Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

体外楔形切片准备模拟在Vivvo神经元电路连接

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

将不同的突触输入与神经元的整合最好用一种制备来测量，这种制备保留了所有突触前核，以便自然计时和电路可塑性，但大脑切片通常切断许多连接。我们开发了一个经过修改的大脑切片来模拟体内回路活动，同时保持体外实验能力。

Abstract

体外切片电生理学技术以精确的电和时间分辨率测量单细胞活动。脑片必须相对薄，以正确可视化和访问神经元进行贴片夹紧或成像，并且对大脑电路的体外检查仅限于急性切片中物理存在的。为了保持体外切片实验的好处，同时保留大部分前突触核，我们开发了一种新型切片制备。这种"楔形切片"设计用于贴片式电生理学记录，以描述脑干中中层胆汁（MOC）神经元的多种单声道、声驱动输入。这些神经元从由反边耳和相应的耳蜗核（CN）的刺激激活的神经元中接收其主要兴奋和抑制性输入。设计了一个不对称的大脑切片，在一个半球的横向边缘的玫瑰花外域中最厚，然后向相反半球的横向边缘变薄。在厚的一面，该片包含听觉神经根向大脑传递有关听觉刺激的信息，内在的CN电路，以及融合在反向MOC神经元上的脱联兴奋和三联突抑制的通路。记录从片片薄侧的MOC神经元进行，在该实验中，使用DIC光学元件进行典型贴片夹实验。当听觉神经进入听觉脑干时，直接刺激它，允许内在CN电路活性和突触可塑性发生在MOC神经元上游的突触。使用这种技术，可以尽可能密切地模拟切片内的体内电路激活。这种楔形切片制备适用于其他脑电路，其中电路分析将受益于保持上游连接和远程输入，结合体外切片生理学的技术优势。

Introduction

神经回路活动的观察是理想地用原生感官输入和反馈进行的，以及大脑区域之间在体内的完整连接。然而，进行神经回路功能单细胞分辨率的实验仍然受到完整大脑中技术挑战的受限。虽然在体内细胞外电生理学或多光子成像方法可用于调查完整神经系统的活动，但解释不同输入如何集成或测量亚星体突触输入仍然很困难。体内全细胞记录克服了这些限制，但很难执行，即使在大脑区域，很容易访问。单细胞分辨率实验的技术挑战在位于大脑深处的某些神经元群体或空间扩散群体中进一步放大，这些群体需要基因工具来定位体内细胞（例如，与视光记录配对的通道霍多辛的遗传表达）或记录站点标记后（例如具有神经传递特异性标记）后组织化学识别。位于脑干的腹外表面附近，中层胆道（MOC）神经元受到上述限制1，使得它们极难进入体内实验。

脑片（±100-500μm厚度）长期以来一直用于研究脑电路，包括听觉脑干电路，因为同一切片2、3、4、5、6、7、8、9中所含的神经元的物理分离。其他实验室都使用更厚的切片（>1 mm）进行实验，以了解双边输入如何整合在高级橄榄复合物（SOC）区域，包括中层高级橄榄10，11。这些切片的准备，使听觉神经（AN）的轴突保持完好无损的切片内，并受电刺激，启动突触神经递质释放在CN，模仿一阶听觉神经元的活动，因为他们会响应声音。这些厚切片的一个主要缺点是神经元的可见性，用于贴片电生理记录（"修补"）。修补变得越来越困难，因为在这个区域的许多轴突成为骨髓与年龄12，13，14，15，使组织光学密集和模糊神经元，即使在一个典型的，薄的大脑切片。我们的目标是创造体外准备，更类似于体内记录电路连接，但与高通量和高分辨率记录能力视觉引导补丁夹电生理学在脑片。

我们的实验室研究听觉发泡系统神经元的生理学，包括MOC神经元。这些胆碱神经元通过调节外发细胞（OHCs）16、17、18、19、20的活性，为耳蜗提供发向反馈。先前的研究显示，这种调制在耳蜗21、22、23、24、25、26和隔音创伤27、28、29、30、31、32、33等的增益控制中起着一定的作用。在小鼠中，MOC神经元弥漫地位于听觉脑干1中梯形体（VNTB）的腹核。我们组利用与 tdTomato 记者鼠标线交叉的 ChAT-IRES-Cre 鼠标线，在显光照明下瞄准脑干切片中的 MOC 神经元。我们表明，MOC神经元从梯形体（MNTB）的吸管内核接收一个抑制性输入，而梯形体（MNTB）则由反边合体核（CN）34、35、36、37、38中的球状浓密细胞（GBC）的轴突激发。此外，MOC神经元可能从反面CN39、40、41中的T-斯特拉特细胞接收其兴奋性输入。综合起来，这些研究表明，MOC神经元接收来自同一（反向）耳朵的兴奋和抑制性输入。然而，前突触神经元，及其轴突聚集在MOC神经元上，在典型的日冕切片制备中，彼此不够接近，无法完全完好无损。为了研究突触输入与MOC神经元的整合如何影响其作用潜在的射击模式，我们开发了一种制备，我们可以以最生理上现实的方式刺激从一只耳朵对MOC神经元的不同影响，但具有体外脑切片实验的技术益处。

楔形切片是一种经过修改的厚切片制备，用于调查MOC神经元中的电路集成（图1A中所示）。在切片的厚侧，楔子包含听觉神经的被切断轴突（以下简称"听觉神经根"），因为它们从边缘进入脑干，并在CN中突触。听觉神经根可以电刺激，唤起神经递质释放和突触激活完全完整的CN 42，43，44，45，46细胞。这种刺激格式对电路分析具有若干优点。首先，我们刺激的不是直接刺激向MOC神经元提供输入的T-斯特拉特和GBC轴突，而是刺激性，以允许激活CN中丰富的内在电路。这些电路调节CN神经元的输出到他们在整个大脑的目标，包括MOC神经元46，47，48，49，50，51。其次，从安到MOC神经元的CN上游的多合成激活允许更自然的激活时间，使可塑性在这些突触中发生，因为它们在听觉刺激期间在体内发生。第三，我们可以改变我们的刺激模式来模仿一个活动。最后，对MOC神经元的兴奋和抑制单声投影在楔片中完好无损，它们在MOC神经元中可以测量其整合，并精确测量贴片-夹触电生理学。总的来说，与典型的脑切片制备相比，这种激活方案为MOC神经元提供了一个更完整的电路。这种脑干楔形切片也可用于研究其他听觉区域，接受从ipilatermNTB的抑制性输入，包括横向优越的橄榄，优越的橄榄核和中高级橄榄10，11，52，53，54，55，56。除了我们的具体准备，这种切片方法可以使用或修改来评估其他系统，其好处是保持远程输入的连接，并改善神经元的可视化，用于各种单细胞分辨率电生理学或成像技术。

该协议要求使用可倾斜约 15° 的振动台或平台。在这里，我们使用一个市售的两件式磁舞台，"舞台"是一个金属盘，底部弯曲，放置在凹式磁性"舞台基座"中。然后可以移动舞台以调整切片角度。舞台基座上的同心圆用于可重复估计角度。舞台和舞台底座放置在切片室中，其中磁级底座也可以旋转。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有实验程序都得到国家神经疾病和中风研究所/国家耳聋和其他沟通障碍动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验准备

注：有关切片制备的详细信息，包括切片溶液、切片温度、切片孵化温度和装置（等）是本实验中进行脑干制备的特明。切片孵育细节可以根据实验室经验进行更改。

  1. 准备用于修补的内部解决方案。
    1. 准备含有（以 mM）76 Cs-甲烷硫化酯的电压夹溶液， 56 CsCl， 1 MgCl2， 1 CaCl2， 10 HEPES ， 10 EGTA ， 0.3 Na-GTP ， 2 Mg-ATP ， 5 Na2-磷酸，5 QX-314， 和 0.01 亚历克萨氟-488 氢化物.使用 CSOH 将 pH 调整为 7.2。
    2. 准备含有（在mM）125 K-葡萄糖酸，5KCl，1MgCl 2，0.1 CaCl2，10HEPES，1 EGTA，0.3 Na-GTP，2 Mg-ATP，1 Na2-磷酸酸酯和0.01亚历克萨氟-488氢化物的当前夹紧溶液。使用 KOH 将 pH 调整为 7.2。
  2. 在100 mL热（接近沸腾）水中加入4克的阿加，准备100 mL的4%的阿加。放在加热搅拌板上以保持温度并搅拌，直到完全溶解。倒入 100 毫米塑料培养皿，深度约 1 厘米，让冷却。冷藏至需要。
  3. 准备 1 L 人工脑脊液 （ACSF） 包含 mM： 124 NaCl， 1.2 CaCl2，1.3 MgSO4，5 KCl， 26 NaHCO3，1.25 KH2PO4，和 10 葡萄糖.用碳化物 （5% CO2 / 95% O2）泡至少 10 分钟，然后根据需要，用 1 M NaOH 将最终 pH 调整为 7.4。在整个实验中，通过不断使用碳化物冒泡，保持溶液的氧合和pH值。
  4. 在ACSF中加入1 mM基努林酸，准备200 mL切片溶液。声波溶液在声波水浴10分钟，直到基努雷酸溶解。不断冒泡与碳原和放在冰上。
    注意：处理基努雷酸时，请使用适当的个人防护设备。
  5. 按照制造商的说明在振动器中安装适当的刀片。用冰围起冰，将振动室用冷。

2. 脑切除与完整的听觉神经根刺激

注：这些实验的小鼠是通过穿越C57BL/6J背景的C57BL/6J背景的ChAT-IRES-Cre转基因小鼠与tDTomato记者小鼠（Ai14）获得的。用于组织学和电生理学的小鼠是听力后发病（P14-P23），在小鼠中围绕P12。在梯形体（VNTB）的腹核中表达tdTomato的神经元以前被描述为此小鼠线57中的MOC神经元。

  1. 安乐死（例如，CO2 窒息）和斩首动物使用批准的机构程序。
  2. 使用剃刀刀片，将头骨中线的皮肤从鼻子切到颈部后面。剥回皮肤露出头骨。
  3. 使用小剪刀，在头骨的切口通过中线开始从头骨的基础（脊髓附近的骨端）开始，并继续向鼻子。
  4. 在羔羊缝合，从中线切到头骨，向两侧的耳朵倾斜。剥回头骨露出大脑。
  5. 从公鸡端开始，用小实验室铲或钝钳轻轻地将大脑从头骨上抬起来。切断视神经，继续轻轻地向后工作大脑，露出腹体表面。
  6. 在脑干的腹体表面附近用细钳捏三叉神经，切开三叉神经。
    注意：请小心操作，因为背心神经就在这一点下方，需要完好无损才能最终受到刺激。
  7. 将制剂放在装满冷切片溶液的玻璃培养皿中。将盘子放在解剖显微镜下。用碳原轻轻泡。
  8. 修剪靠近脑干的面部神经，并暴露叶神经。
  9. 使用精细钳子，将尖端推入前脑炎，其中前脑神经尽可能离开头骨，捏紧神经将其切断，使神经根附着在脑干上。在另一边重复。
  10. 一旦两个神经根都自由了，从脑干靠近梯形身体的脑干的腹表面去除脑和血管。
  11. 通过捏住剩余的颅神经和结缔组织来将大脑完全从头骨中释放出来，如果可能的话，小心保存剩余的脊髓。

3. 在舞台上阻止和安装大脑（磁盘）

  1. 准备大脑的表面，通过阻塞大脑在光学奇亚姆的水平固定到阶段。
    1. 随着腹体表面向上，使用钝器稳定大脑，轻轻地固定脊髓，使大脑在以下步骤中不会倾斜。
    2. 在光学气则，使用开放钳子创建平面，通过插入大脑到盘子的底部来阻挡大脑。从垂直角度以大约 20° 的角度插入钳子，使尖端从脑筋膜的后面到光学奇亚姆。
    3. 使用剃刀刀片切割钳子。
  2. 将大脑粘在舞台表面。
    1. 准备一小块 （+1 厘米3） 4% 的阿加量，用于支撑大脑。
    2. 在舞台上放置一小滴胶水，并铺入一个矩形，这样大脑和阿加块都可以粘下来。
    3. 使用钳子，小心地抬起大脑，用纸巾的边缘轻轻涂抹多余的液体。将堵塞的表面放在胶水上，在切片过程中，腹体表面会朝向刀片。
    4. 轻轻将阿加块推到大脑的背表面，在切片过程中支撑它，并确保正确的大脑定位（即角度）。

4. 切片大脑创建楔形切片

注：使用在厚侧有耳蜗神经根和中层胆汁（MOC）神经元和梯形体（MNTB）的中枢核的振动器准备大脑切片。

  1. 将带连接大脑的磁碟放在舞台底座上，并将其放在切片室中，大脑的腹腔表面朝向刀片。
  2. 用冰冷切片溶液填充腔室，用碳化物填充气泡。
  3. 将刀片下到溶液中，将切片切割到感兴趣的区域，以确保切片是对称的。如果切片看起来不对称，则稍微倾斜舞台以获得对称性。
    注：刀片速度在0.05-0.10毫米/s之间是有效的切割健康切片，可能因动物年龄和大脑区域而异。
  4. 一旦切片对称，将舞台 [15]（对应于舞台基座上的大约 3 个同心环）移向一侧。
    注：将舞台从要保留在切片中的听觉神经根移开。
  5. 继续小心切开，直到听觉神经根靠近一侧的表面，面部神经可以看到另一侧的表面。
  6. 将舞台移回 15° 到原始位置。
  7. 将刀片从组织上移开，旋转舞台底座 90°，使薄侧的侧边朝向刀片。降低刀片几百微米，然后慢慢将刀片靠近组织的边缘。重复此错误，直到刀片接触横向边缘。将刀片降到切片薄边所需的厚度，此处再增加两百微米。
    注：在进行贴片夹紧的一侧，在梯形体（VNTB）的腹核水平处，理想的是±300 mm厚。
  8. 将刀片从组织移回，将舞台底座旋转回来，使腹体表面朝向它。
  9. 进行指定楔形切片的地体表面的切口。将切片转移到一块接口纸 （1 厘米2） 的考达尔表面向下。将切片移动到孵化室或其他合适的孵化装置进行回收（35°C 时为 30 分钟）。
    注：面部神经应在旋转面表面切片的两个半球上可见（参见 图 1B）。

5. 电生理学设置和记录

  1. 将楔片放在记录室中，用竖琴或稳定系统固定切片。在温暖（35°C）ACSF与碳原泡下，以7-10 mL/min的速度连续吸收组织。
  2. 使用带 561 nm 发射滤波器的荧光识别 VNTB 中带基因标记的 MOC 神经元，用于贴片夹记录。如果没有潜在的可修补单元格，翻转切片。
  3. 使用 DIC 光学器件，聚焦切片厚侧的听觉神经根，并使用微操纵器将双极钨刺激电极向下移动到听觉神经根，并轻轻地移动到组织表面。
    注：吸附电极已用于其他实验室的听觉神经刺激实验。如果适用于其他特定制剂，可以使用玻璃电极或光学刺激方法。
  4. 将视场移回 VNTB 以选择 MOC 神经元作为贴片夹电生理学的目标。
  5. 为建议的实验为记录移液器填充适当的内部解决方案。
  6. 在全细胞配置中修补和记录从 MOC 神经元。如果需要，补偿膜电容和系列电阻。
  7. 调整听觉神经根的电刺激振幅，以获得MOC神经元中一致的后突触事件。
    注：可能需要移动刺激电极。
  8. 运行适当的刺激方案，观察MOC（电压钳）或动作电位模式（电流钳）中唤起的突触电流。
    注：楔形切片制备可用于任何典型的贴片夹工具，如松散贴片记录、药理学、光遗传学、钙成像、神经递质解开等。

6. 脑干核的组织学确认

注：这是用紫紫罗兰染色，在固定，重新切片楔片完成。此方法允许可视化切片中包含的核。

  1. 准备楔形切片后，将切片淹没在固定（PBS 中的 4% PFA）中过夜。在 PBS 中冲洗切片 3 次 10 分钟（摇床的室温），然后在 4 °C 下将 30% 蔗糖在 PBS 中过夜以进行低温保护。
  2. 将切片重新切成冷冻微原子（40-70 mm），并在PBS的24井板中收集串行部分。
  3. 在明胶涂层的幻灯片上安装部分，让完全干燥。将幻灯片放在滑轨中。
  4. 准备紫红色溶液
    1. 在 500 mL dH2O 中混合 5 克氯锡紫醋酸盐，准备 1% 氯锡紫醋酸盐
    2. 通过首先制备 90 mL 溶液 A（540 mL 冰川醋酸 = 89.46 mL dH2O）和 10 mL 溶液 B（10 mL dH2O 中的 136 毫克醋酸钠）来制备醋酸盐缓冲液。结合溶液 A 和溶液 B 产生醋酸盐缓冲液。
    3. 将 1% 氯乙基紫醋酸盐与醋酸盐缓冲液 1：1 混合在醋酸酯缓冲液中，用于 0.5% 氯乙基紫罗兰。使用前请过滤。
    4. 通过用适当体积的 dH2O 稀释 100% 乙醇，准备 95% 和 70% 乙醇
  5. 执行紫红色染色协议。将滑滑车移过溶液托盘，在纸盒之间的纸巾上印迹多余的溶液：二甲苯 = 5 分钟;95%乙醇= 3分钟;70% 乙醇 = 3 分钟;dH2O = 3 分钟;0.5% 氯乙烯紫罗兰溶液 – 8-14 分钟频繁监测，直到核染色变成深紫色;dH2O = 3 分钟;70% 乙醇 = 3 分钟;95%乙醇= 1-2分钟;100% 乙醇 = 浸滑梯两次;二甲苯 = 5 分钟;二甲苯：25分钟，直到安装执行。
    注意：仅在烟罩下使用 Xylenes。
  6. 一次从二甲苯上拆下一个幻灯片，并立即使用安装介质将盖滑在幻灯片上。允许安装介质干燥（过夜）。
  7. 图像部分。

7. 生物细胞素标签，用于活的、未固定的组织中轴翁的逆向追踪

  1. 准备楔形切片，如上（步骤 2-4）。
  2. 将切片转移到接口纸张 （+1 厘米2） 。在解剖显微镜下，将CN定位在切片厚的一侧。
  3. 通过扭动纸巾的一角，小心地从切片周围区域去除多余的ACSF，将ACSF从组织中拉离。这可以防止生物细胞素扩散到切片的周围区域，这可能导致摄取到CN以外的细胞。
  4. 使用精细钳子，选择一个小的生物细胞素晶体，并放在CN的表面。轻轻地将晶体压入组织，促进与神经元的接触，随后吸收到索玛塔。重复此步骤以覆盖所需的感兴趣区域，本例中为包含 T-stellate 和 GBC 神经元的 CN 区域。
  5. 将切片放在孵化室中。允许切片在35°C下孵育2-4小时，以便吸收和运输生物细胞素。孵育后，在ACSF中冲洗切片以去除任何生物细胞素颗粒。
  6. 将切片放置在固定（PBS 中的 4% PFA）中过夜。用 PBS 冲洗 3 次 10 分钟。
  7. 在4°C或直到切片下沉时，在PBS中隔夜将30%蔗糖中的冷冻切片冷冻。
  8. 在70-100 mm的冷冻显微原子上重新切除组织，产生横向部分。
  9. 使用标准免疫组织化学方法处理具有荧光结合的链球菌素。
    注：如果有助于标记前突触细胞体、轴突、受体或其他对电路可视化重要的突触分子（即初级抗体步骤不应对生物细胞素二次可视化产生不利影响），则可以在各部分执行额外的免疫组织化学。
  10. 成像组织。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

楔形切片的组织学研究
为了研究听觉脑干神经元功能，楔形切片制剂被设计为包含听觉神经根和CN反面的MOC神经元的目标记录（例如切片如图1B所示）。初步组织学检查的准备是重要的，以确认切片包含电路激活所必需的核，并且与弓投影完好无损。CN 中的两种细胞类型为 MOC 神经元提供声音信息。T-斯特拉特细胞被假设为MOC神经元39，40，41，58提供兴奋输入。球状浓密细胞（GBC）激发MNTB神经元在反边半球（通过保持突触的专门卡莱克斯）34，36，37，38，59，60，这反过来，提供抑制输入MOC神经元57（图图1A）。为了确认T-斯特拉特细胞和GBC的存在，我们重新切开（至50μm）楔形切片，该楔形切片在4%PFA中通过淹没固定，并进行了氯乙基紫罗兰染色，以标记索马塔。在楔片的厚侧（图2，左半球），CN几乎在其完整的玫瑰花丛范围内存在。此外，CN的后腹和腹部细分完好无损（图2;S19中的箭头和箭头）。T-斯特拉特神经元和GBC聚集在听觉神经附近的腹耳蜗核（图2;S17中的箭头）进入CN61、62、63、64、65。楔形切片还包含 MNTB 的神经元到 MOC 神经元的神经元，从中执行记录（原始楔形切片的薄半球，图2 中的右侧）。这证实了MOC神经元的抑制性输入中至少有一部分完好无损（图2，切片1-15，在S11中用虚线椭圆突出显示）。

在单独的实验中，我们确认CN神经元的轴突和预突触端子在楔形切片中完好无损，使用生物细胞素的外层标记。首先，准备活楔片并放置在界面纸上。在制备楔片后，生物细胞素晶体立即被放置在CN中，在潜伏期允许沿轴子进行吸收和逆向运输。然后固定和重新剖下组织（70 mm 部分）。对标有荧光标记的斯特雷普他丁的部分进行染色，以可视化标有生物细胞素的轴子。这些部分的共体图像显示在CN中明亮的标记，其中晶体被放置在细胞体中并被带到细胞体中（图3A，左半球，虚线区域）。沿腹体声学的轴线（图3A，白色箭头）被清楚地标记，可以跟随到它们的终止点。围绕反面MOC神经元的生物细胞素阳性pucta表明，我们的制备保留了源自CN的突触接触（图3B）。同样，在反面 MNTB 中标记的"持有"表示从 GBCs 投射到 MNTB 神经元的轴突保留在楔片中（图 3C）。这些组织学检查证实我们的楔形切片包含细胞体和对MOC神经元的一致输入电路的突触投影，因此，这使我们能够测量通过刺激听觉神经和随后通过上升电路传播的活动引起的后突触反应。

楔形切片中的突触生理学
兴奋和抑制性突触输入的整合批判性地塑造了神经元活动。我们最近描述了MNTB57神经元对MOC神经元的抑制性输入，但这些输入与兴奋性输入的整合对MOC神经元活性的影响是未知的。在 ChAT-IRES-Cre x tdTomato 鼠标的楔片中，从 MOC 神经元执行电压夹记录。电流通过刺激隔离单元驱动的双极钨刺激电极施加，以唤起前突触轴突释放的神经递质。首先，中线的腹体声学斯特里亚（VAS）被电刺激，通过GBC轴突刺激直接激活T-斯特拉特轴突和MNTB神经元（图4A），以测量在模仿典型的薄片实验（图4B）的录音配置中，对突触后反应的延迟（图4B），例如痕迹，灰色，保持电位-60 mV。在单独的实验中，听觉神经根被刺激来激活单声道上升电路，在MOC神经元上测量后突触反应，如上所述。任一位置的电刺激都会引发快速电伪影，然后是多点电流响应（如图 4C中的A刺激响应，黑色痕迹，保持电位-60 mV）。我们比较了直接刺激VAS引起的第一个后突触电流（PSC）的启动延迟测量与听觉神经刺激引起的电流，发现对安刺激事件的延迟明显更长。这归因于在 AN/CN 突触（AN 刺激：5.27 ± 0.43 ms，中位数 ± 绝对偏差 （MAD）， 范围 4.26-5.93 ms， n = 8;VAS 刺激：1.98 ± 0.28 ms，± MAD，范围 0.75-3.46 ms，n = 17;威尔科森签名排名测试， p = 0.014， 图 4D.这些结果证实，对听觉神经根的刺激导致CN神经元的突触激活和随后的电路活动，更密切地代表体内 - 像时间，而不是直接刺激T-斯特拉特或GBC/MNTB轴突。

我们的基于氦，高 [Cl-] 内部溶液用于电压夹，兴奋（高刺激性）和抑制（GABA和甘油）PSCs都是向内在休息膜电位（-60 mV），因此无法区分。在 AN 刺激配置中唤起电路活动时，我们通过将保持电位转移到 0 mV 来电气隔离假定的抑制输入，即 AMPA 中导激电流的近似反转电位。在我们的示例中神经元中，在 0 mV（图4Ci，红色轨迹）观察到外流响应，指示氯化物传导。这些可能是GABA或甘油突触反应。这些数据证明了楔形切片通过刺激听觉神经根，通过激活随后的发毒电路，激活MOC神经元的兴奋和抑制输入的效用。此外，AN刺激唤起了突触后反应的不同模式，这表明即使在与安轴子相同的刺激条件下，整个电路的活性也是动态和复杂的。这种实验范式允许详细分析复杂的听觉刺激如何通过脑干传播，并在MOC神经元整合，确定MOC发泡系统的输出和最终对耳蜗的影响。

Figure 1
图1：楔形切片示意图和示例图像。（A） 中位反馈电路的示意图。蓝色箭头表示从MOC神经元到外发细胞（OHC）底部的下降反馈通路到MOC神经元的发向提升路径。（B） 楔形切片的亮场图像，在厚的一侧带有听觉神经根 （ANR） 和耳蜗核（虚线轮廓）的标签。星号表示梯形体腹核的大致位置，其中 MOC 神经元被定位在楔形切片的薄侧进行修补。虚线表示在旋转面切片的两个半球中可以看到的面部神经。IHC - 内发细胞，GBC - 球状浓密细胞，SPN - 优越的类食体核，MNTB - 梯形体的中层核，VNTB - 梯形体的腹核，LSO - 侧上高级橄榄。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：从楔形切片的克西勒紫罗兰色部分，以50μm重新切片。所有其他部分都被成像。节是编号的rostral - > caudal。楔形切片往往包含整个耳蜗核 （CN），包括后心 CN（S19 中的箭头）和腹体 CN（S19 中的箭头）、听觉神经根（S17 中的开放箭头）和大部分 MNTB（S3-S15 中腹外表面附近的暗区域，在 S11 中突出显示有虚线椭圆）。比例杆上的 D 和 V 表示切片方向的后腹和腹。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：从逆边合子核向MOC神经元上升输入的轴突在楔形切片中保持不变。（A） 从P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato（红色荧光）小鼠的楔形切片中，最角段，被重新分段（70μm），并加工用于生物细胞素可视化。共和图像是一个平铺的最大强度投影 z 堆栈。腹声道中的轴突由白色箭头突出显示。虚线轮廓表示科利耳核的一小部分留在这个最中心切片中。比例线 500 μm. （B） VNTB 中 ChAT-IRES-Cre x tdTomato 阳性神经元的共生图像，周围神经柱中具有生物细胞素阳性 puncta。比例杆 50 μm. （ C ）生物细胞素标记轴子显示跨越中线，并在反向 MNTB 中终止为 Helds Held.垂直虚线表示切片的中线。比例杆 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：电压夹中输入的电刺激产生MOC神经元中的多点后突触电流。（A） 楔片的示意图，用于为 MOC 的输入进行腹体声学斯特里亚 （VAS） 刺激 （VAS） 刺激 （和听觉神经 （AN） 刺激 （黑色刺激电极） 的录制设置。（B） 单个P17神经元的后突电（PSCs）示例，在-60 mV的中线附近通过单个电刺激引起。（C） P15神经元中，在-60 mV的 AN 刺激期间唤起的PSCs。（Ci） 示例 PSC 与 C 在同一单元中唤起的 0 mV 保持电位（AMPA 中位电流在我们的记录设置中的近似反转电位为红色）。（D） 用于将延迟量化为 VAS 和 AN 刺激的 PSC 的人口数据。框：四分位数，线内嵌：中位数，方形内嵌：均值，胡须：中位数绝对偏差。* p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

这里描述的楔形切片切片过程对于保持完整的前突触神经元电路是强大的，但脑切片实验的可访问性，用于分析神经元功能。必须注意几个初始步骤，以最大限度地提高电路分析准备的效用。楔形的尺寸应使用组织学检查进行确认，这是确认前突触核及其囊突投影都包含在准备好的楔形切片中不可或缺的。如果投影被切断或几个轴子到达目标核，则切片几何可能需要修改。更一般来说，楔形切片振动器上的精加工至关重要。最佳楔形切片制备需要一致使用振动组配置，包括使用舞台基座上的同心圆标记，以及根据已知大脑地标调整设置。在优化切片几何形状后，我们记录了通过电刺激18个楔形切片中的8个来激发听觉神经根在MOC神经元中一致的PSC。在之前的工作中，我们能够通过直接刺激MNTB轴突在大约60%的MOC神经元57中引起抑制性PSCs，这表明，鉴于多合成电路激活的输入范围长且必要性，我们在这里的成功率只是适度的降低。准备切片时，建议在较厚的一侧犯错，因为由于较厚的切片导致的能见度降低有利于无法使用的截面不完整或缺乏电路连接。只要切片适合记录显微镜目标，就可以使用切片配置或尺寸，可通过贴片和刺激电极（或其他探针或设备）访问，并且足够薄，可用于在感兴趣的后合成细胞进行光学贴片夹紧。快速、温和的解剖和适当的孵化和恢复条件对于保持贴片夹实验电路的生存能力也很重要。具体到我们的听觉脑干准备，大脑必须非常小心地从头骨上去除，以保持完整和功能性的听觉神经根。拉伸或撕裂神经将影响刺激纤维和引起听觉神经元活动的能力。由于切片中的组织体积较大，传统的切片解决方案的修改、温度、孵化细节和灌注系统可能会改善切片的健康。在这里，我们采用轻微的修改，我们的正常切片准备。其中包括较短的回收孵育时间（30分钟对60分钟）和切片室灌注系统中更快的流速。

一旦确定了切片尺寸和孵化细节，就应演示切片内不同电路元件的功能和连接性。在我们的制备过程中，我们确保兴奋和抑制性输入（假设源自具有T-斯特拉特和GBC的耳蜗核）都如预期的那样存在。替代刺激方法，如听觉神经的吸附电极，或光学刺激方法，如光遗传学或焦点神经递质解开，也可能增加电路激活或允许细胞类型特定的激活时，与细胞亚型的基因靶向配对。

虽然这种切片方法有望对许多系统和电路有用，但标准薄片部分的一些限制也与这种制备有关。一般来说，可能很难保留具有较少平面投影模式的电路，因为轴子可能会被切断。激活颅神经的电路，就像这里模拟听觉输入一样，在许多电路中可能不可行。与其他切片制剂一样，必须考虑任何药理学的网络效应。例如，当谷氨酸是斑块激活修补目标神经元上游神经元所必需的时，谷氨酸受体阻滞剂的沐浴应用来分离抑制剂（GABA-或甘油）或其他传播模式不能与多合成回路激活一起使用。这在我们的案例中是正确的，因为 AN/CN 和 GBC/MNTB 突触都是谷胱甘肽，因此，所有传输将在 MOC 神经元中消除，并浴应用谷氨酸受体阻滞剂。此外，应用GABA或甘氨酸受体阻滞剂来消除MNTB-MOC突触反应，会产生意想不到的后果，消除CN内部的内在抑制连接，从而形成MOC神经元的输入模式。受体阻滞剂的焦化应用，具有压力喷射或离子磷，可用于限制药理功能。

最后，这个和任何体外技术的主要限制是，虽然这种准备最大化激活单声道上升听觉电路，神经系统的其余部分，包括周围受体编码刺激，是不存在的。这包括耳蜗本身，来自另一耳66的兴奋输入，小音连接67，68，69，70，和下降皮质71，72，73，74和共理75，76投影和调节输入77，78，79，80已知影响CN和SCOM核的活动。虽然可能保持部分下降 IC 投影，但由于切片几何形状，不可能同时包括皮质投影和小比例 CN 投影。因此，我们专注于从耳蜗上升的听觉电路与当前的实验。薄面切片的最小厚度也降低了进行双膜多合成电路分析的能力，这是对称厚片制剂10、11的优点。此外，我们无法用声音刺激听觉神经，以唤起电路活动的自然模式。听觉神经反应是无特异的，抖动，和塑料81，82，83，84，使得它很难完美地模拟我们的电刺激方法。这是听觉系统中体外实验的一个主要缺点。由于刺激整个 AN 根会诱发在 AN 纤维中跨越托诺托皮梯度的尖峰，因此无法限制我们的刺激。准确模拟 AN 光纤响应（即低自发率纤维）对电刺激模式的多样性也是不可能的。在CN上也很难精确匹配多个安光纤的动态强度编码。然而，我们能够使用我们的电生理学软件来产生各种刺激模式，旨在通过改变电刺激协议之间的刺激频率，并在单个协议内改变对近似组合的A输入（参考85中建模）。在不同的声学刺激刺激（例如，短声、响亮的声音、安静、长时间的声音或背景噪音中的声音）中模拟适当的听觉神经输出。在这些实验中监测MOC输出将测试我们关于哪些刺激模式可能有利于MOC神经元的抑制或激发的假设。

尽管存在上述限制，但与体内和典型的体外切片生理学方法相比，楔形切片制备方法具有优势，可用于在难以接触的细胞切片中尽可能接近体内电路激活。在体内全细胞记录在听觉脑干已经罕见，由于难以访问这一区域手术86。相反，切片准备包括从听觉神经开始的MOC神经元的提升输入，听觉神经直接被刺激以激活整个单声道上升回路。我们演示了兴奋和抑制性突触输入的激活，对这些输入的反应提供了有关突触输入到达 MOC 神经元时计时的宝贵信息。这为高通量实验提供了一个平台，我们可以采用大量的体外电生理学工具，如钙或电压成像、神经递质解热以及细胞内（通过贴片移液器）和细胞外（通过沐浴应用或离子磷）药理学。由于使用 DIC 光学器件的靶神经元的可见性更好，因此制备还应提供比厚切片制剂更高的吞吐量，该光学器件会随着组织厚度的增加而模糊，尤其是在心脑干中。总体而言，与传统的切片生理学方法相比，该技术在定位和吞吐量方面提供了改进，并提供了更好的电路分析机会。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了国家卫生和宫内研究计划的支持，NIDCD，Z01 DC00091（CJCW）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

神经科学，第162期，中层胆囊神经元，体外切片电生理学，突触整合，听觉神经，听觉脑干，耳蜗核，抑制神经传递
体外楔形切片准备模拟在Vivvo神经元电路连接
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter