Summary
ニューロンへの多様なシナプス入力の統合は、自然なタイミングと回路の可塑性のためにすべてのシナプス前核を保存する準備で最もよく測定されますが、脳スライスは通常、多くの接続を切断します。インビボ回路活性を模倣しながら、インビトロ実験能力を維持する修飾脳スライスを開発しました。
Abstract
インビトロスライスの電気生理学の技術は精密な電気および時間的決断の単細胞活動を測定する。脳スライスは、パッチクランプやイメージングのためにニューロンを適切に視覚化してアクセスするために比較的薄くする必要があり、脳回路のインビトロ検査は急性スライスに物理的に存在するものだけに限定されます。シナプス前核の大部分を維持しながらインビトロスライス実験の利点を維持するために、我々は新しいスライス調製物を開発した。この「ウェッジスライス」は、脳幹の内側オリボコクレア(MOC)ニューロンへの多様なモノラル、音駆動入力を特徴付けるために、パッチクランプ電気生理学の録音用に設計されました。これらのニューロンは、対側耳および対応する人工内核(CN)における刺激によって活性化されたニューロンから、その主要な刺激性および抑制性入力を受ける。非対称の脳スライスは、1つの半球の横端にあるロストロ・カウダル領域で最も厚く、反対側の半球の横端に向かって薄く設計されました。このスライスには、厚い側に、聴覚神経根が脳に聴覚刺激に関する情報を伝え、本質的なCN回路、および逆MOCニューロンに収束する不活性化および三シナプス阻害性の両方の経路が含まれている。記録は、スライスの薄い側のMOCニューロンから行われ、一般的なパッチクランプ実験のためにDIC光学を使用して視覚化されます。聴神経の直接刺激は、聴神経の脳幹に入る時に行われ、MOCニューロンのシナプス上流で本質的なCN回路活性およびシナプス可塑性が起こることを可能にする。この技術により、in vivo回路の活性化をスライス内で可能な限り近づけることができます。このウェッジスライス調製物は、インビトロスライス生理学の技術的利点と組み合わせて、回路分析が上流接続性と長距離入力の保存の恩恵を受ける他の脳回路に適用可能です。
Introduction
神経回路の活動の観察は、理想的には、生体内の脳領域間のネイティブ感覚入力とフィードバック、および無傷の接続性で行われます。しかし、神経回路の単一細胞分解能を与える実験を行うことは、無傷の脳における技術的な課題によって依然として制限されている。生体内の細胞外電気生理学または多光子イメージング法は、インタクト神経系の活動を調査するために使用できますが、異なる入力がどのように統合されるかの解釈や閾値以下のシナプス入力の測定は困難なままです。インビボ全細胞記録はこれらの制限を克服するが、容易にアクセスされる脳領域でさえ、実行することは困難である。単一細胞分解能実験の技術的課題は、脳の深部に位置する特定のニューロン集団、または生体内の細胞を見つけるために遺伝的ツールを必要とする空間的に拡散集団(例えば、オプトロード記録と組み合わせたチャネロドプシンの遺伝的発現)または標識を記録した後のポストホックの細胞化学的同定(例えば神経伝達特異的マーカーを有する)でさらに増幅される。脳幹の腹側表面の近くに拡散して位置している内側オリボコクリア(MOC)ニューロンは、上記の制限1に苦しんで、生体内実験のためにアクセスすることは非常に困難です。
脳のスライス(約100〜500μmの厚さ)は、同じスライス2、3、4、5、6、7、8、9に含まれる接続ニューロンの物理的な分離のために、聴覚脳幹回路を含む脳回路を研究するために長い間使用されてきました。より厚いスライス(>1 mm)を用いた実験は、内側優れたオリーブ10,11を含む優れたオリバリ複合体(SOC)の領域における二国間入力の統合方法を理解するために他の研究室で採用されている。これらのスライスは、聴覚神経(AN)の軸索がスライス内にそのまま残り、CNでシナプス神経伝達物質の放出を開始するために電気的に刺激されるように調製され、音に反応する第一次聴覚ニューロンの活性を模倣した。これらの厚いスライスの1つの大きな欠点は、パッチクランプ電気生理学的記録(「パッチング」)のためのニューロンの可視性です。この領域の多数の軸索が12歳、13歳、14歳、15歳でミリン化され、典型的で薄い脳スライスでも組織が光学的に密で隠れたニューロンを作り出すにつれて、パッチ適用はますます困難になります。私たちの目標は、インビボ録音の回路接続性に似ていますが、脳スライスの視覚的にガイドされたパッチクランプ電気生理学の高スループットと高解像度の記録能力を備えたインビトロ製剤を作成することです。
私たちの研究室では、MOCニューロンを含む聴覚系のニューロンの生理学を調査しています。これらのコリン作動性ニューロンは、外毛細胞(OHCs)16、17、18、19、20の活性を調節することによって、内毛にフィードバックを提供する。以前の研究では、この変調は、21、22、23、24、25、26および音響外傷から27、28、29、30、31、32、33からの保護における利得制御の役割を果たしていることを示している。マウスにおいて、MOCニューロンは、聴覚脳幹1の台形体(VNTB)の腹側核に拡散的に位置する。我々のグループは、TdTomatoレポーターマウスラインと交差するChAT-IRES-Creマウスラインを利用して、エピ蛍光照明下の脳幹スライス中のMOCニューロンを標的にしました。MOCニューロンは、立ち上がる台形体のイプシラテラ内側核(MNTB)から、逆側内頭核(CN)34、35、36、37、38の球状ふさふさ細胞(GBC)からの軸索によって、アッフェレント阻害性入力を受け取っていることを示した。さらに、MOCニューロンは、反側CN39、40、41のT-ステラート細胞から興奮性入力を受け取る可能性が高い。これらの研究は、MOCニューロンが同じ(対側)耳に由来する興奮性および阻害性入力の両方を受け取る。しかし、シナプス前ニューロンとMOCニューロンに収束する軸索は、典型的なコロナスライス調製物で完全に無傷であるほど互いに近くはない。MOCニューロンへのシナプス入力の統合が、新たに説明された阻害に焦点を当てて、その作用電位の発火パターンにどのような影響を与えるかを調べるため、可能な限り生理学的に現実的な方法で、インビトロ脳スライス実験の技術的利点を持つ、片耳からMOCニューロンに多様な異なるアファレントを刺激できる製剤を開発しました。
ウェッジスライスは、MOCニューロンの回路統合の調査のために設計された修正された厚いスライス調製物です(図1Aでスキーマ化)。スライスの厚い側には、末端の神経とシナプスから脳幹に入ると、内神経(以下「聴神経根」と呼ばれる)の切断された軸索が含まれています。聴覚神経根は、神経伝達物質放出を誘発し、完全に無傷のCN42、43、44、45、46の細胞のシナプス活性化を誘発するように電気的に刺激することができる。この刺激形式には、回路解析にはいくつかの利点があります。まず、MOCニューロンに対して発泡性の入力を提供するT-stellateおよびGBC軸索を直接刺激するのではなく、ANを刺激して、CNに豊富な固有回路の活性化を可能にします。これらの回路は、MOCニューロン46、47、48、49、50、51を含む脳全体の目標にCNニューロンの出力を調節する。第二に、ANからMOCニューロンのCN上流を通るアッフェラプス回路の多シナプス活性化は、聴覚刺激中に生体内で起こるように、より自然な活性化タイミングと可塑性がこれらのシナプスで起こることを可能にする。第三に、AN活動を模倣するために刺激パターンを変えることができます。最後に、MOCニューロンに対する興奮性および阻害的なモノラル投影は、ウェッジスライス内でそのままであり、その統合はパッチクランプ電気生理学の精度を有するMOCニューロンで測定することができる。全体として、この活性化スキームは、典型的な脳スライス調製物と比較してMOCニューロンに、より無傷の回路を提供する。この脳幹のくさびのスライスはまた、横方優れたオリーブ、優れたオリバリー核および内側優れたオリーブ10、11、52、53、54、55、56を含むイプシララルMNTBから阻害的な入力を受ける他の聴覚領域を調査するために使用することができる。当社の具体的な準備を超えて、このスライス法は、長距離入力の接続性を維持し、さまざまな単一細胞分解能電気生理学またはイメージング技術のためのニューロンの視覚化を改善するという利点を持つ他のシステムを評価するために使用または変更することができます。
このプロトコルは、約15°傾けることができるビブラートの段階またはプラットフォームの使用を必要とします。ここでは、市販の2ピース磁気ステージを使用し、「ステージ」は凹型磁気「ステージベース」に配置された湾曲した底を持つ金属ディスクです。ステージをシフトしてスライス角度を調整できます。ステージベースの同心円は、再現的に角度を推定するために使用されます。ステージとステージベースは、磁気ステージベースも回転させることができるスライスチャンバーに配置されます。
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Protocol
すべての実験手順は、国立神経疾患研究所と脳卒中/国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所動物のケアと使用委員会によって承認されました。
1. 実験準備
注:スライス液、スライス温度、スライスインキュベーション温度、装置(など)を含むスライス調製物に関する詳細は、本実験で行う脳幹製剤に特有のものです。スライスインキュベーションの詳細は、実験室での経験ごとに変更することができます。
- パッチクランプ用の内部ソリューションを準備します。
- (mM)76 Cs-メタンスルホン酸、56 Cs-メタンスルホン酸、56 CsCl、1 MgCl2、1CaCl2、10HEPES、10 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、5 Na2-ホスホクレアチン、5 QX-314、および0.01アレクサフルオール-48ヒドラズを含む準備用クランプ溶液。CsOH で pH を 7.2 に調整します。
- (mM)125 K-グルコン酸塩、5 KCl、1 MgCl 2、0.1 CaCl2、10HEPES、1 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、1 Na2-ホスホクレアチン、および0.01アレクサフッ素-4888ヒドラズ化を含む電流クランプ溶液を準備します。KOH で pH を 7.2 に調整します。
- 寒天4gを100mL熱い(沸騰寸前)水に加えて、4%寒天の100mLを準備します。加熱撹拌プレートに置き、温度を維持し、完全に溶解するまでかき混ぜます。約1センチの深さに100ミリメートルプラスチックペトリ皿に注ぎ、冷却してみましょう。必要になるまで冷蔵します。
- mMに含まれる1 L人工脳脊髄液(ACSF)を調製:124 NaCl、1.2 CaCl 2、1.3 MgSO4、5KCl、26 NaHCO3、1.25KH2PO4、および10デキストロース。カルボーゲン(5%CO2 / 95%O2)を10分以上のバブルで、必要に応じて1 M NaOHで最終pHを7.4に調整します。実験中にカルボーゲンと連続してバブリングすることにより、溶液の酸素化とpHを維持します。
- ACSFに1 mMキヌレン酸を加えて200 mLのスライス溶液を準備します。キヌレニック酸が溶解するまで10分間の超音波水浴中のソニッケート溶液。カルボゲンで連続して泡立ち、氷の上に置きます。
注意:キヌレン酸を取り扱う際には、適切な個人用保護具を使用してください。 - 製造元の指示に従って、ビブラートの中に適切なブレードを取り付けます。氷で囲んでビブラートメスライスチャンバーを冷やします。
2. 刺激のための無傷の聴覚神経根を伴う脳除去
注:これらの実験のためのマウスは、TdTomatoレポーターマウス(Ai14)とC57BL / 6JバックグラウンドでChAT-IRES-Creトランスジェニックマウスを横断することによって得られた。病態および電気生理学に用いられるマウスは、マウスのP12の周りにある聴聞後発症(P14-P23)であった。このマウスライン57では、トラベゾイド体の腹側核(VNTB)にtdTomatoを発現するニューロンがMOCニューロンとして以前に特徴付けられてきた。
- 安楽死(例えば、CO2 窒息)と承認された制度的処置を使用して動物の首を切る。
- カミソリの刃を使用して、頭蓋骨の中線の皮膚を鼻から首の後ろに切ります。皮をむいて頭蓋骨を露出させます。
- 小さいはさみを使用して、頭蓋骨の基部(脊髄付近の尾端)から始まり、鼻に向かって続く中線を通して頭蓋骨の切開を行います。
- ラムダ縫合糸では、正中線から頭蓋骨を切り取り、両側の耳に向かって横方向に切り傷を付けます。頭蓋骨を剥がして脳を露出させる。
- ロストラルの端から始めて、小さなラボヘラまたは鈍い鉗子で頭蓋骨から脳をそっと持ち上げます。視神経を切り、脳を後方に穏やかに働き続け、腹側表面を露出させる。
- 脳幹の腹側表面付近で細かい鉗子でつまんで三叉神経を切る。
注:前庭の神経はこのすぐ下にあり、最終的な刺激のためにそのままである必要がありますので、これを慎重に行ってください。 - 冷たいスライス溶液で満たされたガラスペトリ皿に準備を入れます。皿を解剖顕微鏡の下に置きます。カルボーゲンでやさしく泡立つ。
- 脳幹に近い顔面神経をトリミングし、前庭神経を露出させます.
- 細かい鉗子を使用して、前庭神経が頭蓋骨を可能な限り出る前庭に先端を押し込み、神経をつまんでそれを切断し、神経根を脳幹に取り付けたままにします。反対側でこれを繰り返します。
- 両方の神経根が解放されたら、台形の体の近くの脳幹の腹側表面から髄膜および血管系を取り除きます。
- 残りの脳神経をつまみ、可能であれば残りの脊髄を維持するために注意を払って結合組織をつまんで頭蓋骨から脳を完全に解放する。
3. ステージ上の脳をブロックし、マウント (磁気ディスク)
- 視性チアズムのレベルで脳をブロックすることによって、ステージに固定する脳の表面を準備します。
- 腹側の表面を上にして、鈍いツールを使用して脳を安定させ、次のステップで脳が傾かないように脊髄を穏やかに固定化します。
- 視性耳盛りのレベルでは、オープン鉗子を使用して、脳を通して皿の底まで挿入することによって脳を遮断するための平面を作成します。先端が脳の尾部の表面を視キアズムに出るように、垂直から約20°の角度で鉗子を挿入します。
- カミソリの刃を使用して鉗子に沿ってカットします。
- ステージの表面に脳を接着します。
- 脳を支える小さなブロック(約1cm3)の4%寒天を準備します。
- ステージ上に接着剤の小さな滴を置き、脳と寒天ブロックの両方を接着できるように長方形に広げます。
- 鉗子を使用して、慎重に脳を持ち上げ、ペーパータオルの端を使用して余分な液体を穏やかに手を出します。ブロックされた表面を接着剤の上に置くと、腹側の表面はスライス中にブレードの方になります。
- 寒天ブロックを脳の後ろ面にそっと押し付けて、スライス中にそれを支え、適切な脳の位置(すなわち角度)を確保します。
4.スライス脳は、ウェッジスライスを作成します
注:厚い側に内痛神経根があり、内側オリボコクレア(MOC)ニューロンと台形体の内側核(MNTB)が薄い側にあるビブラートームを使用して脳スライスを準備します。
- 脳を取り付けた磁気ディスクをステージベースに置き、ブレードに向けて脳の腹側表面を持つスライスチャンバーに置きます。
- チャンバーに氷冷スライス液と気泡をカルボゲンで充填します。
- ブレードを溶液に下げ、スライスが対称であることを確認するために、関心のある領域にスライスをカットします。スライスが非対称に見える場合は、ステージを少し傾けて対称性を得ます。
注:0.05〜0.10 mm/s間のブレード速度は、健康なスライスを切断するのに有効であり、動物の年齢や脳領域によって異なる場合があります。 - スライスが対称になったら、ステージを15°(ステージベースの約3つの同心円状リングに対応)を片側に移動します。
注:スライスに保存したい聴覚神経根からステージを離します。 - 聴覚神経根が片側の表面に近づくまで慎重にスライスを続け、顔面神経が反対側の表面に見える。
- ステージを元の位置に 15° 戻します。
- ブレードをティッシュから離れ、ステージベースを90°回転させ、薄い側の横端がブレードに向かるようにします。ブレードを数百ミクロン下げし、ゆっくりと刃を組織の端に近づけます。刃が横端に触れるまでこれを繰り返します。ブレードをスライスの薄いエッジの所望の厚さに下げ、ここでさらに200ミクロンを下げます。
注:得られたスライスは、パッチクランプが行われる側の台形体(VNTB)の腹側核のレベルで300mmの厚さを理想的にしています。 - ブレードを組織から離して戻し、ステージベースを後ろに回転させ、腹側表面が向き合う。
- ウェッジスライスのロストラルサーフェスを指定するカットを行います。スライスをインターフェイスペーパー(1 cm2)の表面に移します。スライスをインキュベーションチャンバーまたは他の適切なインキュベーション装置に移動して回収(35°Cで30分)
注: 顔面神経は、鼻の表面のスライスの両半球に表示される必要があります( 図1Bを参照)。
5. 電気生理学のセットアップと記録
- ウェッジスライスを記録チャンバーに置き、ハープまたは安定化システムでスライスを固定します。7-10 mL/minの速度で組織を継続的に浸透させ、暖かい(35°C)のACSFをカルボーゲンで泡立たします。
- パッチクランプ記録用に561 nmのエミッションフィルタを使用して、VNTBの遺伝的に標識されたMOCニューロンを同定します。パッチ可能なセルがない場合は、スライスを反転します。
- DIC視を使用して、スライスの厚い側の聴覚神経根に焦点を当て、マイクロマニピュレータを使用して双極タングステン刺激電極を聴覚神経根に下に移動させ、組織の表面にそっと移動させます。
メモ:吸引電極は、他の研究室での聴覚神経刺激実験で使用されています。他の特定の製剤に適用可能であれば、Thetaガラス電極、または光学的刺激方法を採用することができる。 - ビューのフィールドを VNTB に戻して、パッチクランプ電気生理学の対象となる MOC ニューロンを選択します。
- 提案された実験に適した内部溶液で記録ピペットを充填します。
- 全細胞構成におけるMOCニューロンからのパッチおよび記録。必要に応じて、膜容量と直列抵抗を補償します。
- 聴覚神経根の電気刺激振幅を調整して、MOCニューロン内で一貫した昼寝イベントを得る。
メモ:刺激電極を動かす必要があるかもしれません。 - MOC(電圧クランプ)またはアクション電位パターン(電流クランプ)で起こされるシナプス電流を観察するために適切な刺激プロトコルを実行します。
注:ウェッジスライスの調製は、緩いパッチ記録、薬理学、光遺伝学、カルシウムイメージング、神経伝達物質の非老化などの典型的なパッチクランプツールで使用することができます。
6. 脳幹核の組織学的確認
注:これは固定された、再セクションのくさびのスライスで、クレシルバイオレット染色で行われます。この方法はスライスに含まれている核の視覚化を可能にする。
- ウェッジスライスを調製した後、一晩固定剤(PBSで4%PFA)でスライスを水没させます。PBSでスライス3倍を10分間リンスし(シェーカーの室温)、PBSで一晩30%スクロースを4°Cでかけ、凍結保護します。
- 凍結マイクロトーム(40-70 mm)でスライスを再切り離し、PBSの24ウェルプレートにシリアルセクションを収集します。
- ゼラチンコーティングスライドにセクションをマウントし、完全に乾燥させます。スライドをスライドキャリッジに配置します。
- クレシルバイオレット溶液を準備する
- 500 mL dH2Oに5gのクレシルバイオレットアセテートを混合して1%クレシルバイオレットアセテートを調製
- まず90 mL溶液A(540 mL氷酢酸+ 89.46 mL dH2O)および10 mL溶液B(10 mLdH2Oで136mg酢酸ナトリウム)を調製して酢酸緩衝液を調製した。アセテートバッファーを生成する溶液 A と溶液 B を組み合わせます。
- 酢酸緩衝液中に0.5%クレシルバイオレットの1%クレシルバイオレットを酢酸バッファーと1%クレシルバイオレットを組み合わせます。使用前にフィルタします。
- 適切なdH2Oの100%エタノールを希釈することにより、95%と70%エタノールを調製
- クレシルバイオレット染色プロトコルを実行します。スライドキャリッジをソリューショントレイを通して移動し、ペーパータオルに余分な溶液を吸い込みます: xylene – 5分;95% エタノール – 3 分;70% エタノール – 3 分;dH2O – 3分;0.5% クレシルバイオレット溶液 – 8-14 分の頻繁に核染色が濃紫色になるまで監視;dH2O – 3分;70% エタノール – 3 分;95% エタノール – 1-2 分;100%エタノール - ディップスライド2回;キシレン – 5分;キシレン:取付が行われるまで25分。
注意:ヒュームフードの下でのみキシレンを使用してください。 - 一度に1つずつキシレンからスライドを取り外し、すぐに取り付け媒体を使用してスライドにカバースリップを置きます。取り付け媒体を乾燥させます(一晩)。
- 画像セクション。
7. 生きている、固定されていない組織の軸索の前向きのトレースのためのバイオシチンの標識
- 上記のようにウェッジスライスを準備します(ステップ2-4)。
- スライスをインターフェイス用紙に転送します(〜1 cm2)。解剖顕微鏡の下で、スライスの厚い側にCNを見つけます。
- ティッシュペーパーの角をひねって、組織から ACSF を引き離して、スライスの周囲の領域から余分な ACSF を慎重に取り除きます。これは、CN外の細胞への取り込みにつながる可能性のあるスライスの周囲の領域に広がるバイオシチンを防ぎます.
- 微細な鉗子で、バイオシチンの小さい結晶を選び、CNの表面に置く。水晶を組織にそっと押し込んで、ニューロンとの接触とその後のソマタへの取り込みを促進します。このステップを繰り返して、目的の領域(この場合はT-ステラートおよびGBCニューロンを含むCN領域)をカバーする。
- スライスをインキュベーションチャンバーに置きます。35°Cで2〜4時間インキュベートし、バイオシチンの取り込みと輸送を可能にします。インキュベーション後、ACSFでスライスをすすいで、バイオシチン粒子を除去します。
- スライスを固定剤(PBSで4%PFA)に一晩入れます。PBSで10分間3倍のリンス。
- PBSで一晩4°Cまたはスライスが沈むまで30%スクロースでスライスをクライオプロテクト。
- 70-100 mmで凍結マイクロトーム上の横断切片を生成するために組織を切除します。
- 蛍光結合ストレプトアビジンを用いた標準的な免疫組織化学的方法を用いたプロセス組織。
注:回路ビジュアライゼーションに重要なシナプス前細胞体、軸索、受容体、またはその他のシナプス分子の標識に役立つ場合は、追加の免疫組織化学をセクションで行うことができます(すなわち、一次抗体ステップはバイオシチン二次可視化に悪影響を及ぼすべきではありません)。 - 組織を画像化します。
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Representative Results
ウェッジスライスの組織学的検査
聴覚脳幹ニューロン機能の調査のために、ウェッジスライス製剤は、記録対象のMOCニューロンに対する聴覚神経根およびCN反局面を含むように設計された(図1Bに示すスライスの例)。最初の組織学的検査は、スライスが回路活性化に必要な核を含み、軸索突起がそのままであることを確認するために重要である。CN内の2つの細胞タイプは、MOCニューロンに音情報を提供する。T-ステレート細胞は、MOCニューロン39、40、41、58に興奮性入力を提供するために仮説を立てる。球状ふさふさした細胞(GBC)は、逆半球のMNTBニューロンを励起する(保持シナプスの特殊なcalyxを介して)34、36、37、38、59、60であり、MOCニューロン57に阻害的な入力を提供する(図1A)。T-ステラート細胞とGBCの両方の存在を確認するために、4%PFAの水中で固定されたウェッジスライス(50μm)を再切開し、ソマタにラベルを付けるためにクレシルバイオレット染色を行った。くさびスライスの厚い側(図2、左半球)において、CNはほぼ完全なロストロ・コーダルの範囲に存在していた。さらに、CNの側側および腹側の細分化はそのままであった(図2;S19の矢印と矢頭)。T-星状ニューロンおよびGBCは、腹神経(図2;S17の矢印)がCN61、62、63、64、65に入る腹側人工内核の中に集結する。ウェッジスライスには、記録が行われるMNTBイプシララルからMOCニューロンまでのニューロンも含まれています(元のウェッジスライスの薄い半球、図2の右側)。これは、MOCニューロンへの阻害入力の少なくとも一部がそのままであることを確認する(図2、スライス1-15、S11の破線楕円で強調)。
別の実験では、CNニューロンの軸索およびシナプス前末端がビオシチンによる前向き標識を用いたウェッジスライスにそのままであることを確認した。まず、ライブウェッジスライスを用意し、インターフェイスペーパーに配置しました。ウェッジスライスを調製した直後に、インキュベーション期間中に軸索に沿って取り込みおよび前向きの輸送を可能にするCNにバイオシチン結晶を配置した。次いで組織(70mm切片)の固定・再切除を行った。蛍光標識ストレプトアビジンを用いた切片の染色を行い、バイオシチンで標識された軸索を可視化した。これらのセクションの共焦点画像は、結晶が配置され、細胞体に取り込まれたCN内の明るい標識を示しています(図3A、左半球、破線領域)。腹側音響線素に沿ってCNを出る軸索(図3A、白い矢印)は明確に標識され、その終端点に従うことができる。生体細胞陽性の逆側MOCニューロンを取り囲むプンクターは、我々の調製がCNに由来するシナプス接触を保存していることを示唆している(図3B)。同様に、反側MNTBで保持されるラベル付きのカリセスは、GBCからMNTBニューロンに投影される軸索がウェッジスライスに保存されていることを示す(図3C)。これらの組織学的検査では、ウェッジスライスにMOCニューロンへのアフェレント入力回路の細胞体と軸索投影の両方が含まれていることが確認されており、したがって、聴覚神経の刺激とその後の上昇回路による活動の伝播によって誘発されるポストナプティクス応答を測定することができます。
ウェッジスライスにおけるシナプス生理学
興奮性および阻害性シナプス入力の統合は、神経活動を極めて形成する。我々は最近、MNTB57のニューロンからのMOCニューロンへの抑制的な入力について述べたが、MOCニューロン活性に対するこれらの入力と興奮性入力の統合の効果は不明である。ChAT-IRES-Cre x tdTomatoマウスのウェッジスライスでは、MOCニューロンから電圧クランプ記録が行われました。電流は、シナプス前軸索からの神経伝達物質放出を呼び起こすために刺激絶縁ユニットによって駆動される双極性タングステン刺激電極を介して適用された。まず、正中線の腹側音響線素(VAS)を電気的に刺激し、T-ステラート軸索を直接活性化し、MNTBニューロンをGBC軸索刺激(図4A)を介して活性化し、典型的な薄いスライス実験を模倣した記録構成におけるシナプス後応答までの遅延を測定する(図4B)、例えば痕跡、灰色、保持電位-60mV。別の実験では、聴覚神経根を刺激してモノラル上昇回路を活性化し、シナプス後応答を上記のようにMOCニューロンで測定した。どちらの場所でも電気刺激は、高速電気的人工物に続いて、多ピーク電流応答を呼び起こした( 図4CのAN刺激からの応答の例、黒い痕跡、電位-60 mVを保持)。VASの直接刺激で誘発された最初のポストナプティック電流(PSC)の発症遅延測定と聴覚神経刺激で誘発されるものとを比較し、AN刺激イベントに対する有意に長い待ち時間を発見した。これは、AN/CNシナプス(AN刺激:5.27±0.43ms、中央値±中央値絶対偏差(MAD)、範囲4.26-5.93 ms、n = 8;VAS刺激:1.98±0.28 ms、MAD±中央値、範囲0.75-3.46 ms、n = 17;ウィルコクソン署名ランクテスト 、p = 0.014、 図4D)。これらの結果は、聴覚神経根の刺激がCNニューロンのシナプス活性化とその後の回路活動をもたらし、T-ステラートまたはGBC/MNTB軸索の直接刺激よりもタイミングと同様に、生体内でより密接に表現することを確認した。
セシウムベースでは、電圧クランプ、興奮性(グルタミン酸)および阻害(GABAおよびグリシン作動性)PSCに使用される高[Cl-]内部溶液は、両方とも静止膜電位(-60 mV)で内側にあり、したがって区別できません。AN刺激構成での回路活性を呼び起こしながら、保持電位を0mVにシフトすることで推定阻害入力を電気的に単離し、AMPA媒介性グルタミン酸電流に対する近似逆転電位を有する。このニューロンの例では、外向きの電流応答は、塩化物伝導を示す0 mV(図4Ci、赤色の痕跡)で観察された。これらは、GABA である可能性があります- またはグリシン作動性シナプス応答.これらのデータは、その後のアフェレンス回路の活性化と聴覚神経根を刺激することによってMOCニューロンへの興奮性および抑制性入力の両方を活性化するウェッジスライスの有用性を示す。さらに、AN刺激によってシナプス後応答の多様なパターンが誘発され、AN軸索の同一刺激の条件下でも、回路全体の活性が動的かつ複雑であることを示唆している。この実験的パラダイムは、複雑な聴覚刺激が脳幹を通って伝達し、MOCニューロンに統合する方法の詳細な分析を可能にし、MOCエフェレントシステムの出力と最終的な人工内在への影響を決定する。
図 1: ウェッジスライスの回路図とサンプル画像(A)内側オリボコクリア帰還回路の概略図。青色の矢印は、MOCニューロンへのアフェレント上昇経路を示し、黒矢印はMOCニューロンから外毛細胞の基部(OHC)への降下フィードバック経路を示す。(B) 厚い側に聴覚神経根(ANR)と人工内核(破線の輪郭)のラベルが付いたウェッジスライスのブライトフィールド画像。アスタリスクは、MOCニューロンがウェッジスライスの薄い側のパッチクランプを対象とする台形体の腹側核のおおよその位置を示します。黒い破線は、ロストラル表面のスライスの両半球で見ることができる顔面神経を示す。IHC-内毛細胞、GBC-球状ふさふさ細胞、SPN-優れたパラオリフリー核、MNTB -台形体の内側核、VNTB -台形体の腹側核、LSO - 優れたオリーブ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:50μmで再切除したウェッジスライスのクレシルバイオレット染色切片。他のすべてのセクションが画像化されました。セクションには、ロストラル --> caudal という番号が付けられています。ウェッジスライスは、側頭CN(S19の矢印)と腹側CN(S19の矢印頭)、聴覚神経根(S17の開いた矢印頭)、MNTBの大部分(S3-S15の腹側表面付近の暗い領域)を含む人工内核(CN)全体を含む傾向があった。スケールバーのDとVは、スライスの向きでの側側と腹側を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:逆側の人工内核からのMOCニューロンへの昇順入力の軸索は、ウェッジスライス内にそのまま残っている。(A)P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato(赤蛍光)マウスから採取した、バイオシチンの可視化のために再切り離し、処理した最もくさびのスライスから、最もローストラルセクション。共焦点イメージはタイル張りの最大強度投影 z スタックです。腹側音響線の軸索は白い矢頭で強調される。破線のアウトラインは、この低孔最もスライスに残っている人工内核の小さな部分を示しています。スケールバー 500 μm(B) 周囲のニューロピルにビオシチン陽性プンクタを有する VNTB の ChAT-IRES-Cre x tdTomato 陽性ニューロンの共焦点像。スケールバー50μm(C)ビオシチン標識軸索は、正中線を通過し、コントラショナルMNTBで終了を開催のカリセスとして示した。縦の破線は、スライスの中線を表します。スケールバー 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:電圧クランプ中の不断入力の電気刺激は、MOCニューロンにおける多ピークポストナプティクス電流をもたらす。(A)腹側音響線素(VAS)刺激(灰色刺激電極)と聴覚神経(AN)刺激(黒刺激電極)の両方の記録設定を用いたウェッジスライスの模式図(黒色刺激電極)をMOCに対する(B) -60 mVで、中間線付近で単一の電気刺激を伴って誘発された個々のP17ニューロンからのポストナプティック電流(PSC)の例。(C) P15ニューロンで-60 mVでのAN刺激中に呼び起こされるPSC。(Ci)0 mV保持電位で呼び起こされるCと同じセル内のPSC例(記録設定におけるAMPA媒介電流の近似反転電位、赤)。(D) VAS および AN 刺激の最初の PSC への遅延を定量化するための母集団データ。ボックス:四分位数、ラインインセット:中央値、正方形の差込み:平均、ウィスカー:中央値絶対偏差。* p < 0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するスライス手順は、ウェッジスライスと呼ばれ、無傷のシナプス前神経回路を維持するために強力であるが、神経機能の分析のための脳スライス実験のアクセシビリティを有する。回路解析の準備の有用性を最大限に高めるためには、いくつかの初期ステップで細心の注意を払う必要があります。ウェッジの寸法は、シナプス前核とその軸索突起の両方が準備されたウェッジスライス内に含まれていることを確認するために不可欠である組織学的検査を使用して確認する必要があります。投影が切断された場合や、ターゲット核に到達する軸索の数が少ない場合、スライスジオメトリは修正を必要とする場合があります。より一般的には、ウェッジスライスのビブラートメの仕上げカットは非常に重要です。最適なウェッジスライスの準備は、既知の脳のランドマークに基づく設定の調整と共に、ステージベース上の同心円マーキングの使用を含むビブラートーム構成の一貫した使用の組み合わせを必要とします。スライス幾何学の最適化後、18個のウェッジスライスのうち8個で聴覚神経根を電気的に刺激することによって誘発されるMOCニューロンの一貫したPSCを記録した。これまでの研究では、MOCニューロン57の約60%でMNTB軸索の直接刺激を通じて阻害性PSCを呼び起こすことができたが、ここでの成功率は、多シナプス回路活性化のための入力と必要性の長い範囲を考えると、わずかな減少に過ぎないことを示唆している。スライスを準備する場合、不完全または回路接続性がない使用できない部分よりも厚いスライスが好ましいため、厚い側に誤りを犯すことをお勧めします。任意のスライス構成または寸法は、スライスが記録顕微鏡目的の下に収まる限り、パッチおよび刺激電極(または他のプローブまたは機器)によってアクセス可能であり、関心のあるポストナプティックセルでの光学ベースのパッチクランプに十分薄い。迅速で穏やかな解剖と適切なインキュベーションおよび回復条件も、パッチクランプ実験のための回路の実行可能性を維持するために重要である。私たちの聴覚脳幹製剤に特異的に、脳は無傷で機能的な聴覚神経根を維持するために頭蓋骨から非常に慎重に取り除かれなければならない。神経を伸ばしたり引き裂いたりすると、繊維を刺激し、聴覚神経細胞の活動を引き出す能力に影響を与えます。スライス中の組織の量が多いため、従来のスライス溶液、温度、インキュベーションの詳細、および灌流システムの修飾は、スライスの健康を改善する可能性があります。ここでは、通常のスライスの準備にわずかな変更を採用しています。これらは、短い回収インキュベーション時間(30分対60分)およびスライスチャンバー灌流システムにおけるより速い流量を含む。
スライス寸法とインキュベーションの詳細が決定されたら、スライス内の回路の異なるコンポーネントの機能と接続性を実証する必要があります。我々の調製では、T-ステラートとGBC(MNTB経由)を有する人工内核に由来すると仮定される興奮性および抑制性入力の両方が期待通りに存在することを保証する。聴覚神経用の吸引電極などの代替刺激方法、または光遺伝学や神経伝達物質の非増殖などの光学刺激方法は、細胞サブタイプの遺伝的標的化と組み合わせたときに回路活性化を増加させたり、細胞型特異的活性化を可能にしたりする。
このスライス方法は、多くのシステムや回路に役立つことを望みますが、標準的な薄いスライスセクションの制限の一部もこの準備に関連しています。一般的に、軸索が切断される可能性が高いため、平面投影パターンが少ない回路を保存することは困難な場合があります。ここで聴覚入力を模倣するためにここで行われるように、頭蓋神経で回路を活性化することは、多くの回路では実現不可能である可能性があります。他のスライス製剤と同様に、薬理学のネットワーク効果を考慮する必要があります。例えば、グルタミン酸受容体遮断薬を分離するグルタミン酸受容体遮断薬の浴用途は、グルタミン酸がパッチを当てた標的ニューロンの上流のニューロンの活性化に必要な場合に、多シナプス回路活性化と併用できない。これは、AN/CNおよびGBC/MNTBシナプスの両方がグルタミン酸作動性であるため、グルタミン酸受容体遮断薬の浴適用を伴うMOCニューロンですべての伝達が排除されるため、この場合に当てはまります。さらに, MNTB-MOC シナプス応答を排除する GABA またはグリシン受容体ブロッカーの適用は、MOC ニューロンへの発泡入力のパターンを形成する可能性がある CN 内の固有の抑制性の接続性を排除する意図しない結果を持つことになります。.受容体遮断薬の焦点適用は、圧力放出またはイオントフォアシスを有し、薬理学的機能を制限するために使用することができる。
最後に、これの主な制限、および何らかのインビトロ技術は、この調製がモノラル上昇聴覚回路の活性化を最大化するが、刺激をコードする末梢受容体を含む神経系の残りの部分は存在しないものである。これには、内耳自体、他の耳66からの興奮性入力、コミュラルCN接続67、68、69、70、および下皮71、72、73、74およびコレクラ75、76突起および変調入力77、78、79、80がCNおよびSOCの活性に影響を与えることを知っている。 下降IC投影の一部が維持される可能性がありますが、スライス幾何学による皮質投影と共尖的なCN投影の両方を含むことが不可能です。そこで、現在の実験で、内江からの昇順聴覚回路に焦点を当てています。薄い側のスライスの最小厚さも、双発性多シナプス回路解析を行う能力を低下させ、これは対称厚いスライス調製物10,11の利点である。また、音で聴覚神経を刺激して、自然な回路活動パターンを呼び起こすことができません。聴覚神経の応答は、アトノ局所的に変化し、ジッタリ、およびプラスチック81、82、83、84であり、電気刺激法で完全にシミュレートすることは困難です。これは、聴覚システムにおけるインビトロ実験の大きな欠点です。AN根全体を刺激すると、TONOTOPIC勾配を横切るAN繊維のスパイクが引き起こされるため、刺激のトノトピック制限は不可能です。電気刺激パターンに対するAN繊維応答の多様性(すなわち、低い対高い自発的速度の繊維)を正確に模倣することも不可能である。また、CNでの複数のAN繊維の動的強度符号化を正確に一致させるのも困難である。しかし、電気刺激プロトコル間の刺激周波数を変化させることで、電気的刺激の異なる刺激(短い、大きな音、静かな、長時間の音やバックグラウンドノイズの音など)の間で適切な聴覚神経の出力を模倣することを目的とした様々な刺激パターンを生成するために、当社の電気生理学ソフトウェアを使用することができます。これらの実験中にMOC出力を監視すると、MOCニューロンの阻害または興奮を好む刺激パターンに関する仮説をテストします。
上述の制限にもかかわらず、ウェッジスライス調製方法は、生体内および典型的なインビトロスライス生理学方法と比較して利点があり、アクセスが困難な細胞のスライスで可能な限り密接にin vivo回路活性化にアプローチするために使用することができる。脳内の生体内全細胞記録は、この領域に外科的に86にアクセス困難があるため、まれであった。代わりに、スライスは、全体のモノラル上昇回路を活性化するために直接刺激される聴覚神経で始まるMOCニューロンへの昇順入力を含むように準備されました。我々は、興奮性および阻害性シナプス入力の活性化を実証し、これらの入力に対する応答は、MOCニューロンに到達するシナプス入力のタイミングに関する貴重な情報を提供する。これは、カルシウムや電圧イメージング、神経伝達物質の欠損、細胞内(パッチピペットを介して)および細胞外(入浴剤またはイオン酸泳動を介して)薬理学などの体外電気生理学ツールの大規模なレパートリーを採用できる高スループット実験のためのプラットフォームを提供します。この調製は、特に腹側脳幹において組織の厚さを増加させてぼやけるDIC光学を使用した標的ニューロンのより良い可視性のために、厚いスライス調製物に対するスループットの増加を提供すべきである。全体的に見て、この手法は in vivo メソッドに対するターゲティングとスループットの向上を提供し、従来のスライス生理学方法よりも回路解析の機会を改善します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、NIHの壁内研究プログラム、NIDCD、Z01 DC00091(CJCW)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Preparations | |||
| Agar, powder | Fisher Scientific | BP1423500 | 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning |
| AlexaFluor Hydrazide 488 | Invitrogen | A10436 | Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch |
| Analytical Balance | Geneses Scientific (Intramalls) | AV114 | Weighing chemicals |
| Double edged razor blade | Ted Pella | 121-6 | Vibratome cutting blade |
| Kynurenic acid (5g) | Sigma Aldrich | K3375-5G | Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping |
| pH Meter | Fisher Scientific (Intramalls) | 13-620-451 | Solution pH tester |
| Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556-002 | 4% Agar Prep |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific (Intramalls) | 11-500-150 | Heating for 4% Agar preparation |
| Dissection and Slicing | |||
| Biocytin | Sigma Aldrich | B4261-250MG | Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488) |
| Dissecting Microscope | Amscope | SM-1BN | For precision dissection during brain removal |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Fine forceps dissection tool |
| Economy tweezers #3 | WPI | 501976 | Forceps dissection tool |
| Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-747E | Dissection dish |
| Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) | Thomas Scientific | 1220823 | Slice incubation/biocytin application |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome for wedge slice sectioning |
| Mayo scissors | Roboz | RS-6872 | Dissection tool |
| Single-edged carbon steel blades | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-640 | Razor blade for dissection |
| Specimen disc, orienting | Leica | 14048142068 | Specialized vibratome stage for reproducible tilting |
| Spoonula | FisherSci | 14-375-10 | Dissection tool |
| Super Glue | Newegg | 15187 | Used for glueing tissue to vibratome stage |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Dissection tool |
| Electrophysiology | |||
| A1R Upright Confocal Microscope | Nikon Instruments | Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology | |
| Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Patch clamping pipette glass |
| Electrode Filler MicroFil | WPI | CMF20G | Patch electrode pipette filler |
| In-line solution heater | Warner Instruments (GSAdvantage) | SH-27B | Slice perfusion system heater |
| Multi-Micromanipulator Systems | Sutter Intruments | MPC-200 with MP285 | Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement |
| P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes | Sutter instruments | FG-P1000 | Patch clamp pipetter puller |
| Patch-clamp amplifier and Software | HEKA | EPC-10 / Patchmaster Next | Can be any amplifier/software |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC26G | Slice "bath" during recording |
| Recording Chamber Harp | Warner Instruments | 640253 | Stablizes slice during electrophysiology recording |
| Slice Incubation Chamber | Custom Build | Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing | |
| Stimulus isolation unit | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolation unit for electrophysiology |
| Syringe 60CC | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-820-11 | Electrophysiology perfusion fluid handling |
| Temperature controller | Warner Instruments (GSAdvantage) | TC-324C | Slice perfusion system temperature controller |
| Tubing 1/8 OD 1/16 ID | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-171-129 | Electrophysiology perfusion fluid handling |
| Tugsten concentric bipolar microelectrode | WPI | TM33CCINS | Stimulating electrode for electrophysiology |
| Histology | |||
| 24 well Plate | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556006 | Histology slice collection and immunostaining |
| Alexa Fluor 488 Streptavidin | Jackson Immuno labs | 016-540-084 | Secondary antibody for biocytin visualization |
| Corning Orbital Shaker | Sigma | CLS6780FP | Shaker for immunohistochemistry agitation |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich (Intramalls) | C5042-10G | Cellular stain for histology |
| Disposable Microtome Blades | Fisher Scientific | 22-210-052 | Sliding microtome blade |
| Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um | Fisher Scientific (Intramalls) | 09-740-34A | Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution |
| Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Immunohistochemistry fluorescence mounting medium |
| glass slide staining dish with rack | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-812 | Cresyl Violet staining chamber |
| Microm HM450 Sliding Microtome | ThermoFisher | 910020 | Freezing microtome for histology |
| Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-543D | Histochemistry slide cover glass |
| Permount mounting medium | Fisher Scientific | SP15-100 | Cresyl violet section mounting medium |
| Superfrost Slides | Fisher Scientific | 22-034980 | Histology slides |
References
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