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Neuroscience

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

Die Integration verschiedener synaptischer Inputs in Neuronen wird am besten in einer Zubereitung gemessen, die alle präsynaptischen Kerne für natürliches Timing und Schaltplastizität bewahrt, aber Gehirnscheiben trennen in der Regel viele Verbindungen. Wir entwickelten eine modifizierte Gehirnscheibe, um die In-vivo-Schaltungsaktivität nachzuahmen und gleichzeitig die In-vitro-Experimentierfähigkeit aufrechtzuerhalten.

Abstract

In-vitro-Scheibenelektrophysiologie-Techniken messen die einzellige Aktivität mit präziser elektrischer und zeitlicher Auflösung. Gehirnscheiben müssen relativ dünn sein, um Neuronen für Patch-Clamping oder Bildgebung richtig zu visualisieren und zugreifen, und die In-vitro-Untersuchung der Gehirnschaltung ist auf das beschränkt, was physisch in der akuten Scheibe vorhanden ist. Um die Vorteile von In-vitro-Scheibenexperimenten bei gleichzeitiger Erhaltung eines größeren Anteils präsynaptischer Kerne zu erhalten, haben wir eine neuartige Scheibenzubereitung entwickelt. Diese "Keilscheibe" wurde für Patch-Clamp-Elektrophysiologie-Aufnahmen entwickelt, um die vielfältigen monauralen, schallgetriebenen Eingänge zu medialen Olivocochlearen (MOC)-Neuronen im Hirnstamm zu charakterisieren. Diese Neuronen erhalten ihre primären afferenten erregenden und hemmenden Eingänge von Neuronen, die durch Reize im kontralateralen Ohr und entsprechenden Cochlea-Kern (CN) aktiviert werden. Es wurde eine asymmetrische Hirnscheibe entwickelt, die am dicksten in der rostro-kaudalen Domäne am seitlichen Rand einer Hemisphäre ist und dann zum seitlichen Rand der gegenüberliegenden Hemisphäre dünnt. Diese Scheibe enthält auf der dicken Seite die auditive Nervenwurzel, die Informationen über auditive Reize an das Gehirn, die intrinsische CN-Schaltung und sowohl die disynaptischen exzitattischen als auch trisynaptischen hemmenden affetiveren Bahnen, die auf kontralateralen MOC-Neuronen konvergieren, transportiert. Die Aufnahme erfolgt von MOC-Neuronen auf der dünnen Seite der Scheibe, wo sie mit DIC-Optik für typische Patch-Clamp-Experimente visualisiert werden. Die direkte Stimulation des Hörnervs wird beim Eintritt in den auditiven Hirnstamm durchgeführt, wodurch die intrinsische CN-Kreisaktivität und die synaptische Plastizität an Synapsen vor den MOC-Neuronen auftreten können. Mit dieser Technik kann man die In-vivo-Schaltungsaktivierung so nah wie möglich innerhalb der Scheibe imitieren. Diese Keilscheibenpräparation ist auf andere Gehirnkreise anwendbar, bei denen Schaltungsanalysen von der Erhaltung der vorgelagerten Konnektivität und der langfristigen Eingänge in Kombination mit den technischen Vorteilen der In-vitro-Slice-Physiologie profitieren würden.

Introduction

Die Beobachtung der Aktivität neuronaler Schaltkreise wird idealerweise mit nativen sensorischen Eingaben und Rückkopplungen sowie einer intakten Konnektivität zwischen Hirnregionen in vivo durchgeführt. Die Durchführung von Experimenten, die eine einzellige Auflösung der funktionalen Schaltkreise geben, ist jedoch immer noch durch technische Herausforderungen im intakten Gehirn begrenzt. Während in vivo extrazelluläre Elektrophysiologie oder Multiphotonen-Bildgebungsverfahren zur Untersuchung von Aktivitäten in intakten Nervensystemen eingesetzt werden können, bleibt die Interpretation, wie verschiedene Eingänge integrieren oder die subschwelligen synaptischen Eingänge zu messen, schwierig. In vivo Vollzellaufnahmen überwinden diese Einschränkungen, sind aber selbst in Leicht zugänglichen Hirnregionen anspruchsvoll. Technische Herausforderungen von Einzelzell-Auflösungsexperimenten werden in bestimmten Neuronenpopulationen, die sich tief im Gehirn befinden, oder in räumlich diffusen Populationen, die entweder genetische Werkzeuge zur Lokalisierung von Zellen in vivo (z. B. genetische Expression von Channelrhodopsin gepaart mit Optrode-Aufzeichnung) oder post-hoc-histochemische Identifizierung nach der Erfassung von Standortkennzeichnungen (z. B. mit neurotransmissionsspezifischen Markern) weiter verstärkt. Die medialen Olivocochlear-Neuronen, die sich diffus in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms befinden, leiden unter den oben genannten Einschränkungen1, was den Zugang zu In-vivo-Experimenten extrem erschwert.

Gehirn-Scheiben (100-500 m Dicke) sind seit langem verwendet worden, um Gehirn-Schaltungen zu studieren, einschließlich auditive Hirnstamm Schaltung, wegen der physischen Segregation der verbundenen Neuronen, die in der gleichen Scheibeenthaltensind 2,3,4,5,6,7,8,9. Experimente mit viel dickeren Scheiben (>1 mm) wurden in anderen Labors eingesetzt, um zu verstehen, wie sich bilaterale Inputs in Bereichen des überlegenen Olivary-Komplexes (SOC) integrieren, einschließlich der medialen überlegenen Olive10,11. Diese Scheiben wurden so hergestellt, dass Axone des Hörnervs (AN) innerhalb der Scheibe intakt blieben und elektrisch stimuliert wurden, um synaptische Neurotransmitter-Freisetzung in der CN zu initiieren, die Aktivität von Hörneuronen erster Ordnung imitiert, wie sie auf Schall reagieren würden. Ein großer Nachteil dieser dicken Scheiben ist die Sichtbarkeit von Neuronen für elektrophysiologische Aufnahmen mit Patch-Clamp ("Patching"). Patching wird immer schwieriger, da die zahlreichen Axone in diesem Bereich mit12,13,14,15Myelinatiert werden, wodurch das Gewebe auch in einer typischen, dünnen Hirnscheibe optisch dicht und verdunkelt wird. Unser Ziel ist es, In-vitro-Präparate zu entwickeln, die eher der Schaltungskonnektivität von In-vivo-Aufnahmen ähneln, aber mit den hochdurchsatz- und hochauflösenden Aufnahmefähigkeiten der visuell geführten Patch-Clamp-Elektrophysiologie in Hirnscheiben.

Unser Labor untersucht die Physiologie von Neuronen des auditiven efferenten Systems, einschließlich MOC-Neuronen. Diese cholinergen Neuronen liefern efferent Essrücke an die Cochlea durch Modulation der Aktivität der äußeren Haarzellen (OHCs)16,17,18,19,20. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Modulation eine Rolle bei der Gain-Kontrolle in der Cochlea21,22,23,24,25,26 und Schutz vor akustischen Trauma27,28,29,30,31,32,33. Bei Mäusen befinden sich MOC-Neuronen diffus im ventralen Kern des Trapezkörpers (VNTB) im auditiven Hirnstamm1. Unsere Gruppe hat die ChAT-IRES-Cre Mauslinie verwendet, die mit der tdTomato Reporter-Mauslinie gekreuzt wurde, um MOC-Neuronen in Hirnstammscheiben unter epifluoreszierender Beleuchtung anzuvisieren. Wir zeigten, dass MOC-Neuronen einen afferent hemmenden Input aus dem ipsilateralen Medialkern des Trapezkörpers (MNTB) erhalten, der wiederum durch Axone aus kugelförmigen Buschzellen (GBC) im kontralateralen Cochlea-Kern (CN)34,35,36,37,38angeregt wird. Zusätzlich erhalten MOC-Neuronen wahrscheinlich ihren exzitatorischen Input von T-Stellatzellen im kontralateralen CN39,40,41. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass MOC-Neuronen sowohl erregende als auch hemmende Eingaben erhalten, die vom gleichen (kontralateralen) Ohr abgeleitet werden. Jedoch, die präsynaptischen Neuronen, und ihre Axone konvergieren auf MOC Neuronen, sind nicht ganz nah genug aneinander, um vollständig intakt in einem typischen koronalen Scheibenpräparat zu sein. Um zu untersuchen, wie die Integration von synaptischen Inputs in MOC-Neuronen ihre Wirkungspotenziale beeinflusst, mit einem Fokus auf neu beschriebene Hemmung, entwickelten wir ein Präparat, bei dem wir die verschiedenen Afferents zu MOC-Neuronen von einem Ohr aus auf physiologisch realistische Weise stimulieren konnten, aber mit den technischen Vorteilen von In-vitro-Gehirnscheibenexperimenten.

Die Keilscheibe ist ein modifiziertes dickes Scheibenpräparat, das für die Untersuchung der Schaltungsintegration in MOC-Neuronen entwickelt wurde (schematisiert in Abbildung 1A). Auf der dicken Seite der Scheibe enthält der Keil die abgetrennten Axone des Hörnervs (nachfolgend "auditorische Nervenwurzel" genannt), wenn sie aus der Peripherie in das Hirnstamm gelangen und in der KN Synapsen synapsisch. Die auditive Nervenwurzel kann elektrisch stimuliert werden, um Neurotransmitter-Freisetzung und synaptische Aktivierung von Zellen der vollständig intakten CN42,43,44,45,46zu evozieren. Dieses Stimulationsformat hat mehrere Vorteile für die Schaltungsanalyse. Erstens stimulieren wir die AN, anstatt die Initiativ- und GBC-Axone, die einen affeten Input in die MOC-Neuronen liefern, direkt zu stimulieren, um die Aktivierung von intrinsischen Schaltkreisen zu ermöglichen, die in der CN reichlich vorhanden sind. Diese Schaltkreise modulieren die Ausgabe von CN-Neuronen zu ihren Zielen im gesamten Gehirn, einschließlich MOC-Neuronen46,47,48,49,50,51. Zweitens ermöglicht die polysynaptische Aktivierung von affemittenten Schaltkreisen vom AN über die CN vor dem CN von MOC-Neuronen ein natürlicheres Aktivierungs-Timing und eine Plastizität an diesen Synapsen, wie sie es in vivo während der auditiven Stimulation tun würden. Drittens können wir unsere Stimulationsmuster variieren, um AN-Aktivität nachzuahmen. Schließlich sind sowohl erregende als auch hemmende monaurale Projektionen auf MOC-Neuronen in der Keilscheibe intakt, und ihre Integration kann an einem MOC-Neuron mit der Präzision der Patch-Clamp-Elektrophysiologie gemessen werden. Insgesamt bietet dieses Aktivierungsschema einen intakteren Kreislauf zu den MOC-Neuronen im Vergleich zu einer typischen Gehirnscheibenpräparation. Diese Hirnstamm-Keilscheibe kann auch verwendet werden, um andere gehörive Bereiche zu untersuchen, die hemmende Inputs von ipsilateralem MNTB erhalten, einschließlich der lateralen überlegenen Olive, des überlegenen Olivary-Kerns und der medialen Superior Olive10,11,52,53,54,55,56. Über unsere spezifische Präparation hinaus kann diese Schneidemethode verwendet oder modifiziert werden, um andere Systeme zu bewerten, mit den Vorteilen der Aufrechterhaltung der Konnektivität von Langzeiteingaben und der Verbesserung der Visualisierung von Neuronen für eine Vielzahl von einzelligen Elektrophysiologie- oder Bildgebungstechniken.

Dieses Protokoll erfordert die Verwendung einer Vibram-Stufe oder Plattform, die ca. 15° geneigt werden kann. Hier verwenden wir eine handelsübliche 2-teilige magnetische Bühne, bei der die "Bühne" eine Metallscheibe mit einem gekrümmten Boden in einer konkaven magnetischen "Bühnenbasis" ist. Die Bühne kann dann verschoben werden, um den Schnittwinkel anzupassen. Konzentrische Kreise auf der Bühnenbasis werden verwendet, um den Winkel reproduzierbar abzuschätzen. Die Bühnen- und Bühnenbasis befindet sich in der Schneidkammer, wo auch die magnetische Bühnenbasis gedreht werden kann.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Experimentelle Präparate

HINWEIS: Details zur Scheibenvorbereitung einschließlich Schneidlösung, Schnitttemperatur, Inkubationstemperatur und Apparat (etc.) sind spezifisch für die Inkubation des Gehirns, die in diesem Experiment durchgeführt wird. Slice-Inkubationsdetails können pro Laborerfahrung geändert werden.

  1. Bereiten Sie interne Lösungen für die Patch-Klemmung vor.
    1. Vorbereiten von Spannungsklemmenlösung mit (in mM) 76 Cs-Methansulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatin, 5 QX-314 und 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Stellen Sie den pH-Wert mit CsOH auf 7,2 ein.
    2. Bereiten Sie aktuelle Klemmlösung mit (in mM) 125 K-Gluconat, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatin und 0.01 Alexa Fluor-488 Hydrazid vor. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein.
  2. Bereiten Sie 100 ml 4% Agar vor, indem Sie 4 g Agar zu 100 ml heißem (nahezu kochendem) Wasser hinzufügen. Auf erhitzte Rührplatte stellen, um die Temperatur zu halten und rühren, bis sie vollständig gelöst sind. In 100 mm Kunststoff-Petrischalen auf ca. 1 cm Tiefe gießen und abkühlen lassen. Kühlen, bis es gebraucht wird.
  3. Bereiten Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) in mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4und 10 dextrose vor. Blase mit Carbogen (5% CO2 / 95% O2) für mindestens 10 min, dann den letzten pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH einstellen, falls erforderlich. Erhalten Sie die Sauerstoffversorgung und den pH-Wert der Lösung, indem Sie während des Experiments kontinuierlich mit Carbogen sprudeln.
  4. Bereiten Sie 200 ml Schneidlösung vor, indem Sie ACSF 1 mM Kynurensäure hinzufügen. Beschallunglösung in einem beschallenden Wasserbad für 10 min, bis Kynurensäure gelöst ist. Kontinuierlich mit Autobogen sprudeln und auf Eis legen.
    VORSICHT: Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Kynurensäure.
  5. Montieren Sie eine geeignete Klinge im Vibratom gemäß den Anweisungen des Herstellers. Chill Vibratome Schneidkammer, indem Sie es mit Eis umgeben.

2. Hirnentfernung mit intakter Hörnerv-Wurzel zur Stimulation

HINWEIS: Mäuse für diese Experimente wurden durch Kreuzung von transgenen ChAT-IRES-Cre-Mäusen auf einem C57BL/6J-Hintergrund mit tdTomato-Reportermäusen (Ai14) gewonnen. Mäuse, die für Histologie und Elektrophysiologie verwendet wurden, waren nach hörendes Beginn (P14-P23), das bei Mäusen um P12 liegt. Neuronen, die tdTomato im ventralen Kern des Trapezkörpers (VNTB) exemiten, wurden zuvor in dieser Mauslinie57als MOC-Neuronen charakterisiert.

  1. Euthanisieren (z. B. CO2-Erstickung) und enthaupten Sie das Tier nach zugelassenen institutionellen Verfahren.
  2. Schneiden Sie die Haut an der Schädelmitte mit einer Rasierklinge von der Nase bis zum Nacken. Schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
  3. Mit einer kleinen Schere, machen Sie einen Schnitt in den Schädel durch die Mittellinie beginnend an der Basis (kaudal endes Ende in der Nähe des Rückenmarks) des Schädels und weiter in Richtung der Nase.
  4. An der Lambda-Nähte, machen Schnitte im Schädel von der Mittellinie, seitlich in Richtung des Ohres auf beiden Seiten. Schälen Sie den Schädel zurück, um das Gehirn freizulegen.
  5. Beginnend am rostralen Ende, heben Sie das Gehirn vorsichtig vom Schädel mit einem kleinen Laborspachtel oder stumpfen Zangen. Schneiden Sie den Sehnerv und arbeiten Sie das Gehirn vorsichtig nach hinten, indem Sie die ventrale Oberfläche freisetzen.
  6. Schneiden Sie die Trigeminusnerven, indem Sie sie mit feinen Zangen in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms kneifen.
    HINWEIS: Tun Sie dies sorgfältig, da der Vestibulocochlea-Nerv direkt darunter liegt und für eine eventuelle Stimulation intakt sein muss.
  7. Die Zubereitung in eine glasende Petrischale geben, die mit kalter Schneidlösung gefüllt ist. Legen Sie die Schale unter ein Sezieren des Mikroskops. Sanft mit Carbogen sprudeln.
  8. Trimmen Sie den Gesichtsnerv in der Nähe des Hirnstamms und setzen Sie den Vestibulocochlea-Nerv aus.
  9. Mit feinen Zangen schieben Sie die Spitzen in die Foramina, wo der Vestibulocochlea-Nerv den Schädel so weit wie möglich verlässt und den Nerv kneifen, um ihn zu trennen, so dass die Nervenwurzel am Hirnstamm befestigt bleibt. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite.
  10. Sobald beide Nervenwurzeln frei sind, entfernen Sie die Hirnhaut und Vaskulatur von der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in der Nähe des Trapezkörpers.
  11. Befreien Sie das Gehirn vollständig aus dem Schädel, indem Sie die verbleibenden Hirnnerven und Bindegewebe kneifen, wobei sie darauf achten, das verbleibende Rückenmark nach Möglichkeit zu erhalten.

3. Blockieren und montieren Gehirn auf der Bühne (magnetische Scheibe)

  1. Bereiten Sie die Oberfläche des Gehirns vor, um sich an der Bühne zu fixieren, indem Sie das Gehirn auf der Ebene des optischen Chiasmus blockieren.
    1. Mit der ventralen Oberfläche nach oben, stabilisieren Sie das Gehirn mit einem stumpfen Werkzeug, um das Rückenmark sanft zu immobilisieren, so dass das Gehirn während des folgenden Schritts nicht kippt.
    2. Verwenden Sie auf der Ebene des optischen Chiasmus offene Zangen, um die Ebene zur Blockierung des Gehirns zu erstellen, indem Sie durch das Gehirn bis zum Boden der Schale einfügen. Setzen Sie die Zange in einem Winkel von ca. 20° von vertikal, so dass die Spitzen verlassen die dorsale Oberfläche des Gehirns kaudal zum optischen Chiasm.
    3. Schneiden Sie entlang der Zange mit der Rasierklinge.
  2. Kleben Sie das Gehirn an die Oberfläche der Bühne.
    1. Bereiten Sie einen kleinen Block (ca. 1 cm3) von 4% Agar zur Unterstützung des Gehirns vor.
    2. Legen Sie einen kleinen Tropfen Kleber auf die Bühne und verteilen Sie ihn in ein Rechteck, damit sowohl das Gehirn als auch der Agarblock verklebt werden können.
    3. Mit Zangen, vorsichtig heben Sie das Gehirn und sanft die überschüssige Flüssigkeit mit dem Rand eines Papiertuchs zu tappen. Legen Sie die blockierte Oberfläche auf den Kleber, ventrale Oberfläche wird in Richtung der Klinge während des Schneidens sein.
    4. Drücken Sie den Agarblock sanft gegen die Rückenoberfläche des Gehirns, um ihn beim Schneiden zu unterstützen und eine korrekte Gehirnpositionierung (d. h. Winkel) zu gewährleisten.

4. Schneiden Sie Gehirn, um Keilscheibe zu erstellen

HINWEIS: Bereiten Sie eine Gehirnscheibe mit Vibratom vor, das die Cochlea-Nervenwurzel auf der dicken Seite und mediale Olivocochlear(MOC) Neuronen und den medialen Kern des Trapezkörpers (MNTB) auf der dünnen Seite hat.

  1. Legen Sie die Magnetscheibe mit angeschlossenem Gehirn auf die Bühnenbasis und legen Sie sie in die Schnittkammer mit der ventralen Oberfläche des Gehirns, die auf die Klinge ausgerichtet ist.
  2. Füllen Sie die Kammer mit eiskalten Schneidlösung und Blase mit Carbogen.
  3. Senken Sie die Klinge in die Lösung und schneiden Sie Scheiben kaudal zu dem Bereich von Interesse, um sicherzustellen, dass die Scheiben symmetrisch sind. Wenn die Scheiben asymmetrisch erscheinen, neigen Sie die Bühne leicht, um Symmetrie zu erhalten.
    HINWEIS: Klingengeschwindigkeiten zwischen 0,05-0,10 mm/s waren wirksam zum Schneiden gesunder Scheiben und können je nach Alter und Hirnregion variieren.
  4. Sobald die Scheiben symmetrisch sind, verschieben Sie die Bühne um 15° (entsprechend ca. 3 konzentrischen Ringen auf der Bühnenbasis) auf eine Seite.
    HINWEIS: Verschieben Sie die Bühne weg von der hörnerwährenden Nervenwurzel, die Sie in der Scheibe bewahren möchten.
  5. Schneiden Sie vorsichtig weiter, bis die hörnerale Nervenwurzel auf der einen Seite nahe an der Oberfläche ist und der Gesichtsnerv an der Oberfläche der anderen Seite zu sehen ist.
  6. Verschieben Sie die Bühne um 15° zurück in die ursprüngliche Position.
  7. Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg und drehen Sie die Bühnenbasis um 90°, so dass die seitliche Kante der dünnen Seite der Klinge zugewandt ist. Senken Sie die Klinge mehrere hundert Mikrometer und bringen Sie die Klinge dann langsam in die Nähe der Kante des Gewebes. Wiederholen Sie dies, bis die Klinge die seitliche Kante berührt. Senken Sie die Klinge auf die gewünschte Dicke der dünnen Kante der Scheibe, hier weitere 200 Mikrometer.
    HINWEIS: Die resultierende Scheibe ist idealerweise 300 mm dick auf der Ebene des ventralen Kerns des Trapezkörpers (VNTB) an der Seite, an der die Patchklemmung stattfindet.
  8. Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg und drehen Sie die Bühnenbasis zurück, so dass die ventrale Oberfläche ihr zugewandt ist.
  9. Machen Sie den Schnitt, der die rostrale Oberfläche der Keilscheibe bezeichnet. Übertragen Sie die Scheibe auf ein Stück Interface-Papier (1 cm2) kaudaloberfläche nach unten. Bewegen Sie die Scheibe zur Rückgewinnung in die Inkubationskammer oder andere geeignete Inkubationsvorrichtungen (30 min bei 35 °C).
    HINWEIS: Der Gesichtsnerv sollte auf beiden Hemisphären der Scheibe auf der rostralen Oberfläche sichtbar sein (siehe Abbildung 1B).

5. Elektrophysiologie-Einrichtung und -Aufzeichnung

  1. Legen Sie die Keilscheibe in die Aufnahmekammer und sichern Sie die Scheibe mit einer Harfe oder einem Stabilisierungssystem. Durchdringen Sie das Gewebe kontinuierlich mit einer Rate von 7-10 ml/min mit warmem (35 °C) ACSF blasen mit Carbogen.
  2. Identifizieren Sie genetisch markierte MOC-Neuronen im VNTB mithilfe von Epifluoreszenz mit 561 nm Emissionsfiltern für Patch-Clamp-Aufnahmen. Flip Slice, wenn keine potenziell patchfähigen Zellen vorhanden sind.
  3. Mit DIC-Optik, konzentrieren Sie sich auf die auditive Nervenwurzel auf der dicken Seite der Scheibe und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die bipolare Wolfram stimulierende Elektrode nach unten auf die auditive Nervenwurzel und sanft in die Oberfläche des Gewebes zu bewegen.
    HINWEIS: Saugelektroden wurden in auditiven Nervenstimulationsexperimenten in anderen Labors eingesetzt. Theta-Glaselektroden oder optische Stimulationsmethoden können eingesetzt werden, wenn sie auf andere spezifische Präparate anwendbar sind.
  4. Verschieben Sie das Sichtfeld zurück zum VNTB, um ein MOC-Neuron für die Patchklemmen-Elektrophysiologie auszuwählen.
  5. Füllen Sie eine Aufnahmepipette mit einer geeigneten internen Lösung für das vorgeschlagene Experiment.
  6. Patch und Aufzeichnung aus dem MOC-Neuron in der Ganzzellkonfiguration. Kompensieren Sie bei Bedarf Membrankapazität und Serienwiderstand.
  7. Passen Sie die elektrische Stimulationsamplitude der auditiven Nervenwurzel an, um konsistente postsynaptische Ereignisse im MOC-Neuron zu erhalten.
    HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Stimulationselektrode zu bewegen.
  8. Führen Sie geeignete Stimulationsprotokolle aus, um evozierte synaptische Ströme in MOC (Spannungsklemme) oder Aktionspotentialmuster (Stromklemme) zu beobachten.
    HINWEIS: Die Keilscheibenpräparation kann mit allen typischen Patch-Clamp-Tools wie Lose-Patch-Aufnahmen, Pharmakologie, Optogenetik, Kalzium-Bildgebung, Neurotransmitter-Unkaging usw. verwendet werden.

6. Histologische Bestätigung von Hirnstammkernen

HINWEIS: Dies geschieht mit Cresylviolettfärbung, in fester, neu geschnittener Keilscheibe. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Kernen, die in der Scheibe enthalten sind.

  1. Nach dem Vorbereiten einer Keilscheibe, tauchen Sie Die scheibe in fixative (4% PFA in PBS) über Nacht. Spülen Sie die Scheibe 3x für 10 min in PBS (Raumtemperatur auf einem Shaker), dann in 30% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C zum Kryoprotect legen.
  2. Schneiden Sie die Scheibe auf einem gefrierenden Mikrotom (40-70 mm) neu und sammeln Sie serielle Abschnitte in einer 24-Well-Platte in PBS.
  3. Abschnitte auf gelatinebeschichteten Dias montieren und vollständig trocknen lassen. Platzieren Sie Dias in einem Schiebewagen.
  4. Vorbereiten von Cresylviolett-Lösungen
    1. Bereiten Sie 1% Cresylviolettacetat durch Mischen von 5 g Cresylviolettacetat in 500 mL dH2O vor
    2. Vorbereiten des Acetatpuffers durch erste Vorbereitung der 90 ml Lösung A (540 ml Eisessigsäure + 89,46 ml dH2O) und 10 ml Lösung B (136 mg Natriumacetat in 10 ml dH2O). Kombinieren Sie Lösung A und Lösung B, die den Acetatpuffer ergibt.
    3. Kombinieren Sie 1% Cresylviolettacetat mit dem Acetatpuffer 1:1 für 0,5% Cresylviolett in Acetatpuffer. Filtern Sie vor der Verwendung.
    4. Herstellung von 95% und 70% Ethanol durch Verdünnung von 100% Ethanol mit entsprechenden Mengen von dH2O
  5. Führen Sie das Cresylviolett-Färbungsprotokoll durch. Bewegen Sie den Schlitten durch Lösungsschalen, blotting überschüssige Lösung auf einem Papiertuch zwischen den Schalen: Xylol – 5 min; 95% Ethanol – 3 min; 70% Ethanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% Cresylviolettlösung – 8-14 min Überwachung häufig, bis die nukleare Färbung dunkelviolett wird; dH2O – 3 min; 70% Ethanol – 3 min; 95% Ethanol – 1-2 min; 100% Ethanol – Dip gleitet zweimal; Xylol – 5 min; Xylol: 25 min bis zur Montage.
    VORSICHT: Verwenden Sie Xylole nur unter einer Dunstabzugshaube.
  6. Entfernen Sie Die syxylen nacheinander und platzieren Sie die Deckschlipse sofort mit dem Montagemedium auf den Dias. Montagemedium trocknen lassen (über Nacht).
  7. Bildabschnitte.

7. Biocytin-Kennzeichnung zur anterogragraden Rückverfolgung von Axonen in lebendem, unfixiertem Gewebe

  1. Bereiten Sie eine Keilscheibe wie oben (Schritte 2-4).
  2. Übertragen Sie die Scheibe auf Schnittstellenpapier (ca. 1 cm2). Lokalisieren Sie die CN unter einem Sezierender Mikroskop auf der dicken Seite der Scheibe.
  3. Entfernen Sie überschüssiges ACSF vorsichtig aus dem Bereich um die Scheibe, indem Sie eine Ecke eines Tissuepapiers verdrehen, um den ACSF aus dem Gewebe zu ziehen. Dadurch wird verhindert, dass sich das Biocytin in die umliegenden Bereiche der Scheibe ausbreitet, was zu einer Aufnahme in Zellen außerhalb der CN führen könnte.
  4. Mit feinen Zangen wählen Sie einen kleinen Kristall aus Biocytin und legen Sie ihn auf die Oberfläche der CN. Drücken Sie den Kristall vorsichtig in das Gewebe, um den Kontakt mit Neuronen und die anschließende Aufnahme in Somata zu fördern. Wiederholen Sie diesen Schritt, um den gewünschten Interessenbereich abzudecken, in diesem Fall CN-Regionen, die T-Stellat- und GBC-Neuronen enthalten.
  5. Legen Sie die Scheibe in eine Inkubationskammer. Lassen Sie die Scheibe für 2-4 h bei 35 °C brüten, um die Aufnahme und den Transport des Biozytins zu ermöglichen. Nach der Inkubation spülen Sie die Scheibe in ACSF, um Biozytinpartikel zu entfernen.
  6. Slice über Nacht in fixative (4% PFA in PBS) legen. 3x für 10 min in PBS abspülen.
  7. Cryoprotect-Scheibe in 30% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C oder bis die Scheibe sinkt.
  8. Resektieren Sie das Gewebe, um Querabschnitte auf einem gefrierenden Mikrotom bei 70-100 mm zu produzieren.
  9. Prozessgewebe mit standard immunhistochemischen Methoden mit einem fluoreszierend konjugierten Streptavidin.
    HINWEIS: Zusätzliche Immunhistochemie kann auf den Abschnitten durchgeführt werden, wenn hilfreich für die Etikettierung von präsynaptischen Zellkörpern, Axonen, Rezeptoren oder anderen synaptischen Molekülen, die für die Schaltungsvisualisierung wichtig sind (d. h. primäre Antikörperschritte sollten die sekundäre Visualisierung von Biozytin nicht beeinträchtigen).
  10. Bild das Gewebe.

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Representative Results

Histologische Untersuchung der Keilscheibe
Für unsere Untersuchung der auditiven Hirnstamm-Neuron-Funktion wurde das Keilscheibenpräparat entwickelt, um die auditive Nervenwurzel und CN kontralateral zu den MOC-Neuronen zu enthalten, die für Aufnahmen bestimmt sind (Beispielscheibe in Abbildung 1B). Eine erste histologische Untersuchung der Zubereitung ist wichtig, um zu bestätigen, dass die Scheibe die für die Schaltungsaktivierung notwendigen Kerne enthält und dass axonale Projektionen intakt sind. Zwei Zelltypen innerhalb des CN liefern MOC-Neuronen fundierte Informationen. T-Stellate-Zellen werden vermutet, um den exzitatorischen Input für die MOC-Neuronen39,40,41,58zu liefern. Globuläre Buschzellen (GBC) regen MNTB-Neuronen in der kontralateralen Hemisphäre an (über den spezialisierten Kalyx der Held-Synapse)34,36,37,38,59,60, die wiederum hemmende Eingaben zu MOC-Neuronen57 liefern (schematische Abbildung 1A). Um das Vorhandensein von T-Stellatzellen und GBCs zu bestätigen, haben wir eine Keilscheibe, die durch Eintauchen in 4% PFA fixiert wurde, neu geschnitten (bis 50 m) und Kresylviolettfärbung durchgeführt, um Somata zu kennzeichnen. In der dicken Seite der Keilscheibe(Abbildung 2, linke Hemisphäre) war die CN in fast ihrer vollen rostro-kaudalen Ausdehnung vorhanden. Zusätzlich waren die dorsalen und ventralen Unterteilungen der CN intakt(Abbildung 2; Pfeil und Pfeilspitze in S19). T-Stellate Neuronen und GBCs Cluster im ventralen Cochlea-Kern in der Nähe, wo der Hörnerv (Abbildung 2; Pfeil in S17) tritt die CN61,62,63,64,65. Die Keilscheibe enthält auch Neuronen des MNTB ipsilateral zu MOC Neuronen, aus denen Aufnahmen durchgeführt werden (dünne Hemisphäre der ursprünglichen Keilscheibe, rechte Seite in Abbildung 2). Dies bestätigt, dass zumindest ein Teil des hemmenden Eingangs zu MOC-Neuronen intakt ist (Abbildung 2, Scheiben 1-15, hervorgehoben durch gestrichelte Ovale in S11).

In separaten Experimenten bestätigten wir, dass die Axone und präsynaptischen Terminals von CN-Neuronen in der Keilscheibe mit anterograder Etikettierung mit Biocytin intakt waren. Zunächst wurde die lebende Keilscheibe vorbereitet und auf Schnittstellenpapier gelegt. Unmittelbar nach der Vorbereitung der Keilscheibe wurden Biocytinkristalle in die CN gegeben, die während einer Inkubationszeit aufnahme- und anterograde Transport entlang von Axonen ermöglichten. Anschließend wurde das Gewebe (70 mm Abschnitte) fixiert und neu geschnitten. Die Färbung von Abschnitten mit fluoreszierend beschriftetem Streptavidin wurde durchgeführt, um Axone zu visualisieren, die mit dem Biocytin gekennzeichnet sind. Konfokale Bilder dieser Abschnitte zeigen eine helle Beschriftung in der CN, wo die Kristalle platziert und in Zellkörper aufgenommen wurden(Abbildung 3A, linke Hemisphäre, gestrichelter Bereich). Axone, die die CN entlang der ventralen akustiken Stria verlassen(Abbildung 3A, weiße Pfeilspitzen) waren deutlich beschriftet und konnten bis zu ihren Endpunkten verfolgt werden. Biocytin-positive Punktuate, die kontralaterale MOC-Neuronen umgeben, legen nahe, dass unsere Zubereitung synaptische Kontakte aus dem CN konserviert (Abbildung 3B). Ebenso zeigen beschriftete Kalyze von Held im kontralateralen MNTB, dass Axone, die von GBCs auf MNTB-Neuronen projizieren, in der Keilscheibe erhalten bleiben (Abbildung 3C). Diese histologischen Untersuchungen bestätigen, dass unsere Keilscheibe sowohl die Zellkörper als auch axonale Projektionen der affetienten Eingangsschaltungen zu MOC-Neuronen enthält, was es uns ermöglicht, postsynaptische Reaktionen zu messen, die durch Stimulation des Hörnervs und anschließende Ausbreitung der Aktivität durch aufsteigende Schaltungausgelösten hervorgerufen werden.

Synaptische Physiologie in Keilscheibe
Die Integration von erregenden und hemmenden synaptischen Inputs verändert die neuronale Aktivität kritisch. Wir beschrieben vor kurzem hemmende Inputs zu MOC Neuronen aus Neuronen des MNTB57, aber die Wirkung der Integration dieser Inputs mit erregenden Inputs auf MOC Neuron Aktivität ist unbekannt. In einer Keilscheibe aus einer ChAT-IRES-Cre x tdTomato Maus wurden Spannungsklemmenaufnahmen aus einem MOC-Neuron durchgeführt. Strom wurde über eine bipolare Wolfram-stimulierende Elektrode durch eine Stimulus-Isolationseinheit angetrieben, um Neurotransmitter Freisetzung von präsynaptischen Axonen evozieren. Zuerst wurde die ventrale akustische Stria (VAS) an der Mittellinie elektrisch stimuliert, um T-Stellat-Axone direkt und MNTB-Neuronen über GBC-Axonstimulation zu aktivieren (Abbildung 4A), um die Latenz auf postsynaptische Reaktionen in einer Aufnahmekonfiguration zu messen, die typische Dünnschnittexperimente imitiert (Abbildung 4B), Beispielspuren, grau, Haltepotenzial -60 mV). In separaten Experimenten wurde die auditive Nervenwurzel stimuliert, um monaural aufsteigende Schaltungen zu aktivieren, und postsynaptische Reaktionen wurden an MOC-Neuronen wie oben beschrieben gemessen. Die elektrische Stimulation an beiden Orten evozierte ein schnellelektrisches Artefakt, gefolgt von mehrspitzen strömenden Stromreaktionen (Beispielantworten von AN-Stimulation in Abbildung 4C,schwarze Spuren, Haltepotenzial -60 mV). Wir verglichen beginnende Latenzmessungen des ersten postsynaptischen Stroms (PSC) mit direkter Stimulation des VAS mit jenen, die mit auditiver Nervenstimulation evoziert wurden, und fanden eine signifikant längere Latenz zu AN-Stimulationsereignissen. Dies wurde auf die synaptische Verzögerung an der AN/CN-Synapse zurückgeführt (AN-Stimulation: 5,27 ± 0,43 ms, Median ± Median absoluter Abweichung (MAD), Bereich 4,26-5,93 ms, n = 8; VAS Stimulation: 1,98 ± 0,28 ms, Median ± MAD, Bereich 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon Signed Ranks Test, p = 0.014, Abbildung 4D). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Stimulation der auditiven Nervenwurzel zu einer synaptischen Aktivierung von ZN-Neuronen und anschließender Schaltkreisaktivität führt, die in vivo enger darstellt – wie Timing als direkte Stimulation von T-Stellat- oder GBC/MNTB-Axonen.

Mit unseren Cäsium-basierten, hohen [Cl-] internen Lösungen, die in Spannungsklemme, Exzitator (glutamatergen) und hemmenden (GABA und glycinergen) PSCs verwendet werden, sind beide nach innen beim ruhenden Membranpotenzial (-60 mV) und daher nicht zu unterscheiden. Während wir die Schaltungsaktivität in der AN-stimulierenden Konfiguration evozieren, haben wir den vermuteten hemmenden Input elektrisch isoliert, indem wir das Haltepotential auf 0 mV verschieben, das ungefähre Umkehrpotenzial für AMPA-vermittelte glutamaterge Ströme. In unserem Beispiel Neuron wurden äußere Stromreaktionen bei 0 mV beobachtet (Abbildung 4Ci, rote Spuren), die auf Chloridleitgien zensiert sind. Diese sind wahrscheinlich GABA- oder glycinerge synaptische Reaktionen. Diese Daten zeigen die Nützlichkeit der Keilscheibe, um sowohl erregende als auch hemmende Eingaben an MOC-Neuronen zu aktivieren, indem sie die auditive Nervenwurzel stimulieren, mit Aktivierung der nachfolgenden affeirischen Schaltung. Darüber hinaus wurden verschiedene Muster postsynaptischer Reaktionen durch AN-Stimulation heraufbeschworen, was darauf hindeutet, dass selbst unter Bedingungen identischer Stimulation von AN-Axonen die Aktivität des gesamten Schaltkreises dynamisch und komplex ist. Dieses experimentelle Paradigma ermöglicht eine detaillierte Analyse, wie sich komplexe auditive Reize durch das Hirnstamm ausbreiten und sich in MOC-Neuronen integrieren, wodurch die Leistung des MOC-Effizienzsystems und eventuelle Auswirkungen auf die Cochlea bestimmt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Keil-Slice-Schema und Beispielbild. (A) Schematic der medialen olivocochlearen Rückkopplungsschaltung. Blaue Pfeile zeigen den affemenden aufsteigenden Weg zu MOC-Neuronen und schwarzen Pfeilen den absteigenden Rückkopplungsweg von MOC-Neuronen zur Basis der äußeren Haarzellen (OHC) an. (B) Hellfeldbild einer Keilscheibe mit Etiketten der Hörnerv-Nervenwurzel (ANR) und des Cochlea-Kerns (gestrichelter Umriss) auf der dicken Seite. Sternchen gibt die ungefähre Position des ventralen Kerns des Trapezkörpers an, wo MOC-Neuronen für die Patch-Klemmung auf der dünnen Seite der Keilscheibe bestimmt sind. Gestrichelte schwarze Linien zeigen die Gesichtsnerven an, die in beiden Hemisphären der Scheibe auf der rostralen Oberfläche zu sehen sind. IHC - innere Haarzelle, GBC - kugelförmige Buschzelle, SPN - überlegener Paraolivarykern, MNTB - medialer Kern des Trapezkörpers, VNTB - ventraler Kern des Trapezkörpers, LSO - laterale überlegene Olive. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Cresylviolett-Färbungsabschnitte aus einer Keilscheibe, die bei 50 m neu geschnitten wurde. Jeder zweite Abschnitt wurde abgebildet. Abschnitte sind mit rostral --> caudal nummeriert. Keilscheiben enthielten tendenziell die Gesamtheit des Cochlea-Kerns (CN), einschließlich der dorsalen CN (Pfeil in S19) und ventralen CN (Pfeilspitze in S19), der auditiven Nervenwurzel (offene Pfeilspitze in S17) und eines Großteils des MNTB (dunkler Bereich nahe der ventralen Oberfläche in S3-S15, hervorgehoben mit gestrichelten Ovalen in S11). D und V auf Skalenstange stellen dorsale und ventrale in Scheibenausrichtung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Axone der aufsteigenden Eingabe in MOC-Neuronen aus dem kontralateralen Cochlea-Kern bleiben in der Keilscheibe intakt. (A) Der rostral-meisten Abschnitt aus einer Keilscheibe aus einer P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (rote Fluoreszenz) Maus, die neu geschnitten (70 m) und für die Biocytin-Visualisierung verarbeitet wurde. Konfokales Bild ist ein gekacheltes, maximaleintensitätsprojektions-z-Stack. Axone in den ventralen akustischen Stria werden durch weiße Pfeilspitzen hervorgehoben. Gestrichelte Umrisse zeigen den kleinen Teil des Cochlea-Kerns an, der in dieser rostralsten Scheibe verbleibt. Skala bar 500 m. (B) Konfokales Bild eines ChAT-IRES-Cre x tdTomato-positiven Neurons im VNTB mit Biocytin-positivem Punktia im umgebenden Neuropil. Skala bar 50 'm. (C) Biocytin beschriftete Axone, die die Mittellinie kreuzen und im kontralateralen MNTB als Kalycen von Held enden. Die vertikale gestrichelte Linie stellt die Mittellinie des Segments dar. Maßstab bar 100 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Elektrische Stimulation von affetienten Eingängen in Spannungsklemme ergibt Multipeak postsynaptische Ströme in MOC-Neuronen. (A) Schematische Keilscheibe mit Aufnahmeaufbau sowohl für die ventrale akustische Stria (VAS) Stimulation (graue stimulierende Elektrode) als auch für die Stimulation des Gehörnervs (AN) (schwarze stimulierende Elektrode) von affemittensten Eingängen in MOC. (B) Beispiele für postsynaptische Ströme (PSCs) aus einem einzelnen P17-Neuron, das mit einem einzigen elektrischen Stimulus in der Nähe der Mittellinie bei -60 mV evoziert wird. (C) PSCs, die während der AN-Stimulation bei -60 mV in einem P15-Neuron evoziert werden. (Ci) Beispiel-PSCs in der gleichen Zelle wie C evoziert bei 0 mV Haltepotenzial (das ungefähre Umkehrpotenzial für AMPA vermittelte Ströme in unserem Aufnahme-Setup, rot). (D) Bevölkerungsdaten zur Quantifizierung der Latenz auf das erste PSC für VAS und AN Stimulation. Boxen: Quartile, Zeileneinset: Median, quadratischer Einset: Mittelwert, Schnurrhaare: mittlere absolute Abweichung. * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das hier beschriebene Schneidverfahren, das als Keilscheibe bezeichnet wird, ist mächtig für die Aufrechterhaltung intakter präsynaptischer neuronaler Schaltkreise, aber mit der Zugänglichkeit von Gehirnscheibenexperimenten zur Analyse der neuronalen Funktion. In mehreren ersten Schritten muss große Vorsicht geboten sein, um den Nutzen der Vorbereitung für die Schaltungsanalyse zu maximieren. Die Abmessungen des Keils sollten durch histologische Untersuchung bestätigt werden, die integral für die Bestätigung ist, dass sowohl präsynaptische Kerne als auch ihre axonalen Projektionen in der vorbereiteten Keilscheibe enthalten sind. Die Schnittgeometrie kann geändert werden, wenn Projektionen abgetrennt werden oder nur wenige Axone die Zielkerne erreichen. Generell ist der Veredelungsschnitt am Vibratom für die Keilscheibe von entscheidender Bedeutung. Die optimale Keilscheibenvorbereitung erfordert eine Kombination aus konsistenter Verwendung von Vibramkonfigurationen, einschließlich der Verwendung konzentrischer Kreismarkierungen auf der Bühnenbasis, zusammen mit der Anpassung von Einstellungen, die auf bekannten Hirn-Landmarken basieren. Nach der Optimierung der Slice-Geometrie zeichneten wir konsistente PSCs in MOC-Neuronen auf, die durch elektrische Stimulierung der hörneriven Nervenwurzel in 8 von 18 Keilscheiben evoziert wurden. In unseren früheren Arbeiten konnten wir hemmende PSCs durch direkte Stimulation von MNTB-Axonen in ca. 60% der MOC-Neuronen57evozieren, was darauf hindeutet, dass unsere Erfolgsquote hier angesichts der langen Reichweite der Eingänge und der Notwendigkeit der polysynaptischen Schaltungsaktivierung nur eine bescheidene Reduktion ist. Bei der Vorbereitung der Scheibe ist es ratsam, auf der dickeren Seite zu erbrechen, da eine Abnahme der Sichtbarkeit aufgrund einer dickeren Scheibe über einen unbrauchbaren Abschnitt günstig ist, der unvollständig ist oder keine Schaltungskonnektivität hat. Jede Slice-Konfiguration oder -Abmessungen kann verwendet werden, solange die Scheibe unter das Aufnahmemikroskop-Objektiv passt, durch Patch- und stimulierende Elektroden (oder andere Sonden oder Geräte) zugänglich ist und dünn genug für optisch basierte Patch-Klemmen an der postsynaptischen Zelle von Interesse ist. Schnelle, schonende Sezierbarkeit und richtige Inkubations- und Erholungsbedingungen sind ebenfalls wichtig, um die Lebensfähigkeit des Kreislaufs für Patch-Clamp-Experimente zu erhalten. Spezifisch für unsere auditive Hirnstammvorbereitung muss das Gehirn sehr sorgfältig aus dem Schädel entfernt werden, um intakte und funktionelle hörnerare Nervenwurzeln zu erhalten. Dehnen oder Reißen des Nervs wirkt sich auf die Fähigkeit, die Fasern zu stimulieren und entlocken Aktivität in auditiven Neuronen. Aufgrund des größeren Gewebevolumens in der Scheibe kann die Modifikation traditioneller Schneidlösungen, Temperaturen, Inkubationsdetails und Perfusionssysteme die Gesundheit der Scheibe verbessern. Hier setzen wir leichte Modifikationen an unserer normalen Scheibenvorbereitung ein. Dazu gehören kürzere Inkubationszeiten (30 Minuten vs. 60 Minuten) und schnellere Durchflussraten im Scheibenkammer-Perfusionssystem.

Sobald die Slice-Dimensionen und Inkubationsdetails ermittelt wurden, sollten die Funktion und Konnektivität verschiedener Komponenten von Schaltkreisen innerhalb des Slices demonstriert werden. In unserer Zubereitung stellen wir sicher, dass sowohl erregende als auch hemmende Eingänge, die im Cochlea-Kern mit T-Stellat und GBC (über mNTB) entstanden sind, wie erwartet vorhanden sind. Alternative Stimulationsmethoden wie Saugelektroden für den Hörnerv oder optische Stimulationsmethoden wie Optogenetik oder fokale Neurotransmitter-Unkaging können auch die Schaltungsaktivierung erhöhen oder eine zelltypspezifische Aktivierung ermöglichen, wenn sie mit der genetischen Ausrichtung von Zellsubtypen gekoppelt sind.

Während diese Schneidemethode hoffentlich für viele Systeme und Schaltungen nützlich sein wird, sind einige der Einschränkungen von Standard-Dünnschnittabschnitten auch für diese Vorbereitung relevant. Im Allgemeinen kann es schwierig sein, Schaltkreise mit weniger planaren Projektionsmustern zu erhalten, da Axone wahrscheinlich durchtrennt würden. Die Aktivierung der Schaltung an den Hirnnerven, wie hier getan, um auditive Eingänge zu imitieren, ist in vielen Schaltkreisen möglicherweise nicht möglich. Wie bei anderen Slice-Präparaten müssen auch die Netzwerkeffekte jeder Pharmakologie berücksichtigt werden. Zum Beispiel, Bad Anwendung von Glutamat-Rezeptor-Blocker hemmen (GABA- oder glycinergic) oder andere Arten der Übertragung kann nicht mit polysynaptischen Schaltung Aktivierung verwendet werden, wenn Glutamat für die Aktivierung von Neuronen vor dem geflickten Zielneuron notwendig ist. Dies gilt in unserem Fall, da sowohl AN/CN- als auch GBC/MNTB-Synapsen glutamatergisch sind, daher würde die gesamte Übertragung bei MOC-Neuronen mit Badanwendung von Glutamatrezeptorblockern eliminiert. Zusätzlich, Anwendung von GABA oder Glycin-Rezeptor-Blocker zur Beseitigung MNTB-MOC synaptische Reaktionen haben die unbeabsichtigte Folge der Beseitigung intrinsische hemmende Konnektivität innerhalb der CN, die die Muster der affetierenden Inputs zu MOC Neuronen formen kann. Die fokale Anwendung von Rezeptorblockern mit Druckauswurf oder Iontophorese könnte verwendet werden, um die pharmakologische Funktion einzuschränken.

Schließlich ist die Hauptbeschränkung dieser und jeder In-vitro-Technik, dass, obwohl dieses Präparat die Aktivierung der monauralen aufsteigenden Gehörschaltung maximiert, der Rest des Nervensystems, einschließlich peripherer Rezeptoren, die Reize kodieren, fehlt. Dazu gehören die Cochlea selbst, exzitatorische Eingänge aus dem anderen Ohr66, kommissarische CN-Verbindungen67,68,69,70, und absteigende kortikale71,72,73,74 und kollikuläre75,76 Projektionen und modulatorische Eingänge77,78,79,80 bekannt, um die Aktivität von CN und SOC nleiuc beeinflussen. Obwohl es möglich ist, dass ein Teil der absteigenden IC-Projektionen beibehalten wird, wäre es aufgrund der Schnittgeometrie unmöglich, sowohl kortikale Projektionen als auch kommissarische KnN-Projektionen einzubeziehen. Daher konzentrieren wir uns auf die aufsteigende auditive Schaltung aus der Cochlea mit den aktuellen Experimenten. Die minimale Dicke der Scheibe auf der dünnen Seite reduziert auch die Fähigkeit, binaurale polysynaptische Schaltungsanalysen durchzuführen, was ein Vorteil der symmetrischen dicken Scheibenpräparate10,11ist. Darüber hinaus sind wir nicht in der Lage, den Hörnerv mit Klang zu stimulieren, um natürliche Muster der Schaltungsaktivität zu evozieren. Auditorische Nervenreaktionen sind tonotopisch variiert, nervös und kunststoffisch81,82,83,84, was es schwierig macht, mit unserer elektrischen Stimulationsmethode perfekt zu simulieren. Dies ist ein großer Nachteil von In-vitro-Experimenten im Hörsystem. Eine tonotopische Restriktion unserer Stimulation ist nicht möglich, da die Stimulierung der gesamten AN-Wurzel das An-Faser-Schwitzen über den tonotopischen Gradienten auslöst. Eine genaue Nachahmung der Vielfalt von AN-Faserreaktionen (d. h. fasern mit niedriger gegen hoher spontaner Rate) auf ein elektrisches Stimulusmuster ist ebenfalls nicht möglich. Es ist auch schwierig, die dynamische Intensitätscodierung mehrerer AN-Fasern am CN genau zu entsprechen. Wir sind jedoch in der Lage, mit unserer elektrophysiologischen Software eine Vielzahl von Stimulationsmustern zu erzeugen, die darauf abzielen, die entsprechende akustische Nervenleistung bei verschiedenen akustischen Reizen (z. B. kurze, laute Geräusche, leise, verlängerte Geräusche oder Geräusche im Hintergrundrauschen) zu imitieren, indem wir die Reizfrequenz sowohl zwischen elektrischen Stimulusprotokollen als auch innerhalb eines einzelnen Protokolls auf die Annäherung an kombinierte AN-Eingänge (modelliert in Ref.85)abdiviieren. Die Überwachung der MOC-Ausgabe während dieser Experimente wird unsere Hypothesen darüber testen, welche Stimulusmuster Hemmung oder Anregung bei MOC-Neuronen begünstigen können.

Trotz der oben beschriebenen Einschränkungen hat eine Keilscheibenpräparationsmethode Vorteile im Vergleich zu in vivo und typischen In-vitro-Slice-Physiologiemethoden und kann verwendet werden, um die Aktivierung von In-vivo-Schaltungen in der Scheibe für schwer zugängliche Zellen so nah wie möglich zu erreichen. In vivo Vollzellaufnahmen im auditiven Hirnstamm waren aufgrund von Schwierigkeiten beim chirurgischen Zugriff auf diesen Bereich selten86. Stattdessen wurde die Scheibe vorbereitet, um aufsteigende Eingänge in MOC-Neuronen einzuschließen, beginnend mit dem Hörnerv, der direkt stimuliert wird, um den gesamten monauralen aufsteigenden Kreislauf zu aktivieren. Wir zeigen die Aktivierung sowohl der erregenden als auch der hemmenden synaptischen Eingaben, und die Reaktionen auf diese Eingaben liefern wertvolle Informationen über das Timing von synaptischen Eingaben, wenn sie die MOC-Neuronen erreichen. Dies bietet eine Plattform für Experimente mit hohem Durchsatz, auf denen wir ein großes Repertoire an in vitro elektrophysiologischen Werkzeugen wie Kalzium- oder Spannungsbildgebung, Neurotransmitter-Unkaging und sowohl intrazelluläre (über die Patchpipetten) als auch extrazelluläre (über Badapplikation oder Iontophorese) Pharmakologie einsetzen können. Das Präparat sollte auch eine Erhöhung des Durchsatzes über dicke Scheibenpräparate aufgrund einer besseren Sichtbarkeit der Zielneuronen mit DIC-Optik bieten, die mit erhöhter Gewebedicke verschwimmen, vor allem im ventralen Hirnstamm. Insgesamt bietet diese Technik Verbesserungen bei Targeting und Durchsatz gegenüber In-vivo-Methoden und bessere Möglichkeiten für die Schaltungsanalyse als herkömmliche Slice-Physiologiemethoden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

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