغناطيسية يمكن أن تكون استدارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية / المعهد الوطني للصم وغيرها من اضطرابات الاتصال رعاية الحيوان واستخدام لجنة.

1- الاستعدادات التجريبية

ملاحظة: التفاصيل المتعلقة بإعداد شريحة بما في ذلك تقطيع الحل، وتقطيع درجة الحرارة، شريحة حضانة درجة الحرارة والجهاز (الخ) محددة لإعداد جذع الدماغ التي أجريت في هذه التجربة. يمكن تغيير تفاصيل حضانة الشريحة لكل تجربة مختبرية.

  1. إعداد الحلول الداخلية لقط التصحيح.
    1. تحضير الجهد المشبك الحل الذي يحتوي (في mM) 76 Cs-methanesulfonate، 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5Na 2-phosphocreatine, 5 QX-314, و 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. ضبط درجة اله إلى 7.2 مع CsOH.
    2. تحضير محلول المشبك الحالي الذي يحتوي على (في mM) 125 K-gluconate, 5 KCl, 1 MgCl2,0.1 CaCl2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na 2-phosphocreatine, و 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. ضبط درجة اله إلى 7.2 مع KOH.
  2. إعداد 100 مل من 4٪ أجار عن طريق إضافة 4 غرام من أجار إلى 100 مل الساخنة (قرب الغليان) الماء. وضع على لوحة اثارة ساخنة للحفاظ على درجة الحرارة ويحرك حتى يذوب تماما. صب في 100 ملم أطباق بيتري البلاستيكية إلى عمق 1 سم تقريبا والسماح تبرد. يُبرّد حتى الحاجة.
  3. تحضير 1 لتر السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2,1.3 MgSO4,5 KCl, 26 NaHCO3,1.25 KH2PO4,و 10 dextrose. فقاعة مع كاربوجين (5٪ CO2 / 95٪ O2)لمدة 10 دقيقة على الأقل، ثم ضبط درجة الهـو النهائية إلى 7.4 مع 1 M NaOH إذا لزم الأمر. الحفاظ على الأوكسجين وhh من الحل عن طريق محتدما باستمرار مع كاربوجين في جميع أنحاء التجربة.
  4. إعداد 200 مل حل تشريح بإضافة 1 mm حمض kynurenic إلى ACSF. سونيكات حل في حمام المياه sonicating لمدة 10 دقيقة حتى يتم حل حمض الكيورينيك. فقاعة باستمرار مع كاربوجين ومكان على الجليد.
    تنبيه: استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع حمض الكينيريك.
  5. قم بتركيب شفرة مناسبة في الاهتزاز باتباع تعليمات الشركة المصنعة. هدئ الاهتزازات تقطيع الغرفة عن طريق تطويقها مع الجليد.

2. إزالة الدماغ مع جذر العصب السمعي سليمة للتحفيز

ملاحظة: تم الحصول على الفئران لهذه التجارب عن طريق عبور الفئران المعدلة وراثيا ChAT-IRES-Cre على خلفية C57BL/6J مع فئران مراسل tdTomato (Ai14). كانت الفئران المستخدمة في علم الأنسجة وعلم الفيزيولوجيا الكهربائية بداية ما بعد السمع (P14-P23) ، والتي تدور حول P12 في الفئران. وقد وصفت الخلايا العصبية التي تعبر tdTomato في النواة البطنية للجسم شبه المنحرف (VNTB) سابقاً كغيبينات MOC في هذا الخط الماوس57.

  1. القتل الرحيم (مثل الاختناق CO2) وقطع رأس الحيوان باستخدام إجراءات مؤسسية معتمدة.
  2. باستخدام شفرة حلاقة، قطع الجلد في خط الوسط من الجمجمة من الأنف إلى الجزء الخلفي من الرقبة. قشر الجلد مرة أخرى لفضح الجمجمة.
  3. باستخدام مقص صغير، وجعل شق في الجمجمة من خلال خط الوسط بدءا من قاعدة (نهاية السد قرب الحبل الشوكي) من الجمجمة والاستمرار نحو الأنف.
  4. في خياطة لامدا، جعل التخفيضات في الجمجمة من خط الوسط، الجانبي نحو الأذن على كلا الجانبين. قشر الجمجمة لفضح الدماغ.
  5. بدءا من نهاية روسترال، ورفع بلطف الدماغ بعيدا عن الجمجمة مع ملعقة مختبر صغير أو ملقط حادة. قطع العصب البصري والاستمرار في العمل بلطف الدماغ إلى الوراء، وفضح السطح البطني.
  6. قطع الأعصاب ثلاثية التوائم عن طريق معسر لهم مع ملقط غرامة بالقرب من السطح البطني من جذع الدماغ.
    ملاحظة: القيام بذلك بعناية كما يكمن العصب الدهليزية تحت هذا فقط، ويحتاج إلى أن تكون سليمة للتحفيز في نهاية المطاف.
  7. وضع إعداد في طبق بيتري الزجاج مليئة حل تقطيع الباردة. ضع الطبق تحت مجهر تشريح. فقاعة بلطف مع كاربوجين.
  8. تقليم العصب الوجهي على مقربة من جذع الدماغ وفضح العصب الدهسي.
  9. باستخدام ملقط غرامة، ودفع النصائح في foramina حيث العصب vestibulocochlear يخرج الجمجمة قدر الإمكان وقرصة العصب لقطع ذلك، وترك جذر العصب تعلق على جذع الدماغ. كرر هذا على الجانب الآخر.
  10. مرة واحدة على حد سواء جذور الأعصاب هي حرة، وإزالة السحائيات والأوعية الدموية من السطح البطني للدم المدبر بالقرب من الجسم شبه المنحرف.
  11. حرر الدماغ تمامًا من الجمجمة عن طريق قرص الأعصاب القحفية المتبقية والأنسجة الضامة مع الحرص على الحفاظ على الحبل الشوكي المتبقي إن أمكن.

3. كتلة وجبل الدماغ على خشبة المسرح (القرص المغناطيسي)

  1. إعداد سطح الدماغ لإصلاح إلى المرحلة عن طريق منع الدماغ على مستوى chiasm البصرية.
    1. مع السطح البطني، قم بتثبيت الدماغ باستخدام أداة حادة لشل الحبل الشوكي بلطف بحيث لا يميل الدماغ خلال الخطوة التالية.
    2. على مستوى chiasm البصرية، واستخدام ملقط مفتوحة لإنشاء الطائرة لعرقلة الدماغ عن طريق إدراج من خلال الدماغ وصولا الى الجزء السفلي من الطبق. إدراج ملقط في زاوية من 20 درجة تقريبا من العمودي بحيث نصائح الخروج من سطح الظهر من الcaudal الدماغ إلى chiasm البصرية.
    3. قطع على طول ملقط باستخدام شفرة الحلاقة.
  2. الغراء الدماغ على سطح المرحلة.
    1. إعداد كتلة صغيرة (~ 1 سم3)من 4٪ أجار لدعم الدماغ.
    2. وضع قطرة صغيرة من الغراء على خشبة المسرح ونشرها في مستطيل بحيث يمكن لصقها على حد سواء في الدماغ وكتلة أجار إلى أسفل.
    3. باستخدام ملقط، ورفع بعناية الدماغ والداب بلطف السائل الزائد باستخدام حافة منشفة ورقية. وضع السطح المحجوب على الغراء، وسوف يكون السطح البطني نحو شفرة أثناء تشريح.
    4. دفع كتلة أجار بلطف ضد سطح الظهر في الدماغ لدعمه أثناء التقطيع وضمان تحديد الموضع السليم للدماغ (أي الزاوية).

4. الدماغ شريحة لخلق شريحة إسفين

ملاحظة: إعداد شريحة الدماغ باستخدام هزاز الذي يحتوي على جذر العصب القوقعة على الجانب السميك والخلايا العصبية olivocochlear الوسيط (MOC) ونواة الوسط من الجسم شبه المنحرف (MNTB) على الجانب رقيقة.

  1. ضع القرص المغناطيسي مع الدماغ المرفق على قاعدة المرحلة وضعه في غرفة التقطيع مع السطح البطني للدماغ الموجه نحو الشفرة.
  2. ملء الغرفة مع الجليد الباردة تقطيع الحل وفقاعات مع كاربوجين.
  3. خفض النصل في الحل وقطع شرائح caudal إلى المنطقة ذات الأهمية للتأكد من شرائح متناظرة. إذا كانت الشرائح تبدو غير متناظرة، إمالة المرحلة قليلا للحصول على التماثل.
    ملاحظة: كانت سرعات الشفرة بين 0.05-0.10 مم/س فعالة لقطع شرائح صحية وقد تختلف حسب عمر الحيوان ومنطقة الدماغ.
  4. مرة واحدة في شرائح متناظرة، تحول المرحلة ~ 15° (المقابلة لحوالي 3 حلقات متحدة المركز على قاعدة المرحلة) إلى جانب واحد.
    ملاحظة: إزاحة المرحلة بعيدًا عن جذر العصب السمعي الذي تريد الحفاظ عليه في الشريحة.
  5. استمر في التقطيع بعناية حتى يكون جذر العصب السمعي قريبًا من السطح على جانب واحد ، ويمكن رؤية عصب الوجه على سطح الجانب الآخر.
  6. تحويل المرحلة 15 درجة إلى الموضع الأصلي.
  7. حرك الشفرة بعيدًا عن الأنسجة وتدور على قاعدة المرحلة 90 درجة بحيث تواجه الحافة الجانبية للجانب الرقيق النصل. خفض شفرة عدة مئات من ميكرون ومن ثم ببطء جعل شفرة قريبة من حافة الأنسجة. كرر هذا حتى تلامس الشفرة الحافة الجانبيّة. خفض شفرة إلى سمك المطلوب من حافة رقيقة من شريحة، وهنا 2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    ملاحظة: الشريحة الناتجة هي من الناحية المثالية ~ 300 مم سميكة على مستوى النواة البطنية من الجسم شبه المنحرف (VNTB) على الجانب حيث سيتم إجراء لقط التصحيح.
  8. نقل شفرة بعيدا عن الأنسجة وتدور قاعدة المرحلة مرة أخرى بحيث السطح البطني تواجه ذلك.
  9. جعل القطع الذي يعين السطح الرسترالية لشريحة إسفين. نقل شريحة إلى قطعة من ورق واجهة (1 سم2) سطح السد أسفل. نقل شريحة إلى غرفة الحضانة أو غيرها من جهاز الحضانة مناسبة للانتعاش (30 دقيقة في 35 درجة مئوية).
    ملاحظة: يجب أن يكون العصب الوجهي مرئياً على كلا نصفي الكرة الأرضية من الشريحة على السطح التاجي (انظر الشكل 1B).

5. تشكيل وقيولوجيا كهربائية بالتسجيل

  1. ضع شريحة إسفين في غرفة التسجيل وشريحة آمنة مع قيثارة أو نظام الاستقرار. اثقب الأنسجة بشكل مستمر بمعدل 7-10 مل/دقيقة مع دافئ (35 درجة مئوية) ACSF فقاعة مع كاربوجين.
  2. تحديد الخلايا العصبية MOC المسمى وراثيا في VNTB باستخدام epifluorescence مع مرشحات انبعاث 561 نانومتر لتسجيلات التصحيح المشبك. الوجه شريحة إذا كان هناك أي خلايا قابلة للتصحيح.
  3. باستخدام البصريات DIC، والتركيز على جذر العصب السمعي على الجانب السميك من شريحة واستخدام micromanipulator لتحريك القطب التنغستن ثنائي القطب لتحفيز وصولا الى جذر العصب السمعي وبلطف في سطح الأنسجة.
    ملاحظة: استخدمت أقطاب الشفط في تجارب تحفيز العصب السمعي في مختبرات أخرى. ويمكن استخدام أقطاب الزجاج ثيتا، أو طرق التحفيز البصري إذا كان ذلك ينطبق على الاستعدادات المحددة الأخرى.
  4. نقل مجال الرؤية مرة أخرى إلى VNTB لاختيار الخلايا العصبية MOC لاستهداف للصقع المشبك الكهربائي.
  5. تعبئة ماصة تسجيل مع الحل الداخلي المناسب للتجربة المقترحة.
  6. التصحيح وسجل من الخلايا العصبية MOC في تكوين الخلية الكاملة. تعويض السعة الغشاء ومقاومة سلسلة إذا لزم الأمر.
  7. ضبط سعة التحفيز الكهربائي من جذر العصب السمعي للحصول على أحداث ما بعد ينابتيك متسقة في الخلايا العصبية MOC.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تحريك قطب التحفيز.
  8. تشغيل بروتوكولات التحفيز المناسبة لمراقبة التيارات متشابك أثار في MOC (الجهد المشبك) أو أنماط العمل المحتملة (المشبك الحالي).
    ملاحظة: يمكن استخدام إعداد شريحة إسفين مع أي أدوات نموذجية التصحيح المشبك مثل تسجيلات التصحيح فضفاضة، علم الصيدلة، optogenetics، تصوير الكالسيوم، الناقل العصبي uncaging، الخ.

6. تأكيد النسيجية من نواة جذع الدماغ

ملاحظة: يتم ذلك مع تلطيخ البنفسج الكريسيل، في شريحة إسفين ثابتة، وإعادة مقطعة. هذه الطريقة تسمح للتصور النوى التي ترد في شريحة.

  1. بعد إعداد شريحة إسفين، غمر شريحة في التثبيت (4٪ PFA في PBS) بين عشية وضحاها. شطف شريحة 3x لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني (درجة حرارة الغرفة على شاكر)، ثم وضع في السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 °C لكريوكوبروتكت.
  2. إعادة المقطع شريحة على microtome تجميد (40-70 ملم) وجمع المقاطع المسلسل في لوحة 24 جيدا في برنامج تلفزيوني.
  3. تحميل المقاطع على شرائح مطلية الجيلاتين والسماح الجافة تماما. ضع الشرائح في حرف الشرائح.
  4. إعداد حلول البنفسج الكريسيل
    1. إعداد 1٪ خلات البنفسج الكرييل عن طريق خلط 5 ز خلات البنفسج كريسيل في 500 مل dH2O
    2. إعداد المخزن المؤقت خلات عن طريق إعداد أول 90 مل حل A (540 مل حمض الخليك الجليدي + 89.46 مل dH2O) و 10 مل حل B (136 ملغ خلات الصوديوم في 10 مل dH2O). الجمع بين الحل A وB الحل العائد المخزن المؤقت خلات.
    3. الجمع بين 1٪ خلات البنفسج الكرييل مع العازلة خلات 1:1 ل 0.5٪ بنفسجي كريسيل في العازلة خلات. تصفية قبل الاستخدام.
    4. إعداد 95٪ و 70٪ الإيثانول عن طريق تخفيف 100٪ الإيثانول مع أحجام مناسبة من dH2O
  5. تنفيذ بروتوكول تلطيخ البنفسج الكرسيل. نقل عربة الشريحة من خلال الصواني الحل، حل النشاف الزائد على منشفة ورقية بين الصواني: الزيلين – 5 دقائق؛ 95% الإيثانول – 3 دقائق; 70٪ الإيثانول – 3 دقائق; dH2O – 3 دقائق; 0.5% محلول البنفسج الكريسيل – 8-14 دقيقة رصد في كثير من الأحيان حتى يصبح تلطيخ نووي اللون الأرجواني الداكن; dH2O – 3 دقائق; 70٪ الإيثانول – 3 دقائق; 95٪ الإيثانول - 1-2 دقيقة؛ 100% الإيثانول – تراجع الشرائح مرتين; إكسيلين – 5 دقائق؛ إكسيلين: 25 دقيقة حتى يتم تنفيذ التركيب.
    تنبيه: استخدم الزيلينات فقط تحت غطاء أبخرة.
  6. إزالة الشرائح من إكسيلين واحد في وقت واحد ووضع على الفور زلات الغطاء على الشرائح باستخدام المتوسطة المتصاعدة. السماح للتصاعد المتوسطة إلى الجافة (بين عشية وضحاها).
  7. مقاطع الصور.

7. Biocytin وضع العلامات لتتبع anterograde من محاور عصبية في العيش ، والأنسجة غير المثبتة

  1. إعداد شريحة إسفين كما هو أعلاه (الخطوات 2-4).
  2. نقل الشريحة إلى ورق واجهة (~ 1 سم2). تحت مجهر تشريح، حدد موقع النفثالين على الجانب السميك من الشريحة.
  3. إزالة بعناية الزائدة ACSF من المنطقة المحيطة شريحة عن طريق التواء حتى زاوية من ورقة الأنسجة لرسم ACSF بعيدا عن الأنسجة. وهذا يمنع السيتين الحيوي من الانتشار إلى المناطق المحيطة بالشريحة مما قد يؤدي إلى امتصاص الخلايا خارج النفثالين.
  4. مع ملقط غرامة، حدد الكريستال صغيرة من السيتين الحيوي ووضعها على سطح النفثالين. اضغط بلطف على الكريستال في الأنسجة لتعزيز الاتصال مع الخلايا العصبية والإقبال اللاحقة في سوماتا. كرر هذه الخطوة لتغطية المنطقة المطلوبة من الاهتمام، في هذه الحالة مناطق CN التي تحتوي على الخلايا العصبية T-ممتاز و GBC.
  5. ضع الشريحة في غرفة حضانة. السماح لشريحة لاحتضان لمدة 2-4 ح في 35 درجة مئوية للسماح لامتصاص ونقل biocytin. بعد الحضانة، شطف شريحة في ACSF لإزالة أي جزيئات السيتين الحيوية.
  6. ضع شريحة في التثبيت (4٪ PFA في PBS) بين عشية وضحاها. شطف 3x لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني.
  7. كريوكت شريحة في 30% السكروز في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 °C أو حتى بالوعات شريحة.
  8. استرجع الأنسجة لإنتاج أقسام عرضية على ميكروتومات متجمدة عند 70-100 مم.
  9. الأنسجة العملية باستخدام أساليب المناعة المعيارية القياسية مع streptavidin مترافق فلوريا.
    ملاحظة: يمكن إجراء هستوستيكشيستري إضافي على الأقسام إذا كان مفيداً لوضع علامات على أجسام الخلايا presynaptic، والمحاور، المستقبلات، أو غيرها من الجزيئات متشابك مهم للتصور الدائرة (أي، خطوات الأجسام المضادة الأولية لا ينبغي أن تؤثر سلبا على التصور الثانوي biocytin).
  10. صورة الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فحص النسيج لشريحة إسفين
لتحقيقنا في وظيفة الخلايا العصبية الدماغ السمعية، تم تصميم إعداد شريحة إسفين لاحتواء جذر العصب السمعي والنيني contralateral إلى الخلايا العصبية MOC المستهدفة للتسجيلات (شريحة المثال هو مبين في الشكل 1B). الفحص النسيجي الأولي للتحضير مهم للتأكد من أن الشريحة تحتوي على النوى اللازمة لتنشيط الدائرة وأن الإسقاطات المحورية سليمة. نوعان من الخلايا داخل CN توفير معلومات سليمة ل الخلايا العصبية MOC. يتم افتراض الخلايا T-ممتاز لتوفير مدخلات استثارة ل الخلايا العصبية MOC39,40,41,58. الخلايا البوصية (GBC) تثير الخلايا العصبية MNTB في نصف الكرة الأرضية contralateral (عبر calyx المتخصصة من المشبك عقد)34,36,37,38,59,60 والتي, بدورها, توفير مدخلات المثبطة ل الخلايا العصبية MOC57 (الشكل التخطيطي 1A). لتأكيد وجود كل من الخلايا T-ممتاز و GBCs، ونحن إعادة مكمّل (إلى 50 ميكرومتر) شريحة إسفين التي تم إصلاحها بواسطة الغمر في PFA 4٪ وتنفيذ تلطيخ البنفسج كريسيل لتسمية سوماتا. في الجانب السميك من شريحة إسفين(الشكل 2، نصف الكرة الأيسر) ، كان النفثالين موجودًا في نطاقه الكامل تقريبًا. بالإضافة إلى ذلك، كانت التقسيمات الفرعية الظهرية والبينتية للنفثالين سليمة(الشكل 2؛ السهم و رأس السهم في S19). الخلايا العصبية T-ممتاز و GBCs الكتلة في نواة القوقعة البطني بالقرب من حيث العصب السمعي (الشكل 2; السهم في S17) يدخل CN61,62,63,64,65. شريحة إسفين يحتوي أيضا على الخلايا العصبية من ipsilateral MNTB إلى الخلايا العصبية MOC التي يتم تنفيذ التسجيلات (نصف الكرة الأرضية رقيقة من شريحة إسفين الأصلي، الجانب الأيمن في الشكل 2). وهذا يؤكد أن جزءا على الأقل من المدخلات المثبطة ل الخلايا العصبية MOC سليمة(الشكل 2, شرائح 1-15, أبرزها البيضاويات متقطعة في S11).

في تجارب منفصلة، أكدنا أن محاور عصبية والمحطات presynaptic من الخلايا العصبية CN كانت سليمة في شريحة إسفين باستخدام وضع العلامات anterograde مع biocytin. أولاً، تم إعداد شريحة إسفين حية ووضعها على ورق واجهة. مباشرة بعد إعداد شريحة إسفين، وضعت بلورات biocytin في النفثالين الذي سمح امتصاص ونقل anterograde على طول المحاور خلال فترة الحضانة. ثم تم إصلاح وإعادة اقطع الأنسجة (70 ملم أقسام) تم تنفيذها. تم تنفيذ تلطيخ المقاطع ذات الفلورسنت المسمى streptavidin لتصور محاور التركيز المسمى مع biocytin. صور Confocal من هذه المقاطع تظهر وضع علامات مشرق في CN حيث وضعت بلورات واتخذت في أجسام الخلية(الشكل 3A، نصف الكرة الأيسر ، منطقة متقطع). Axons الخروج CN على طول stria الصوتية البطنية(الشكل 3A، رؤوس الأسهم البيضاء) وصفت بوضوح ويمكن أن يتبع إلى نقاط الإنهاء الخاصة بهم. Biocytin إيجابية puncta المحيطة الخلايا العصبية MOC contralateral تشير إلى استعدادنا يحافظ على الاتصالات متشابك منشؤها CN (الشكل 3B). وبالمثل، تسمى calyces من عقد في MNTB contralateral تشير إلى محاور عصبية إسقاط من GBCs إلى الخلايا العصبية MNTB يتم الحفاظ عليها في شريحة إسفين(الشكل 3C). تؤكد هذه الفحوص النسيجية أن شريحة إسفيننا تحتوي على كل من أجسام الخلايا والإسقاطات المحورية للدوائر المدخلات المُطلقة إلى الخلايا العصبية MOC ، والتي تسمح لنا ، لذلك ، بقياس الاستجابات اللاحقة التي تثيرها تحفيز العصب السمعي والانتشار اللاحق للنشاط من خلال الدوائر الصاعدة.

علم وظائف الأعضاء متشابك في شريحة إسفين
تكامل مدخلات مثير ومثبط متشابك بشكل حاسم الأشكال نشاط الخلايا العصبية. وصفنا مؤخرا المدخلات المثبطة ل الخلايا العصبية MOC من الخلايا العصبية من MNTB57, ولكن تأثير دمج هذه المدخلات مع مدخلات مثير على نشاط الخلايا العصبية MOC غير معروف. في شريحة إسفين من ماوس ChAT-IRES-Cre x tdTomato ، تم إجراء تسجيلات الجهد المشبك من خلية عصبية MOC. تم تطبيق التيار عن طريق التنغستن القطب ثنائي القطب حفز يقودها وحدة العزل التحفيز لاستحضار الافراج عن الناقل العصبي من المحاور قبلية. أولاً تم تحفيز stria الصوتية البطنية (VAS) في خط الوسط كهربائيًا لتنشيط المحاور T-ممتاز مباشرة والخلايا العصبية MNTB عبر تحفيز المحاور GBC(الشكل 4A) ، لقياس الكمون إلى استجابات ما بعد التشابك في تكوين التسجيل الذي يحاكي تجارب الشريحة الرقيقة النموذجية(الشكل 4B)، آثار المثال ، الرمادي ، عقد المحتملة -60 mV). في تجارب منفصلة، تم تحفيز جذر العصب السمعي لتنشيط الدوائر الصعودية مونورية وتم قياس الاستجابات ما بعد متشابك في الخلايا العصبية MOC كما هو موضح أعلاه. أثار التحفيز الكهربائي في أي من الموقعين قطعة أثرية كهربائية سريعة متبوعة باستجابات حالية متعددة السبيرات (مثال على الردود من التحفيز AN في الشكل 4C، آثار سوداء ، تحمل إمكانات -60 mV). قارنا تدابير الكمون بداية من أول تيار ما بعد المينابتيتش (PSC) أثار مع التحفيز المباشر لل VAS مع تلك التي أثارت مع تحفيز العصب السمعي ووجدت زمن أطول بكثير لأحداث التحفيز AN. ويعزى ذلك إلى التأخير المشبكى الذي تم تكبده في المشبك AN/CN (AN التحفيز: 5.27 ± 0.43 مللي ثانية، متوسط ± الانحراف المطلق المتوسط (MAD)، نطاق 4.26-5.93 مللي ثانية، ن = 8؛ التحفيز VAS: 1.98 ± 0.28 مللي ثانية, متوسط ± MAD, نطاق 0.75-3.46 مللي ثانية, ن = 17; وقعت ويلكوكسيون اختبار الرتب، ع = 0.014، الشكل 4D). هذه النتائج تؤكد أن التحفيز من جذور العصب السمعية النتائج في تنشيط متشابك من الخلايا العصبية CN والنشاط الدائرة اللاحقة, أكثر تمثيلا في الجسم الحي – مثل توقيت من التحفيز المباشر من المحاور T-ممتاز أو GBC/MNTB.

مع لدينا cesium على أساس, عالية [كل-] حل داخلي المستخدمة في الجهد المشبك, مثير (الجلوتاتيرجي) ومثبطة (GABA وغليسينرجي) PSCs على حد سواء الداخل في غشاء الكامنة المحتملة (-60 mV) وبالتالي لا يمكن أن تكون مُميَّزة. بينما يستحضر نشاط الدائرة في تكوين AN تحفيز, نحن عزل كهربائيا المدخلات المثبطة المفترضة عن طريق تحويل عقد المحتملة إلى 0 mV, احتمال انعكاس التقريبي لAMPA توسطت التيارات الجلوتا التحكّم. في المثال لدينا الخلايا العصبية، لوحظت الردود الحالية في الخارج 0 mV(الشكل 4Ci، آثار حمراء) يدل على عمليات الانسهاكات الكلورية. هذه هي على الأرجح أن تكون الردود GABA- أو glycinergic متشابك. هذه البيانات تثبت فائدة شريحة إسفين لتنشيط كل من مدخلات مثير ومثبطة ل الخلايا العصبية MOC عن طريق تحفيز جذر العصب السمعي، مع تفعيل الدوائر afferent اللاحقة. وعلاوة على ذلك، تم استحضار أنماط متنوعة من الاستجابات ما بعد متشابك من قبل التحفيز AN، مما يشير إلى أنه حتى في ظل ظروف التحفيز متطابقة من محاور عصبية AN، نشاط الدائرة بأكملها هو دينامية ومعقدة. هذا النموذج التجريبي يسمح لتحليل مفصل لمدى تعقيد المحفزات السمعية تنتشر من خلال جذع الدماغ والاندماج في الخلايا العصبية MOC، وتحديد الناتج نظام موكو efferent وتأثير في نهاية المطاف على القوقعة.

Figure 1
الشكل 1: إسفين شريحة التخطيطي وصورة المثال. (أ) التخطيطي للدائرة olivocochlear ردود الفعل الوسط. الأسهم الزرقاء تشير إلى مسار تصاعدي afferent إلى الخلايا العصبية MOC والسهام السوداء تشير إلى مسار التغذية المرتدة التنازلي من الخلايا العصبية MOC إلى قاعدة خلايا الشعر الخارجي (OHC). (B) صورة برايتفيلد لشريحة إسفين مع تسميات من جذر العصب السمعي (ANR) ونواة قوقعة (مخطط متقطع) على الجانب السميك. تشير النجمة إلى الموقع التقريبي للنواة البطنية للجسم شبه المنحرف حيث تستهدف الخلايا العصبية MOC لقط التصحيح على الجانب الرقيق من شريحة الإسفين. خطوط سوداء متقطعة تشير إلى أعصاب الوجه التي يمكن رؤيتها في كلا نصفي الكرة الأرضية من الشريحة على السطح النجمي. IHC - خلية الشعر الداخلية، GBC - خلية زنجية كروية، SPN - نواة باراوليفاري متفوقة، MNTB - نواة وسيطة من الجسم شبه المنحرف، VNTB - نواة بطنية من الجسم شبه المنحرف، LSO - الزيتون متفوقة الجانبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقاطع من البنفسجية كريسيل ملطخة من شريحة إسفين التي تم إعادة تقسيمها في 50 ميكرومتر. كل قسم آخر تم تصويره. المقاطع هي ترقيم rostral --> caudal. تميل شرائح إسفين إلى احتواء كامل نواة القوقعة (CN) بما في ذلك كل من الـ DORSAL CN (السهم في S19) و VENTRAL CN (رأس السهم في S19)، جذر العصب السمعي (رأس السهم المفتوح في S17) والكثير من MNTB (المنطقة المظلمة بالقرب من السطح البطني في S3-S15، وتسليط الضوء عليها مع بيضاويات متقطعة في S11). D وV على شريط مقياس تمثل الظهرية وبطنتي في اتجاه شريحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: لا تزال axons من المدخلات التصاعدية إلى الخلايا العصبية MOC من نواة القوقعة اللاتينية سليمة في شريحة الإسفين. (أ)المقطع الأكثر من االسترالية من شريحة إسفين مأخوذة من P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (أحمر مضل) الماوس الذي تم إعادة مقطعته (70 ميكرومتر) ومعالجتها للتصور biocytin. صورة Confocal هي كومة إسقاط من البلاط، أقصى كثافة. يتم تمييز أكسون في stria الصوتية البطنية من قبل رؤوس الأسهم البيضاء. يشير المخطط التفصيلي المتقطع إلى الجزء الصغير من نواة القوقعة المتبقية في هذه الشريحة الأكثر من الرسترال. مقياس شريط 500 μm.(ب)صورة Confocal من ChAT-IRES-Cre x tdTomato الخلايا العصبية الإيجابية في VNTB مع البونكتا إيجابية biocytin في الخلايا العصبية المحيطة. شريط مقياس 50 ميكرومتر (C) Biocytin المسمى محاور المحاور تظهر عبور خط الوسط وإنهاء في MNTB contralateral كما calyces من عقد. يمثل الخط العمودي المتقطع خط الوسط للشريحة. مقياس شريط 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحفيز الكهربائي للمدخلات afferent في الجهد المشبك غلة multipeak التيارات بعد يناب في الخلايا العصبية MOC. (A) تخطيطي من شريحة إسفين مع تسجيل إعداد المتابعة لكل من التحفيز الصوتية البطنية (VAS) (القطب المحفز الرمادي) والتحفيز العصبي السمعي (AN) (أسود تحفيز القطب) من المدخلات afferent ل MOC. (ب) أمثلة من التيارات بعد المينابك (PSCs) من الخلايا العصبية P17 الفردية التي أثارت مع حافز كهربائي واحد بالقرب من خط الوسط في -60 mV. (C) PSCs أثار خلال التحفيز A في -60 mV في الخلايا العصبية P15. (Ci) مثال PSCs في نفس الخلية C أثار في 0 mV عقد المحتملة (احتمال انعكاس التقريبية لـ AMPA توسطت التيارات في إعداد تسجيل لدينا، أحمر). (د)البيانات السكانية لتحديد كمي من الكمون إلى PSC الأول ل VAS و AN التحفيز. مربعات: ربعي, خط inset: متوسط, مربع inset: متوسط, شعيرات: الانحراف المطلق المتوسط. * ص < 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإجراء تشريح وصفها هنا يطلق شريحة إسفين قوية للحفاظ على الدوائر العصبية presynaptic سليمة، ولكن مع إمكانية الوصول إلى تجربة شريحة الدماغ لتحليل وظيفة الخلايا العصبية. يجب توخي الحذر الشديد في عدة خطوات أولية من أجل تعظيم فائدة التحضير لتحليل الدوائر. يجب تأكيد أبعاد الإسفين باستخدام الفحص النسيجي، الذي يعد جزءًا لا يتجزأ من التأكيد على أن كلاً من النوى الصلية المُعدة للانوية وإسقاطاتها المحورية موجودة في شريحة إسفين المعدة. قد تتطلب هندسة الشريحة التعديل إذا تم قطع الإسقاطات أو وصول بعض المحاور إلى النوى المستهدفة. وبشكل عام، قطع التشطيب على هزاز لشريحة إسفين هو في غاية الأهمية. سيتطلب إعداد شريحة إسفين الأمثل مزيجًا من الاستخدام المتسق لتكوينات الاهتزازات بما في ذلك استخدام علامات الدائرة متحدة المركز على قاعدة المرحلة ، إلى جانب تعديل الإعدادات استنادًا إلى معالم الدماغ المعروفة. بعد التحسين من شريحة الهندسة, سجلنا متناسق PSCs في الخلايا العصبية MOC أثارها كهربائيا تحفيز جذر العصب السمعي في 8 من 18 شرائح إسفين. في عملنا السابق كنا قادرين على استحضار مثبطة PSCs عن طريق التحفيز المباشر من المحاور MNTB في ما يقرب من 60٪ من الخلايا العصبية MOC57, مما يشير إلى أن معدل نجاحنا هنا هو مجرد انخفاض متواضع نظرا للمدى الطويل من المدخلات وضرورة لتنشيط الدائرة البوليسينابتيك. عند إعداد شريحة، فمن المستحسن أن يخطئ على الجانب سمكا كما انخفاض في الرؤية بسبب شريحة سمكا مواتية على قسم غير قابل للاستخدام الذي هو غير مكتمل أو يفتقر إلى اتصال الدائرة. يمكن استخدام أي تكوين شريحة أو أبعاد ، طالما أن شريحة يناسب تحت الهدف المجهر تسجيل ، ويمكن الوصول إليها عن طريق التصحيح وحفز الأقطاب الكهربائية (أو تحقيقات أخرى أو معدات) ، ورقيقة بما يكفي لقط التصحيح القائم على بصريا في الخلية ما بعد المصلحة. تشريح سريع، لطيف وحضانة السليم وظروف الانتعاش هي أيضا مهمة للحفاظ على صلاحية الدائرة للتجارب التصحيح المشبك. خاص لدينا إعداد جذع الدماغ السمعية، يجب إزالة الدماغ بعناية فائقة من الجمجمة من أجل الحفاظ على الجذور العصبية السمعية سليمة والوظيفية. سوف تمتد أو تمزيق العصب أثر القدرة على تحفيز الألياف والحصول على النشاط في الخلايا العصبية السمعية. بسبب حجم أكبر من الأنسجة في شريحة، تعديل من الحلول تشريح التقليدية، ودرجات الحرارة، وتفاصيل الحضانة، ونظم التسريب قد يحسن صحة شريحة. هنا نوظف تعديلات طفيفة على إعداد شريحة العادية لدينا. وتشمل هذه أوقات حضانة الانتعاش أقصر (30 دقيقة مقابل 60 دقيقة) ومعدلات تدفق أسرع في نظام ضخ غرفة شريحة.

بمجرد تحديد أبعاد الشريحة وتفاصيل الحضانة ، يجب إثبات وظيفة و توصيل مكونات مختلفة من الدوائر داخل الشريحة. في إعدادنا، ونحن نضمن أن كل من مدخلات مثير ومثبطة، يفترض أن تنشأ في نواة القوقعة مع تي-ممتاز وGBC (عن طريق MNTB)، موجودة كما هو متوقع. قد تؤدي طرق التحفيز البديلة مثل أقطاب الشفط للأعصاب السمعية، أو طرق التحفيز البصري مثل optogenetics أو النواقل العصبية البؤرية إلى زيادة تنشيط الدائرة أو السماح بتنشيط نوع الخلية عند إقرانها مع الاستهداف الجيني للفئات الفرعية للخلايا.

في حين أن هذا الأسلوب تشريح نأمل أن تكون مفيدة لكثير من النظم والدوائر، وبعض القيود من أقسام الشريحة رقيقة القياسية هي أيضا ذات الصلة لهذا الإعداد. عموما، قد يكون من الصعب الحفاظ على الدوائر ذات أنماط إسقاط أقل حدة، كما من المرجح أن تكون قطع محاور عصبية. قد لا يكون تنشيط الدائرة في الأعصاب القحفية ، كما هو الحال هنا لمحاكاة المدخلات السمعية ، ممكنًا في العديد من الدوائر. كما هو الحال مع غيرها من مستحضرات شريحة، يجب النظر في آثار شبكة أي علم الصيدلة. على سبيل المثال, حمام تطبيق حاصرات مستقبلات الغلوتامات لعزل المثبطة (GABA- أو glycinergic) أو غيرها من وسائط انتقال لا يمكن استخدامها مع تنشيط الدائرة البوليسينابتيك عندما الغلوتامات ضروري لتنشيط الخلايا العصبية المنبع من الخلايا العصبية الهدف مصححة. هذا صحيح في حالتنا كما على حد سواء AN / CN وGBC / MNTB نقاط الاشتباك العصبي هي الجلوتاماتية، وبالتالي، سيتم القضاء على جميع انتقال في الخلايا العصبية MOC مع تطبيق حمام من حاصرات مستقبلات الغلوتامات. بالإضافة إلى ذلك, تطبيق GABA أو حاصرات مستقبلات الجليسين للقضاء على الاستجابات متشابك MNTB-MOC سيكون لها نتيجة غير مقصودة للقضاء على اتصال المثبطة الجوهرية داخل النفثالين التي قد تشكل أنماط المدخلات afferent إلى الخلايا العصبية MOC. ويمكن استخدام التطبيق البؤري لحاصرات المستقبلات، مع طرد الضغط أو قذف الأيونات، لتقييد الوظيفة الدوائية.

وأخيرا، فإن القيد الرئيسي لهذا، وأي، في المختبر تقنية هو أنه على الرغم من أن هذا الإعداد يزيد من تنشيط الدوائر السمعية الصعودية، بقية الجهاز العصبي، بما في ذلك المستقبلات الطرفية التي ترميز المحفزات، غير موجود. وهذا يشمل القوقعة نفسها، مدخلات الإثارة من الأذن الأخرى66، اتصالات CN commissural67،68،69،70، وتنازل القشرية71،72،73،74 و75،76 إسقاطات ومدخلات 19 ،78،79،80 معروفة بالتأثير على نشاط CN و SOCclei nuclei. وفي حين أنه من الممكن الحفاظ على جزء من إسقاطات IC التنازلية، سيكون من المستحيل إدراج كل من الإسقاطات القشرية وإسقاطات النفثالينات المعدنية بسبب هندسة الشريحة. ومن ثم، فإننا نركز على الدوائر السمعية التصاعدي من قوقعة الأذن مع التجارب الحالية. الحد الأدنى من سمك شريحة على الجانب رقيقة أيضا يقلل من القدرة على أداء تحليل الدوائر متعدد الثقافات ثنائي الثقافات، والذي هو ميزة من المستحضرات شريحة سميكة متناظرة10،11. بالإضافة إلى ذلك، نحن غير قادرين على تحفيز العصب السمعي مع الصوت لاستحضار الأنماط الطبيعية لنشاط الدائرة. ردود العصبية السمعية هي tonotopically متنوعة، التوتر، والبلاستيك81،82،83،84، مما يجعل من الصعب محاكاة تماما مع أسلوب التحفيز الكهربائي لدينا. هذا هو العيب الرئيسي في التجارب في المختبر في النظام السمعي. تقييد Tonotopic من التحفيز لدينا غير ممكن منذ تحفيز جذر AN بأكمله سوف تثير ارتفاع في ألياف AN عبر التدرج tonotopic. محاكاة بدقة تنوع الردود على الألياف AN (أي، منخفضة مقابل ألياف معدل عفوية عالية) إلى نمط التحفيز الكهربائي هو أيضا غير ممكن. كما أنه من الصعب مطابقة دقة ترميز الكثافة الديناميكية لألياف AN متعددة في الـ CN. ومع ذلك ، نحن قادرون على استخدام لدينا الكهربائية فيزيولوجيا البرمجيات لانتاج مجموعة متنوعة من أنماط التحفيز تهدف إلى محاكاة المناسب خرج العصب السمعي خلال المحفزات الصوتية المختلفة (على سبيل المثال قصيرة ، الأصوات العالية ، هادئة ، والأصوات لفترات طويلة أو الأصوات في الضوضاء الخلفية) عن طريق تغيير تردد التحفيز سواء بين بروتوكولات التحفيز الكهربائية وأيضا داخل بروتوكول فردي لتقريب المدخلات A مجتمعة (على غرار المرجع85). رصد MOC الانتاج خلال هذه التجارب سوف اختبار فرضياتنا بشأن ما أنماط التحفيز قد تفضل تثبيط أو الإثارة في الخلايا العصبية MOC.

على الرغم من القيود المذكورة أعلاه، طريقة إعداد شريحة إسفين له فوائد مقارنة في وظائف الأعضاء الفسيولوجية في vivo ونموذجية في شريحة في المختبر ويمكن استخدامها لنهج في تنشيط الدائرة الجسمية عن كثب ممكن في شريحة للخلايا التي يصعب الوصول إليها. في تسجيلات الخلية الكاملة في الجسم الحي في جذع الدماغ السمعي كانت نادرة بسبب صعوبات الوصول إلى هذه المنطقة جراحيا86. بدلا من ذلك تم إعداد شريحة لتشمل مدخلات تصاعدية إلى الخلايا العصبية MOC بدءا من العصب السمعي، والتي يتم تحفيزها مباشرة لتنشيط الدائرة الصعودية الأمونية بأكملها. نحن نبرهن على تفعيل كل من مدخلات متشابك مثير ومثبطة، والاستجابات لهذه المدخلات توفر معلومات قيمة حول توقيت المدخلات متشابك لأنها تصل إلى الخلايا العصبية MOC. وهذا يوفر منصة للتجريب عالية الإنتاجية حيث يمكننا توظيف ذخيرة كبيرة من في المختبر في علم الفيزيولوجيا الكهربائية مثل الكالسيوم أو الجهد التصوير, غير مزال, وكلاهما داخل الخلايا (عن طريق ماصة التصحيح) وخارج الخلية (عن طريق تطبيق حمام أو iontophoresis) الصيدلة. وينبغي أن توفر أيضا إعداد زيادة في الإنتاجية على الاستعدادات شريحة سميكة بسبب رؤية أفضل للخلايا العصبية المستهدفة باستخدام البصريات DIC, التي طمس مع زيادة سماكة الأنسجة, خاصة في الدماغ البطني. عموما، توفر هذه التقنية تحسينات في استهداف والإنتاجية في أكثر من أساليب الجسم الحي، وفرص أفضل لتحليل الدوائر من أساليب الفيزيولوجيا شريحة التقليدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الثقافات من المعاهد القومية للصحة، NIDCD، Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

علم الأعصاب، العدد 162، الخلايا العصبية olivocochlear الوسطى، في شريحة في المختبر الكهربائي، التكامل متشابك، العصب السمعي، جذع الدماغ السمعي، نواة قوقعة، المثبطة العصبية
في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter