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Neuroscience

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

L’intégration de diverses entrées synaptiques aux neurones est mieux mesurée dans une préparation qui préserve tous les noyaux pré-synaptiques pour le timing naturel et la plasticité du circuit, mais les tranches de cerveau coupent généralement de nombreuses connexions. Nous avons développé une tranche de cerveau modifiée pour imiter l’activité du circuit in vivo tout en maintenant la capacité d’expérimentation in vitro.

Abstract

Les techniques d’électrophysiologie des tranches in vitro mesurent l’activité unicellique avec une résolution électrique et temporelle précise. Les tranches de cerveau doivent être relativement minces pour visualiser et accéder correctement aux neurones pour le patch-clamping ou l’imagerie, et l’examen in vitro des circuits cérébraux est limité à seulement ce qui est physiquement présent dans la tranche aiguë. Pour maintenir les avantages de l’expérimentation des tranches in vitro tout en préservant une plus grande partie des noyaux présynaptiques, nous avons développé une nouvelle préparation de tranches. Cette « tranche compensée » a été conçue pour les enregistrements d’électrophysiologie patch-clamp pour caractériser les diverses entrées monales et sonores aux neurones olivocochléaires médiaux (MOC) dans le tronc cérébral. Ces neurones reçoivent leurs entrées excitatrices et inhibitrices primaires afferent des neurones activés par des stimuli dans l’oreille contralatérale et le noyau cochléaire correspondant (CN). Une tranche de cerveau asymétrique a été conçue qui est la plus épaisse dans le domaine rostro-caudal au bord latéral d’un hémisphère, puis s’amince vers le bord latéral de l’hémisphère opposé. Cette tranche contient, sur le côté épais, la racine du nerf auditif transmettant des informations sur les stimuli auditifs au cerveau, les circuits intrinsèques du CN, et à la fois les voies afferentes excitatrices et trisynaptiques disynaptiques qui convergent vers les neurones moc contralatéraux. L’enregistrement est effectué à partir de neurones MOC sur le côté mince de la tranche, où ils sont visualisés à l’aide de l’optique DIC pour les expériences typiques patch-clamp. La stimulation directe du nerf auditif est effectuée à mesure qu’il pénètre dans le tronc cérébral auditif, ce qui permet à l’activité intrinsèque du circuit CN et à la plasticité synaptique de se produire aux synapses en amont des neurones MOC. Avec cette technique, on peut imiter l’activation du circuit in vivo aussi étroitement que possible dans la tranche. Cette préparation en tranches compensées s’applique à d’autres circuits cérébraux où les analyses de circuits bénéficieraient de la préservation de la connectivité en amont et des intrants à longue portée, en combinaison avec les avantages techniques de la physiologie des tranches in vitro.

Introduction

L’observation de l’activité des circuits neuronaux est idéalement effectuée avec les entrées sensorielles indigènes et la rétroaction, et la connectivité intacte entre les régions du cerveau, in vivo. Cependant, l’exécution d’expériences qui donnent une résolution à cellule unique de la fonction du circuit neuronal est encore limitée par des défis techniques dans le cerveau intact. Bien que des méthodes d’électrophysiologie extracellulaire in vivo ou d’imagerie multiphoton puissent être utilisées pour étudier l’activité dans les systèmes nerveux intacts, il reste difficile d’interpréter comment différents intrants intègrent ou mesurent les intrants synaptiques sous-marins. Les enregistrements in vivo à cellules entières surmontent ces limitations, mais sont difficiles à réaliser, même dans les régions du cerveau qui sont facilement accessibles. Les défis techniques des expériences de résolution à cellules uniques sont encore amplifiés dans certaines populations de neurones qui sont situées profondément dans le cerveau, ou dans des populations spatialement diffuses qui nécessitent soit des outils génétiques pour localiser les cellules in vivo (p. ex., expression génétique de la canalrhodopsine associée à l’enregistrement optrode) soit une identification histochimique post-hoc après l’étiquetage du site d’enregistrement (p. ex. avec des marqueurs spécifiques à la neurotransmission). Étant situés de façon diffuse près de la surface ventrale du tronc cérébral, les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) souffrent des limitationsci-dessus 1,ce qui les rend extrêmement difficiles d’accès pour l’expérimentation in vivo.

Les tranches de cerveau (~100-500 μm d’épaisseur) ont longtemps été utilisées pour étudier les circuits cérébraux, y compris les circuits auditifs de tronc cérébral, en raison de la ségrégation physique des neurones connectés qui sont contenus dans la mêmetranche 2,3,4,5,6,7,8,9. Des expériences utilisant des tranches beaucoup plus épaisses (>1 mm) ont été utilisées dans d’autres laboratoires pour comprendre comment les intrants bilatéraux s’intègrent dans les zones du complexe olivary supérieur (SOC) y compris l’olive supérieuremédiale 10,11. Ces tranches ont été préparées de telle sorte que les axones du nerf auditif (AN) sont restés intacts dans la tranche et ont été stimulés électriquement pour lancer la libération synaptique de neurotransmetteur dans le CN, imitant l’activité des neurones auditifs de premier ordre pendant qu’ils répondaient au bruit. Un inconvénient majeur de ces tranches épaisses est la visibilité des neurones pour les enregistrements électrophysiologiques patch-clamp (« patching »). Patching devient de plus en plus difficile que les nombreux axones dans ce domaine deviennent myélinated avecl’âge de 12,13,14,15, ce qui rend le tissu optiquement dense et obscurcissant neurones, même dans une typique, mince tranche de cerveau. Notre objectif est de créer des préparations in vitro qui ressemblent plus étroitement à la connectivité du circuit des enregistrements in vivo, mais avec les capacités d’enregistrement à haut débit et haute résolution de l’électrophysiologie visuellement guidée patch-clamp en tranches de cerveau.

Notre laboratoire étudie la physiologie des neurones du système auditif efferent, y compris les neurones MOC. Ces neurones cholinergiques fournissent une rétroaction efferent à la cochlée en modulant l’activité des cellules ciliées externes (OHCs)16,17,18,19,20. Des études antérieures ont montré que cette modulation joue un rôle dans le contrôle de la cochlée21,22,23,24,25,26 etla protection contre les traumatismesacoustiques 27,28,29,30,31,32,33. Chez la souris, les neurones MOC sont diffusement situés dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) dans le tronc cérébral auditif1. Notre groupe a utilisé la ligne de souris ChAT-IRES-Cre croisée avec la ligne de souris tdTomato reporter pour cibler les neurones MOC dans les tranches de tronc cérébral sous l’illumination épifluorescente. Nous avons montré que les neurones MOC reçoivent l’entrée inhibitrice afferent du noyau médial ipsilateral du corps trapézoïde (MNTB), qui est excité, à son tour, par les axones des cellules touffue globulaires (GBC) dans le noyau cochléaire contralatéral (CN)34,35,36,37,38. En outre, les neurones MOC reçoivent probablement leur apport excitateur des cellules T-stellate dans le CN contralatéral39,40,41. Pris ensemble, ces études montrent que les neurones MOC reçoivent à la fois des intrants excitatifs et inhibiteurs dérivés de la même oreille (contralatérale). Cependant, les neurones présynaptiques, et leurs axones convergeant vers les neurones MOC, ne sont pas assez proches les uns des autres pour être entièrement intacts dans une préparation typique de tranche coronale. Pour étudier comment l’intégration des intrants synaptiques aux neurones MOC affecte leurs modèles de tir potentiels d’action, en nous concentrant sur l’inhibition nouvellement décrite, nous avons développé une préparation dans laquelle nous pourrions stimuler les divers afferents aux neurones MOC d’une oreille de la manière la plus physiologiquement réaliste possible, mais avec les avantages techniques des expériences in vitro de tranches cérébrales.

La tranche compensée est une tranche épaisse modifiée conçue pour l’étude de l’intégration des circuits dans les neurones MOC (schématisé dans la figure 1A). Sur le côté épais de la tranche, le coin contient les axones sectionnés du nerf auditif (appelé « racine de nerf auditif » ci-après) lorsqu’ils pénètrent dans le tronc cérébral à partir de la périphérie et de la synapse du CN. La racine auditive de nerf peut être électriquement stimulée pour évoquer la libération de neurotransmetteur et l’activation synaptique des cellules du CN entièrement intact42,43,44,45,46. Ce format de stimulation a plusieurs avantages pour l’analyse de circuit. Tout d’abord, au lieu de stimuler directement les axones T-stellate et GBC qui fournissent une entrée afferent aux neurones MOC, nous stimulons l’AN pour permettre l’activation des circuits intrinsèques abondants dans le CN. Ces circuits modulent la production de neurones CN à leurs cibles dans tout le cerveau, y compris les neurones MOC46,47,48,49,50,51. Deuxièmement, l’activation polysynaptique des circuits afferents de l’AN à travers le CN en amont des neurones MOC permet un timing d’activation plus naturel et pour la plasticité de se produire à ces synapses comme ils le feraient in vivo pendant la stimulation auditive. Troisièmement, nous pouvons varier nos modèles de stimulation pour imiter une activité. Enfin, les projections monaurales excitatrices et inhibitrices des neurones MOC sont intactes dans la tranche compensée, et leur intégration peut être mesurée à un neurone MOC avec la précision de l’électrophysiologie patch-clamp. Dans l’ensemble, ce système d’activation fournit un circuit plus intact aux neurones MOC par rapport à une préparation typique des tranches de cerveau. Cette tranche de coin de tronc cérébral peut également être employée pour étudier d’autres secteurs auditifs qui reçoivent l’entrée inhibitrice du MNTB ipsilateral comprenant l’olive supérieure latérale, le noyau olivary supérieur et l’olive supérieure médiale10,11,52,53,54,55,56. Au-delà de notre préparation spécifique, cette méthode de tranchage peut être utilisée ou modifiée pour évaluer d’autres systèmes avec les avantages de maintenir la connectivité des entrées à longue portée et d’améliorer la visualisation des neurones pour une variété d’électrophysiologie à résolution unicellique ou de techniques d’imagerie.

Ce protocole nécessite l’utilisation d’un stade ou d’une plate-forme vibratoire qui peut être incliné d’environ 15°. Ici, nous utilisons une scène magnétique de 2 pièces disponible dans le commerce où la « scène » est un disque métallique avec un fond incurvé placé dans une concave magnétique « base de scène. » La scène peut ensuite être déplacée pour ajuster l’angle de la tranche. Des cercles concentriques sur la base de scène sont utilisés pour estimer l’angle reproductiblement. La scène et la base de la scène sont placées dans la chambre de tranchage, où la base de scène magnétique peut également être tournée.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Préparations expérimentales

REMARQUE : Les détails concernant la préparation des tranches, y compris la solution de tranchage, la température de tranchage, la température d’incubation des tranches et l’appareil (etc.), sont spécifiques à la préparation du tronc cérébral effectuée dans le but d’effectuer cette expérience. Les détails de l’incubation des tranches peuvent être modifiés par expérience de laboratoire.

  1. Préparez des solutions internes pour le serrage des correctifs.
    1. Préparer la solution de pince de tension contenant (en mM) 76 Cs-méthanesulfonate, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 QX-314, et 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Réglez le pH à 7,2 avec CsOH.
    2. Préparer la solution de pince actuelle contenant (en mM) 125 K-gluconate, 5 KCl, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine, et 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Réglez le pH à 7,2 avec KOH.
  2. Préparer 100 mL d’agar de 4 % en ajoutant 4 g d’agar à 100 mL d’eau chaude (presque bouillante). Déposer sur une plaque chauffante pour maintenir la température et remuer jusqu’à dissolution complète. Verser dans des boîtes de Pétri en plastique de 100 mm à environ 1 cm de profondeur et laisser refroidir. Réfrigérer jusqu’au besoin.
  3. Préparez 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant du mM : 124 NaCl, 1,2 CaCl2, 1,3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1,25 KH2PO4et 10 dextrose. Bulle avec carbogen (5% CO2 / 95% O2) pendant au moins 10 min, puis ajuster le pH final à 7,4 avec 1 M NaOH si nécessaire. Maintenir l’oxygénation et le pH de la solution en bouillonnant continuellement avec le carbogen tout au long de l’expérience.
  4. Préparer la solution de tranchage de 200 mL en ajoutant 1 mM d’acide kynurnique à l’ACSF. Solution sonicate dans un bain d’eau sonicating pendant 10 min jusqu’à ce que l’acide kynurnique soit dissous. Bouillonner continuellement avec du carbogen et le placer sur la glace.
    ATTENTION : Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de l’acide kynurnique.
  5. Montez une lame appropriée dans le vibratome suivant les instructions du fabricant. Réfrigérer la chambre de tranchage vibratome en l’entourant de glace.

2. Ablation du cerveau avec racine de nerf auditif intacte pour la stimulation

REMARQUE : Des souris pour ces expériences ont été obtenues en croisant des souris transgéniques ChAT-IRES-Cre sur un fond de C57BL/6J avec des souris de journaliste de tdTomato (Ai14). Les souris utilisées pour l’histologie et l’électrophysiologie étaient début post-audition (P14-P23), qui est autour de P12 chez la souris. Les neurones exprimant tdTomato dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) ont été précédemment caractérisés comme neurones MOC dans cette ligne de souris57.

  1. Euthanasier (p. ex., asphyxie au CO2) et décapiter l’animal à l’aide de procédures institutionnelles approuvées.
  2. À l’aide d’une lame de rasoir, couper la peau au milieu du crâne du nez à l’arrière du cou. Peler la peau arrière pour exposer le crâne.
  3. À l’aide de petits ciseaux, faire une incision dans le crâne à travers la ligne médiane à partir de la base (extrémité caudale près de la moelle épinière) du crâne et en continuant vers le nez.
  4. À la suture lambda, faire des coupures dans le crâne de la ligne médiane, latérale vers l’oreille des deux côtés. Peler le crâne pour exposer le cerveau.
  5. À partir de l’extrémité rostrale, soulevez doucement le cerveau loin du crâne à l’aide d’une petite spatule de laboratoire ou de forceps contondants. Coupez le nerf optique et continuez à travailler doucement le cerveau vers l’arrière, exposant la surface ventrale.
  6. Coupez les nerfs trigeminaux en les pinçant avec de fines forceps près de la surface ventrale du tronc cérébral.
    REMARQUE : Faites ceci soigneusement pendant que le nerf vestibulocochlear se trouve juste en dessous de ceci et doit être intact pour la stimulation éventuelle.
  7. Placer la préparation dans une boîte de Pétri en verre remplie de solution de tranchage froid. Placer le plat sous un microscope disséquant. Bouillonner délicatement de carbogen.
  8. Coupez le nerf facial près du tronc cérébral et exposez le nerf vestibulocochlear.
  9. À l’aide de forceps fins, poussez les pointes dans le foramina où le nerf vestibulocochlear sort du crâne autant que possible et pincez le nerf pour le couper, laissant la racine nerveuse attachée au tronc cérébral. Répétez ceci de l’autre côté.
  10. Une fois que les deux racines nerveuses sont libres, retirez les méninges et la vascularisation de la surface ventrale du tronc cérébral près du corps trapézoïde.
  11. Libérez complètement le cerveau du crâne en pinçant les nerfs crâniens restants et le tissu conjonctif en prenant soin de préserver le reste de la moelle épinière si possible.

3. Bloquer et monter le cerveau sur scène (disque magnétique)

  1. Préparer la surface du cerveau à fixer au stade en bloquant le cerveau au niveau du chiasm optique.
    1. Avec la surface ventrale vers le haut, stabilisez le cerveau à l’aide d’un outil contondant pour immobiliser doucement la moelle épinière de sorte que le cerveau ne s’incline pas pendant l’étape suivante.
    2. Au niveau du chiasm optique, utilisez des forceps ouverts pour créer le plan pour bloquer le cerveau en insérant à travers le cerveau jusqu’au fond du plat. Insérez les forceps à un angle d’environ 20° de la verticale de sorte que les extrémités sortent de la surface dorsale du cerveau caudale au chiasm optique.
    3. Couper le long des forceps à l’aide de la lame de rasoir.
  2. Collez le cerveau à la surface de la scène.
    1. Préparer un petit bloc (~1 cm3) de4% d’agar pour soutenir le cerveau.
    2. Placez une petite goutte de colle sur la scène et étalez-la dans un rectangle afin que le cerveau et le bloc d’agar puissent être collés vers le bas.
    3. À l’aide de forceps, soulevez soigneusement le cerveau et tamponnez doucement l’excès de liquide à l’aide du bord d’une serviette en papier. Placez la surface bloquée sur la colle, la surface ventrale sera vers la lame pendant le tranchage.
    4. Poussez doucement le bloc d’agar contre la surface dorsale du cerveau pour le soutenir pendant le tranchage et pour assurer un bon positionnement cérébral (c.-à-d. angle).

4. Trancher le cerveau pour créer une tranche de coin

REMARQUE : Préparez une tranche de cerveau à l’aide d’un vibratome qui a la racine du nerf cochléaire sur le côté épais et les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) et le noyau médial du corps trapézoïde (MNTB) sur le côté mince.

  1. Placez le disque magnétique avec le cerveau attaché sur la base de scène et placez-le dans la chambre de tranchage avec la surface ventrale du cerveau orientée vers la lame.
  2. Remplissez la chambre d’une solution de tranchage glacé et d’une bulle de carbogen.
  3. Abaissez la lame dans la solution et coupez les tranches caudales à la région d’intérêt pour vous assurer que les tranches sont symétriques. Si les tranches semblent asymétriques, inclinez légèrement le stade pour obtenir une symétrie.
    REMARQUE : Les vitesses des pales entre 0,05 et 0,10 mm/s étaient efficaces pour couper des tranches saines et peuvent varier selon l’âge des animaux et la région du cerveau.
  4. Une fois que les tranches sont symétriques, déplacez la scène ~15° (correspondant à environ 3 anneaux concentriques sur la base de la scène) d’un côté.
    REMARQUE : Éloignez la scène de la racine nerveuse auditive que vous souhaitez conserver dans la tranche.
  5. Continuer à trancher soigneusement jusqu’à ce que la racine nerveuse auditive soit proche de la surface d’un côté, et que le nerf facial puisse être vu à la surface de l’autre côté.
  6. Déplacez la scène vers 15° vers la position d’origine.
  7. Éloignez la lame du tissu et faites tourner la base de la scène à 90° de sorte que le bord latéral du côté mince soit orienté vers la lame. Abaissez la lame de plusieurs centaines de microns, puis amenez lentement la lame près du bord du tissu. Répétez cette répétition jusqu’à ce que la lame touche le bord latéral. Abaissez la lame à l’épaisseur désirée du bord mince de la tranche, ici deux cents microns supplémentaires.
    REMARQUE : La tranche résultante est idéalement ~300 mm d’épaisseur au niveau du noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) sur le côté où le serrage de correction aura lieu.
  8. Éloignez la lame du tissu et faites tourner la base de la scène vers l’arrière de sorte que la surface ventrale lui soit face.
  9. Faire la coupe qui désigne la surface rostrale de la tranche compensée. Transférer la tranche sur un morceau de papier d’interface (1 cm2)surface caudale vers le bas. Déplacez la tranche dans la chambre d’incubation ou tout autre appareil d’incubation approprié pour la récupération (30 min à 35 °C).
    REMARQUE : Le nerf facial doit être visible sur les deux hémisphères de la tranche à la surface du rostral (voir la figure 1B).

5. Mise en place et enregistrement d’électrophysiologie

  1. Placer la tranche compensée dans la chambre d’enregistrement et fixer la tranche à l’aide d’une harpe ou d’un système stabilisateur. Imprèdre le tissu en continu à une vitesse de 7-10 mL/min avec chaud (35 °C) ACSF bouillonné avec du carbogen.
  2. Identifier les neurones MOC génétiquement étiquetés dans le VNTB à l’aide de l’épifluorescence avec des filtres d’émission de 561 nm pour les enregistrements patch-clamp. Retourner la tranche s’il n’y a pas de cellules potentiellement patchables.
  3. À l’aide de l’optique DIC, concentrez-vous sur la racine nerveuse auditive sur le côté épais de la tranche et utilisez un micromanipulateur pour déplacer l’électrode bipolaire stimulant le tungstène jusqu’à la racine nerveuse auditive et doucement à la surface du tissu.
    REMARQUE : Des électrodes d’aspiration ont été employées dans des expériences auditives de stimulation de nerf dans d’autres laboratoires. Les électrodes en verre theta, ou méthodes de stimulation optique peuvent être utilisées si applicable à d’autres préparations spécifiques.
  4. Déplacez le champ de vision vers le VNTB pour choisir un neurone MOC à cibler pour l’électrophysiologie de pince de correction.
  5. Remplissez une pipette d’enregistrement avec une solution interne appropriée pour l’expérience proposée.
  6. Patch et enregistrer à partir du neurone MOC dans la configuration de l’ensemble des cellules. Compenser la capacité membranaire et la résistance aux séries si nécessaire.
  7. Ajustez l’amplitude électrique de stimulation de la racine auditive de nerf pour obtenir des événements postsynaptiques cohérents dans le neurone de MOC.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire de déplacer l’électrode de stimulation.
  8. Exécutez des protocoles de stimulation appropriés pour observer les courants synaptiques évoqués dans le MOC (pince de tension) ou les modèles potentiels d’action (pince actuelle).
    REMARQUE : La préparation des tranches compensées peut être utilisée avec tous les outils typiques de pince à timbres tels que les enregistrements de patchs en vrac, la pharmacologie, l’optogénétique, l’imagerie calcique, le déballage du neurotransmetteur, etc.

6. Confirmation histologique des noyaux de tronc cérébral

REMARQUE : Ceci est fait avec la coloration violette crésyle, dans la tranche fixe et re-sectionnée de coin. Cette méthode permet de visualiser les noyaux contenus dans la tranche.

  1. Après avoir préparé une tranche de quartier, submerger la tranche dans fixatif (4% de PFA en PBS) pendant la nuit. Rincer la tranche 3x pendant 10 min en PBS (température ambiante sur un shaker), puis placer dans 30% saccharose en PBS pendant la nuit à 4 °C pour cryoprotect.
  2. Re-sectionner la tranche sur une microtome congélation (40-70 mm) et recueillir des sections en série dans une plaque de puits 24 en PBS.
  3. Monter les sections sur les glissières enduites de gélatine et laisser sécher complètement. Placez les glissières dans le chariot à glissières.
  4. Préparer des solutions de violette cresyl
    1. Préparer 1% d’acétate de violette crésyle en mélangeant 5 g d’acétate de violette crésyle dans 500 mL dH2O
    2. Préparer le tampon d’acétate en préparant d’abord la solution A de 90 mL (acide acétique glaciaire de 540 mL + 89,46 mL dH2O) et la solution B de 10 mL (acétate de sodium de 10 mL dH2O). Combinez la solution A et la solution B donnant le tampon d’acétate.
    3. Mélanger 1% d’acétate de violette crésyle avec le tampon d’acétate 1:1 pour 0,5% de violette crésyle dans un tampon d’acétate. Filtrer avant utilisation.
    4. Préparer 95 % et 70 % d’éthanol en diluant 100 % d’éthanol avec des volumes appropriés de dH2O
  5. Effectuez le protocole de coloration de violette cresyl. Déplacez le chariot de glissière à travers les plateaux de solution, buvard solution excédentaire sur une serviette en papier entre les plateaux: xylène - 5 min; 95% d’éthanol – 3 min; 70% d’éthanol – 3 min; dH2O - 3 min; Solution violette cresyl de 0,5 % – surveillance de 8 à 14 min fréquemment jusqu’à ce que la coloration nucléaire devienne pourpre foncé; dH2O - 3 min; 70% d’éthanol – 3 min; 95% d’éthanol – 1-2 min; 100 % éthanol – la trempette glisse deux fois; xylène – 5 min; xylène : 25 min jusqu’à ce que le montage soit effectué.
    AVERTISSEMENT : N’utilisez des xylènes que sous un capot de fumée.
  6. Retirez les glissières du xylène une à la fois et placez immédiatement les glissements de couverture sur les glissières à l’aide d’un support de montage. Laisser sécher le milieu de montage (toute la nuit).
  7. Sections d’image.

7. Étiquetage de biocytine pour le traçage antét dégrade des axones dans le tissu vivant et nonfixé

  1. Préparer une tranche de quartier comme ci-dessus (étapes 2-4).
  2. Transférer la tranche sur du papier d’interface (~1 cm2). Sous un microscope disséquant, localiser le CN sur le côté épais de la tranche.
  3. Retirez soigneusement l’excès d’ACSF de la zone entourant la tranche en tordant un coin d’un papier de soie pour éloigner l’ACSF du tissu. Cela empêche la biocytine de se propager aux zones environnantes de la tranche, ce qui pourrait mener à l’absorption dans les cellules à l’extérieur du CN.
  4. Avec des forceps fins, choisissez un petit cristal de biocytine et placez-le à la surface du CN. Pressez doucement le cristal dans le tissu pour favoriser le contact avec les neurones et l’absorption subséquente dans le somata. Répétez cette étape pour couvrir la région d’intérêt désirée, dans ce cas les régions du CN contenant des neurones T-stellate et GBC.
  5. Placer la tranche dans une chambre d’incubation. Laisser la tranche couver pendant 2-4 h à 35 °C pour permettre l’absorption et le transport de la biocytine. Après l’incubation, rincer la tranche dans l’ACSF pour éliminer les particules de biocytine.
  6. Placer la tranche dans le fixatif (4% de PFA dans PBS) pendant la nuit. Rincer 3x pendant 10 min en PBS.
  7. Tranche cryoprotect en saccharose à 30% en PBS pendant la nuit à 4 °C ou jusqu’à ce que la tranche coule.
  8. Resect le tissu pour produire des sections transversales sur une microtome congélation à 70-100 mm.
  9. Traiter le tissu à l’aide de méthodes immunohistochimiques standard avec une streptavidine conjuguée fluorescente.
    REMARQUE : Une immunohistochimie supplémentaire peut être effectuée sur les sections si elle est utile pour étiqueter les corps cellulaires présynaptiques, les axones, les récepteurs ou d’autres molécules synaptiques importantes pour la visualisation des circuits (c.-à-d. que les étapes primaires des anticorps ne devraient pas nuire à la visualisation secondaire de la biocytine).
  10. Imagez le tissu.

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Representative Results

Examen histologique de la tranche de coin
Pour notre étude de la fonction auditive des neurones du tronc cérébral, la préparation de la tranche compensée a été conçue pour contenir la racine nerveuse auditive et le CN contralatéral aux neurones MOC ciblés pour les enregistrements (tranche d’exemple indiquée à la figure 1B). L’examen histologique initial de la préparation est important pour confirmer que la tranche contient les noyaux nécessaires à l’activation du circuit et que les projections axonales sont intactes. Deux types de cellules au sein du CN fournissent des renseignements solides aux neurones du MOC. Les cellules T-stellate sont supposées pour fournir l’entrée excitatrice aux neurones de MOC39,40,41,58. Les cellules touffue globulaires (GBC) excitent les neurones MNTB dans l’hémisphère contralatéral (via le calyx spécialisé de la synapse tenue)34,36,37,38,59,60 qui, à leur tour, fournissent une entrée inhibitrice aux neurones MOC57 (figure schématique 1A). Pour confirmer la présence des cellules T-stellate et des GBCs, nous avons re-sectionné (à 50 μm) une tranche de coin qui a été fixée par submersion dans 4% de PFA et a exécuté la coloration violette de cresyl pour étiqueter le somata. Dans le côté épais de la tranche de coin(figure 2, hémisphère gauche), le CN était présent dans presque toute son étendue rostro-caudale. De plus, les subdivisions dorsale et ventrale du CN étaient intactes(figure 2; flèche et pointe de flèche en S19). Les neurones t-stellate et les GBCs se regroupent dans le noyau cochléaire ventral près de l’endroit où le nerf auditif (figure 2; flèche en S17) entre dans le CN61,62,63,64,65. La tranche compensée contient également des neurones des neurones ipsilateral MNTB aux neurones MOC à partir de laquelle les enregistrements sont effectués (hémisphère mince de la tranche compensée d’origine, côté droit dans la figure 2). Cela confirme qu’au moins une partie de l’apport inhibiteur aux neurones MOC est intacte (Figure 2, tranches 1-15, mis en évidence par des ovales pointillés en S11).

Dans des expériences distinctes, nous avons confirmé que les axones et les terminaux présynaptiques des neurones du CN étaient intacts dans la tranche compensée à l’aide de l’étiquetage antétérograde avec de la biocytine. Tout d’abord, la tranche de coin en direct a été préparée et placée sur du papier d’interface. Immédiatement après la préparation de la tranche de coin, des cristaux de biocytine ont été placés dans le CN, ce qui a permis l’absorption et le transport d’antét dégrades le long des axones pendant une période d’incubation. Ensuite, la fixation et le re-section du tissu (sections de 70 mm) ont été effectuées. La coloration des sections avec la streptavidine fluorescente étiquetée a été exécutée pour visualiser des axones étiquetés avec la biocytine. Des images confoccales de ces sections montrent un étiquetage lumineux dans le CN où les cristaux ont été placés et pris dans des corps cellulaires(figure 3A, hémisphère gauche, zone pointillée). Les axones sortant du CN le long de la strie acoustique ventrale(figure 3A,pointes de flèche blanches) étaient clairement étiquetés et pouvaient être suivis jusqu’à leurs points de terminaison. Les ponctions biocytines positives entourant les neurones contralatéraux du MOC suggèrent que notre préparation préserve les contacts synaptiques provenant du CN (figure 3B). De même, les calyces étiquetées de Held dans le MNTB contralatéral indiquent que les axones qui se projettent des GBCs aux neurones MNTB sont conservés dans la tranche compensée (figure 3C). Ces examens histologiques confirment que notre tranche de coin contient à la fois les corps cellulaires et les projections axonales des circuits d’entrée afferents aux neurones MOC, ce qui, par conséquent, nous permet de mesurer les réponses postsynaptiques évoquées par la stimulation du nerf auditif et la propagation subséquente de l’activité par des circuits ascendants.

Physiologie synaptique dans la tranche de coin
L’intégration d’entrées synaptiques excitatrices et inhibitrices façonne de façon critique l’activité neuronale. Nous avons récemment décrit les apports inhibiteurs aux neurones MOC des neurones du MNTB57, mais l’effet de l’intégration de ces intrants avec des entrées excitatrices sur l’activité neuronale MOC est inconnu. Dans une tranche compensée d’une souris ChAT-IRES-Cre x tdTomato, des enregistrements de pince de tension ont été exécutés à partir d’un neurone MOC. Le courant a été appliqué par l’intermédiaire d’une électrode stimulante bipolaire de tungstène conduite par une unité d’isolement de stimulus pour évoquer la libération de neurotransmetteur des axones présynaptiques. Tout d’abord, les stries acoustiques ventrales (VAS) à la ligne médiane ont été stimulées électriquement pour activer directement les axones T-stellate et les neurones MNTB par stimulation axone GBC (figure 4A), pour mesurer la latence aux réponses post-synaptiques dans une configuration d’enregistrement qui imite les expériences typiques en fines tranches (figure 4B), exemples de traces, gris, potentiel de détention de -60 mV). Dans des expériences séparées, la racine auditive de nerf a été stimulée pour activer les circuits ascendants monaural et les réponses post-synaptiques ont été mesurées aux neurones de MOC comme décrit ci-dessus. La stimulation électrique à l’un ou l’autre endroit a évoqué un artefact électrique rapide suivi de réponses actuelles à plusieurs dents (exemples de réponses de la stimulation AN à la figure 4C,traces noires, potentiel de possession de -60 mV). Nous avons comparé des mesures de latence de début du premier courant postsynaptique (PSC) évoqués avec la stimulation directe du VAS avec ceux évoqués avec la stimulation auditive de nerf et avons trouvé une latence sensiblement plus longue aux événements de stimulation d’AN. Ceci a été attribué au retard synaptique encouru à la synapse d’AN/CN (stimulation d’AN : 5.27 ± 0.43 ms, déviation absolue médiane de ± (MAD), gamme 4.26-5.93 ms, n = 8 ; Stimulation vas: 1,98 ± 0,28 ms, médiane ± MAD, gamme 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon Signed Ranks Test, p = 0.014, Figure 4D). Ces résultats confirment que la stimulation de la racine auditive de nerf a comme conséquence l’activation synaptique des neurones de CN et l’activité suivante de circuit, représentant plus étroitement in vivo - comme le moment que la stimulation directe des axones de T-stellate ou de GBC/MNTB.

Avec notre solution interne à base de césium, haute [Cl-] utilisée dans la pince de tension, les PSC excitateurs (glutamatergiques) et inhibiteurs (GABA et glycinergique) sont à la fois vers l’intérieur au potentiel de membrane de repos (-60 mV) et donc indiscernables. Tout en évoquant l’activité du circuit dans la configuration an-stimulante, nous avons isolé électriquement l’entrée inhibitrice présumée en déplaçant le potentiel de détention à 0 mV, le potentiel approximatif d’inversion pour les courants glutamatergiques 2blés ampa. Dans notre exemple de neurone, des réponses actuelles vers l’extérieur ont été observées à 0 mV(figure 4Ci,traces rouges) indiquant des conductances de chlorure. Il s’agit probablement de réponses synaptiques GABA ou glycinergiques. Ces données démontrent l’utilité de la tranche de coin pour activer les entrées excitatrices et inhibitrices aux neurones de MOC en stimulant la racine auditive de nerf, avec l’activation des circuits afferents suivants. En outre, divers modèles de réponses post-synaptiques ont été évoqués par la stimulation AN, suggérant que même dans des conditions de stimulation identique des axones AN, l’activité de l’ensemble du circuit est dynamique et complexe. Ce paradigme expérimental permet une analyse détaillée de la façon dont les stimuli auditifs complexes se propagent à travers le tronc cérébral et s’intègrent aux neurones MOC, déterminant la sortie du système efferent MOC et l’impact final sur la cochlée.

Figure 1
Figure 1 : Tranche de coin schématique et image d’exemple. (A) Schéma du circuit médial de rétroaction olivocochléaire. Les flèches bleues indiquent la voie ascendante afferente aux neurones de MOC et les flèches noires indiquent la voie descendante de rétroaction des neurones de MOC à la base des cellules de cheveux externes (OHC). (B) Image brightfield d’une tranche compensée avec des étiquettes de la racine du nerf auditif (ANR) et le noyau cochléaire (contour pointillé) sur le côté épais. Astérisque indique l’emplacement approximatif du noyau ventral du corps trapézoïde où les neurones MOC sont ciblés pour patch-clamping sur le côté mince de la tranche compensée. Les lignes noires pointillées indiquent les nerfs faciaux qui peuvent être vus dans les deux hémisphères de la tranche sur la surface rostrale. IHC - cellule capiculaire interne, GBC - cellule touffue globulaire, SPN - noyau supérieur de paralivary, MNTB - noyau médial du corps trapézoïde, VNTB - noyau ventral du corps trapézoïde, LSO - olive supérieure latérale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Sections tachées de violette cresyl provenant d’une tranche compensée qui a été re-sectionnée à 50 μm. Toutes les autres sections ont été photographiées. Les sections sont numérotées rostral --> caudal. Les tranches compensées avaient tendance à contenir l’ensemble du noyau cochléaire (CN), y compris à la fois le CN dorsal (flèche en S19) et ventral CN (pointe de flèche en S19), racine nerveuse auditive (pointe de flèche ouverte en S17) et une grande partie du MNTB (zone sombre près de la surface ventrale en S3-S15, mis en évidence avec des ovales pointillés en S11). D et V sur la barre d’échelle représentent dorsale et ventrale dans l’orientation des tranches. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Les axones de l’entrée ascendante vers les neurones MOC du noyau cochléaire contralatéral demeurent intacts dans la tranche compensée. (A) La section la plus rostrale d’une tranche compensée prélevée sur une souris P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (fluorescence rouge) qui a été re-sectionnée (70 μm) et traitée pour la visualisation de la biocytine. L’image confoccale est une pile z carrelée de projection d’intensité maximale. Les axones de la strie acoustique ventrale sont mis en évidence par des pointes de flèche blanches. Le contour pointillé indique la petite partie du noyau cochléaire restant dans cette tranche rostrale la plus. Barre d’échelle 500 μm. (B) Image confocale d’un neurone positif ChAT-IRES-Cre x tdTomato dans le VNTB avec ponction positive de biocytine dans le neuropil environnant. Barre d’échelle 50 μm. (C) Axones étiquetés Biocytine montrés traversant la ligne médiane et se terminant dans le MNTB contralatéral comme calyces de Held. La ligne verticale pointillée représente la ligne médiane de la tranche. Barre d’échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : La stimulation électrique des entrées afferentes dans la pince de tension donne des courants postsynaptiques multipeak dans les neurones MOC. (A) Schéma de tranche compensée avec mise en place d’enregistrement pour la stimulation ventrale de stria acoustique (VAS) (électrode stimulante grise) et la stimulation de nerf auditif (AN) (électrode stimulante noire) des entrées afferentes au MOC. (B) Exemples de courants postsynaptiques (PSC) à partir d’un neurone P17 individuel évoqué avec un seul stimulus électrique près de la ligne médiane à -60 mV. (C) PSCs évoqués lors d’une stimulation AN à -60 mV dans un neurone P15. (Ci) Exemple pscs dans la même cellule que C évoqué à 0 mV potentiel de détention (le potentiel d’inversion approximative pour ampa courants médiatisés dans notre configuration d’enregistrement, rouge). (D) Données démographiques pour la quantification de la latence à la première CFP pour la stimulation vas et AN. Boîtes : quartiles, encart de ligne : médiane, encart carré : moyenne, moustaches : déviation absolue médiane. * p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La procédure de tranchage décrite ici appelée tranche compensée est puissante pour maintenir des circuits neuronaux présynaptiques intacts, mais avec l’accessibilité de l’expérimentation de tranche de cerveau pour l’analyse de la fonction neuronale. Un grand soin doit être pris en plusieurs étapes initiales afin de maximiser l’utilité de la préparation à l’analyse du circuit. Les dimensions du coin doivent être confirmées à l’aide de l’examen histologique, qui fait partie intégrante de la confirmation que les noyaux présynaptiques et leurs projections axonales sont contenus dans la tranche compensée préparée. La géométrie des tranches peut nécessiter des modifications si les projections sont coupées ou si peu d’axones atteignent les noyaux cibles. Plus généralement, la coupe finale sur le vibratome pour la tranche compensée est d’une importance critique. La préparation optimale de tranche de coin exigera une combinaison de l’utilisation cohérente des configurations vibratomes comprenant l’utilisation des marques concentriques de cercle sur la base de scène, avec l’ajustement des arrangements basés sur des repères connus de cerveau. Après optimisation de la géométrie des tranches, nous avons enregistré des PSC cohérents dans les neurones MOC évoqués en stimulant électriquement la racine nerveuse auditive dans 8 des 18 tranches compensées. Dans nos travaux précédents, nous avons pu évoquer les PSC inhibiteurs par stimulation directe des axones MNTB dans environ 60% des neurones MOC57, ce qui suggère que notre taux de réussite ici n’est qu’une réduction modeste compte tenu de la longue portée des intrants et la nécessité de l’activation du circuit polysynaptique. Lors de la préparation de la tranche, il est conseillé de se tromper sur le côté plus épais car une diminution de la visibilité due à une tranche plus épaisse est favorable sur une section inutilisable qui est incomplète ou manque de connectivité de circuit. Toute configuration ou dimensions de tranche peut être utilisée, tant que la tranche s’adapte sous l’objectif du microscope d’enregistrement, est accessible par patch et électrodes stimulantes (ou d’autres sondes ou équipements), et est assez mince pour optiquement basée patch-clamping à la cellule postsynaptique d’intérêt. Une dissection rapide et douce et des conditions d’incubation et de récupération adéquates sont également importantes pour maintenir la viabilité du circuit pour les expériences de pinces à patch. Spécifique à notre préparation auditive du tronc cérébral, le cerveau doit être retiré très soigneusement du crâne afin de préserver les racines intactes et fonctionnelles du nerf auditif. L’étirement ou la déchirure du nerf aura un impact sur la capacité de stimuler les fibres et d’obtenir de l’activité dans les neurones auditifs. En raison du plus grand volume de tissu dans la tranche, la modification des solutions traditionnelles de tranchage, des températures, des détails d’incubation, et des systèmes de perfusion peut améliorer la santé de la tranche. Ici, nous employons de légères modifications à notre préparation normale de tranche. Il s’agit notamment de temps d’incubation de récupération plus courts (30 minutes contre 60 minutes) et des débits plus rapides dans le système de perfusion de la chambre de tranche.

Une fois que les dimensions des tranches et les détails d’incubation ont été déterminés, la fonction et la connectivité des différents composants des circuits à l’intérieur de la tranche doivent être démontrées. Dans notre préparation, nous nous assurons que les entrées excitatrices et inhibitrices, supposées provenir du noyau cochléaire avec T-stellate et GBC (via le MNTB), sont présentes comme prévu. D’autres méthodes de stimulation telles que les électrodes d’aspiration pour le nerf auditif, ou les méthodes de stimulation optique telles que l’optogénétique ou le déballage du neurotransmetteur focal peuvent également augmenter l’activation du circuit ou permettre une activation spécifique de type cellulaire lorsqu’elles sont associées au ciblage génétique des sous-types cellulaires.

Bien que cette méthode de tranchage sera, espérons-le, utile pour de nombreux systèmes et circuits, certaines des limites des sections standard en fines tranches sont également pertinentes pour cette préparation. En général, il peut être difficile de préserver les circuits avec des modèles de projection moins planaires, car les axones seraient probablement coupés. L’activation du circuit aux nerfs crâniens, comme cela a été fait ici pour imiter les entrées auditives, peut ne pas être possible dans de nombreux circuits. Comme pour les autres préparations de tranches, les effets réseau de toute pharmacologie doivent être pris en considération. Par exemple, l’application par bain de inhibiteurs des récepteurs du glutamate pour isoler les inhibiteurs (GABA ou glycinergiques) ou d’autres modes de transmission ne peut pas être utilisée avec l’activation du circuit polysynaptique lorsque le glutamate est nécessaire pour l’activation des neurones en amont du neurone cible patché. C’est vrai dans notre cas car les synapses AN/CN et GBC/MNTB sont glutamatergiques, par conséquent, toute transmission serait éliminée aux neurones MOC avec l’application de bain des inhibiteurs de récepteur de glutamate. De plus, l’application de inhibiteurs des récepteurs GABA ou glycine pour éliminer les réponses synaptiques MNTB-MOC aurait pour conséquence involontaire d’éliminer la connectivité inhibitrice intrinsèque au sein du CN qui pourrait façonner les modèles d’entrées afferentes aux neurones du MOC. L’application focale des bloqueurs de récepteur, avec l’éjection de pression ou l’iontophoresis, pourrait être employée pour limiter la fonction pharmacologique.

Enfin, la principale limitation de cette technique in vitro, et de toute autre technique in vitro, est que bien que cette préparation maximise l’activation des circuits auditifs ascendants monaux, le reste du système nerveux, y compris les récepteurs périphériques qui codent les stimuli, est absent. Cela comprend la cochlée elle-même, les entrées excitatrices del’autre oreille 66, les connexions cncommissaires 67,68,69,70, et descendant cortical71,72,73,74 et colliculaire75,76 projections et entrées modulatoires77,78,79,80 connu pour influencer l’activité du CN et soc noyaux. Bien qu’il soit possible qu’une partie des projections descendantes de l’IC soient maintenues, il serait impossible d’inclure à la fois des projections corticales et des projections du CN en raison de la géométrie des tranches. Par conséquent, nous nous concentrons sur les circuits auditifs ascendants de la cochlée avec les expériences actuelles. L’épaisseur minimale de la tranche sur le côté mince réduit également la capacité d’effectuer des analyses de circuit polysynaptique binaural, ce qui est un avantage des préparations symétriques tranche épaisse10,11. En outre, nous sommes incapables de stimuler le nerf auditif avec le son pour évoquer les modèles naturels de l’activité du circuit. Les réponses nerveuses auditives sont tonotopiquement variées, nerveuses etplastiques 81,82,83,84, ce qui rend difficile de simuler parfaitement avec notre méthode de stimulation électrique. Il s’agit d’un inconvénient majeur de l’expérimentation in vitro dans le système auditif. La restriction tonotopic de notre stimulation n’est pas possible puisque stimuler la racine entière d’AN suscitera la picking dans les fibres d’AN à travers le gradient tonotopic. Il n’est pas non plus possible d’imiter avec précision la diversité des réponses à la fibre AN (c.-à-d. les fibres à faible taux spontané par rapport aux fibres à taux spontané élevé). Il est également difficile de faire correspondre avec précision le codage dynamique de l’intensité de plusieurs fibres AN au CN. Cependant, nous sommes en mesure d’utiliser notre logiciel d’électrophysiologie pour produire une variété de modèles de stimulation visant à imiter la sortie appropriée des nerfs auditifs au cours de différents stimuli acoustiques (par exemple, des sons courts et forts, des sons silencieux et prolongés ou des sons dans le bruit de fond) en variant la fréquence de stimulus à la fois entre les protocoles de stimulus électrique et aussi dans un protocole individuel pour rapprocher les entrées combinées an (modélisé en réf.85). La surveillance de la production de MOC au cours de ces expériences mettra à l’épreuve nos hypothèses concernant les modèles de stimulus qui peuvent favoriser l’inhibition ou l’excitation aux neurones MOC.

Malgré les limitations décrites ci-dessus, une méthode de préparation des tranches compensées a des avantages par rapport aux méthodes in vivo et typiques de physiologie des tranches in vitro et peut être utilisée pour approcher l’activation du circuit in vivo aussi étroitement que possible dans la tranche pour les cellules difficiles d’accès. Les enregistrements in vivo de cellules entières dans le tronc cérébral auditif ont été rares en raison des difficultés d’accès à cette zonechirurgicalement 86. Au lieu de cela, la tranche était prête à inclure des entrées ascendantes aux neurones MOC en commençant par le nerf auditif, qui est stimulé directement pour activer l’ensemble du circuit monaural ascendant. Nous démontrons l’activation des entrées synaptiques excitatrices et inhibitrices, et les réponses à ces entrées fournissent l’information valable au sujet du moment des entrées synaptiques pendant qu’elles atteignent les neurones de MOC. Ceci fournit une plate-forme pour l’expérimentation à haut débit où nous pouvons employer un grand répertoire d’outils in vitro d’électrophysiologie tels que l’imagerie de calcium ou de tension, le décaging de neurotransmetteur, et la pharmacologie intracellulaire (par l’intermédiaire de la pipette de correction) et extracellulaire (par l’application de bain ou l’iontophoresis). La préparation devrait également offrir une augmentation du débit sur les préparations de tranches épaisses en raison d’une meilleure visibilité des neurones cibles à l’aide de l’optique DIC, qui se brouillent avec l’épaisseur accrue des tissus, en particulier dans le tronc cérébral ventral. Dans l’ensemble, cette technique améliore le ciblage et le débit par rapport aux méthodes in vivo, et offre de meilleures possibilités d’analyse des circuits que les méthodes traditionnelles de physiologie des tranches.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

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References

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Neurosciences numéro 162 neurones olivocochléaires médiaux électrophysiologie des tranches in vitro intégration synaptique nerf auditif tronc cérébral auditif noyau cochléaire neurotransmission inhibitrice
Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo
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Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

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