A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Integration av olika synaptiska ingångar till nervceller mäts bäst i en beredning som bevarar alla pre-synaptiska kärnor för naturlig timing och krets plasticitet, men hjärnan skivor vanligtvis bryta många anslutningar. Vi utvecklade en modifierad hjärna skiva för att efterlikna in vivo krets verksamhet samtidigt som in vitro experimentförmåga.

Abstract

In vitro-skiva elektrofysiologi tekniker mäta encellig aktivitet med exakt elektriska och tidsmässiga upplösning. Hjärnan skivor måste vara relativt tunn för att korrekt visualisera och tillgång nervceller för patch-fastspänning eller bildbehandling, och in vitro-undersökning av hjärnan kretsar är begränsad till endast vad som är fysiskt närvarande i den akuta skiva. För att bibehålla fördelarna med in vitro-skiva experiment samtidigt som en större del av presynaptiska kärnor, utvecklade vi en ny skiva beredning. Denna “kil skiva” var avsedd för patch-clamp elektrofysiologi inspelningar för att karakterisera olika monaural, ljud-driven ingångar till mediala olivocochlear (MOC) nervceller i hjärnstammen. Dessa nervceller får sin primära afferent excitatoriska och hämmande ingångar från nervceller aktiveras av stimuli i kontralateral örat och motsvarande cochlear kärnan (CN). En asymmetrisk hjärnan skiva utformades som är tjockaste i rostro-caudal domänen vid den laterala kanten av en halvklotet och sedan tunnar mot den laterala kanten av den motsatta halvklotet. Denna skiva innehåller, på den tjocka sidan, den auditiva nervrot förmedla information om auditiva stimuli till hjärnan, den inneboende CN kretsar, och både disynaptic excitatoriska och trisynaptiska hämmande afferenta vägar som konvergerar på kontralaterala MOC nervceller. Inspelning utförs från MOC nervceller på den tunna sidan av skivan, där de visualiseras med hjälp av DIC optik för typiska patch-clamp experiment. Direkt stimulering av hörselnerven utförs när den kommer in i hörselhjärnstammen, vilket möjliggör inneboende CN-kretsaktivitet och synaptisk plasticitet att ske vid synapser uppströms MOC nervceller. Med denna teknik kan man härma in vivo kretsaktivering så nära som möjligt inom segmentet. Denna kil skiva beredning är tillämplig på andra hjärnkretsar där kretsanalyser skulle dra nytta av bevarande av uppströms anslutning och långväga ingångar, i kombination med de tekniska fördelarna med in vitro-skiva fysiologi.

Introduction

Observation av aktivitet av neurala kretsar är idealiskt utförs med inhemska sensoriska ingångar och feedback, och intakt anslutning mellan hjärnan regioner, in vivo. Men utför experiment som ger encellig upplösning av neurala kretsfunktion är fortfarande begränsad av tekniska utmaningar i intakt hjärnan. Medan in vivo extracellulär elektrofysiologi eller multifoton avbildningsmetoder kan användas för att undersöka aktivitet i intakta nervsystem, tolka hur olika ingångar integrera eller mäta subthreshold synaptiska ingångar förblir svårt. In vivo helcellsinspelningar övervinna dessa begränsningar men är utmanande att utföra, även i hjärnan regioner som är lätt att komma åt. Tekniska utmaningar av encelliga upplösningsexperiment förstärks ytterligare i vissa neuronpopulationer som ligger djupt i hjärnan, eller i rumsligt diffusa populationer som kräver antingen genetiska verktyg för att lokalisera celler in vivo (t.ex. genetiska uttryck för channelrhodopsin paras ihop med optrodeinspelning) eller post-hoc histokemisk identifiering efter inspelning av sitens märkning (t.ex. med neurotransmission-specifika markörer). Att ligga diffust nära den ventrala ytan av hjärnstammen, mediala olivocochlear (MOC) nervceller lider av ovanstående begränsningar¹, vilket gör dem extremt svårt att komma åt för in vivo experiment.

Hjärnan skivor (~ 100-500 μm tjocklek) har länge använts för att studera hjärnan kretsar, inklusive auditiva hjärnstammen kretsar, på grund av den fysiska segregeringen av anslutna nervceller som finns inom samma skiva^2,3^,4,5,6,7,8,9. Experiment med mycket tjockare skivor (>1 mm) har varit anställda i andra labb för att förstå hur bilaterala ingångar integreras i områden av den överlägsna olivary komplex (SOC) inklusive den mediala överlägsen oliv^10,11. Dessa skivor var beredda så att axoner av hörselnerven (AN) förblev intakt inom skiva och var elektriskt stimuleras att inleda synaptic signalsubstansen release i CN, härma verksamhet första ordningens hörsel nervceller som de skulle svara på ljud. En stor nackdel med dessa tjocka skivor är synlighet av nervceller för patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar (“patching”). Patching blir allt svårare eftersom de många axoner i detta område blir myelinated med^{ålder 12,13,14,15}, vilket gör vävnaden optiskt tät och döljande nervceller även i en typisk, tunn hjärna skiva. Vårt mål är att skapa in vitro-preparat som mer liknar kretsens anslutning av in vivo-inspelningar, men med hög genomströmning och högupplösta inspelningsförmågor hos visuellt guidad patch-clamp elektrofysiologi i hjärnskivor.

Vårt labb undersöker fysiologi neuroner av hörsel efferent systemet, inklusive MOC nervceller. Dessa kolinerga nervceller ger efferent feedback till cochlea genom modulera aktiviteten hos yttre hårceller (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Tidigare studier har visat att denna modulering spelar en roll i att få kontroll i snäckan^{21,22,23,24,25,26} och skydd mot akustiskt trauma^{27,28,29,30,31,32,33}. Hos möss, MOC nervceller är diffust ligger i den ventrala kärnan i trapetsoid kroppen (VNTB) i hörselhjärnstammen¹. Vår grupp har utnyttjat ChAT-IRES-Cre muslinjen korsade med tdTomato reporter mus linje för att rikta MOC nervceller i hjärnstammen skivor under epifluorescerande belysning. Vi visade att MOC nervceller får afferent hämmande ingång från ipsilateral mediala kärnan i trapetsoid kroppen (MNTB), som är upphetsad, i sin tur, av axoner från klotformiga buskiga celler (GBC) i den kontralaterala cochlear kärnan (CN)^{34,35,36,37,38}. Dessutom, MOC nervceller sannolikt får sina excitatoriska input från T-stellate celler i kontralateral CN^39,40,41. Sammantaget visar dessa studier MOC nervceller får både excitatoriska och hämmande ingångar som härrör från samma (kontralateral) öra. Emellertid, den presynaptiska nervceller, och deras axoner konvergerande på MOC nervceller, är inte riktigt tillräckligt nära varandra för att vara helt intakt i en typisk koronal skiva beredning. För att undersöka hur integration av synaptiska ingångar till MOC nervceller påverkar deras åtgärder potentiella bränning mönster, med fokus på nyligen beskrivna hämning, utvecklade vi en beredning där vi kunde stimulera de olika afferents till MOC nervceller från ena örat på det mest fysiologiskt realistiska sätt som möjligt, men med de tekniska fördelarna med in vitro hjärnan skiva experiment.

Kilskivan är en modifierad tjock skiva beredning avsedd för undersökning av krets integration i MOC nervceller (schematized i figur 1A). På den tjocka sidan av skivan innehåller kilen hörselnervens avhuggna axoner (kallas “auditiv nervrot” härefter) när de kommer in i hjärnstammen från periferin och synapsen i CN. Den auditiva nervrot kan elektriskt stimuleras att framkalla signalsubstansen release och synaptisk aktivering av celler i den helt intakta CN^{42,43,44,45,46}. Detta stimuleringsformat har flera fördelar för kretsanalys. Först, istället för att direkt stimulera T-stellate och GBC axoner som ger afferent input till MOC nervceller, stimulerar vi AN att tillåta aktivering av inneboende kretsar rikligt i CN. Dessa kretsar modulera produktionen av CN nervceller till sina mål i hela hjärnan, inklusive MOC nervceller^{46,47,48,49,50,51}. För det andra, den polysynaptiska aktiveringen av afferenta kretsar från AN genom CN uppströms MOC nervceller möjliggör mer naturlig aktivering timing och för plasticitet att inträffa vid dessa synapser som de skulle in vivo under auditiv stimulering. För det tredje kan vi variera våra stimuleringsmönster för att efterlikna EN aktivitet. Slutligen, både excitatoriska och hämmande monaural prognoser till MOC nervceller är intakt i kilen skiva, och deras integration kan mätas vid en MOC neuron med precision patch-clamp elektrofysiologi. Som helhet ger detta aktiveringssystem en mer intakt krets till MOC nervceller jämfört med en typisk hjärnan skiva beredning. Denna hjärnstammen kil slice kan också användas för att undersöka andra hörselområden som får hämmande ingång från ipsilateral MNTB inklusive den laterala överlägsen oliv, överlägsen olivary kärnan och mediala överlägsen oliv^10,11,52^,53,54,55,56. Utöver vår specifika förberedelse, kan denna skivning metod användas eller ändras för att utvärdera andra system med fördelarna med att upprätthålla anslutning av långväga ingångar och förbättra visualisering av nervceller för en mängd encellig upplösning elektrofysiologi eller bildframställning tekniker.

Detta protokoll kräver användning av en vibratome skede eller plattform som kan lutas cirka 15°. Här använder vi en kommersiellt tillgänglig 2-bit magnetiska scenen där “scenen” är en metallskiva med en böjd botten placeras i en konkav magnetisk “scenbas.” Scenen kan sedan skiftas för att justera segmentvinkeln. Koncentriska cirklar på scenbasen används för att uppskatta vinkeln reproducerbara. Scen- och scenbasen placeras i skivningskammaren, där även den magnetiska scenbasen kan roteras.

Protocol

Alla experimentella förfaranden godkändes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee. 1. Experimentella preparat OBS: Detaljer angående skivberedning inklusive skivningslösning, skivningstemperatur, skiva inkubationstemperatur och apparatur (etc.) är specifika för hjärnstamsberedning utförd i detta experiment. Skiva inkubation detaljer kan ändras per…

Representative Results

Histologisk undersökning av kilskivaFör vår undersökning av auditiva hjärnstammen neuron funktion, kil slice beredningen var utformad för att innehålla hörselnerven rot och CN kontralateral till MOC nervceller riktade för inspelningar (exempel skiva visas i figur 1B). Inledande histologisk undersökning av preparatet är viktigt att bekräfta att skiva innehåller de kärnor som är nödvändiga för kretsaktivering och att axonalprojektioner är intakta. Två c…

Discussion

Skivning förfarandet beskrivs här kallas en kil skiva är kraftfull för att upprätthålla intakt presynaptic neuronal kretsar, men med tillgängligheten av hjärnan skiva experiment för analys av neuronal funktion. Stor försiktighet måste tas i flera inledande steg för att maximera nyttan av preparatet för kretsanalys. Kilens dimensioner bör bekräftas med hjälp av histologisk undersökning, som är integrerad för bekräftelse av att både presynaptiska kärnor och deras axonalprojektioner finns inom den bere…

Materials

Experimental Preparations
Agar, powder	Fisher Scientific	BP1423500	4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488	Invitrogen	A10436	Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	Weighing chemicals
Double edged razor blade	Ted Pella	121-6	Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)	Sigma Aldrich	K3375-5G	Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter	Fisher Scientific (Intramalls)	13-620-451	Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	4% Agar Prep
Stirring Hotplate	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin	Sigma Aldrich	B4261-250MG	Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope	Amscope	SM-1BN	For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3	WPI	501976	Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)	Thomas Scientific	1220823	Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome	Leica	1491200S001	Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors	Roboz	RS-6872	Dissection tool
Single-edged carbon steel blades	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting	Leica	14048142068	Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula	FisherSci	14-375-10	Dissection tool
Super Glue	Newegg	15187	Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope	Nikon Instruments		Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long	Sutter Instrument	BF150-110-10	Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil	WPI	CMF20G	Patch electrode pipette filler
In-line solution heater	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems	Sutter Intruments	MPC-200 with MP285	Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes	Sutter instruments	FG-P1000	Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Next	Can be any amplifier/software
Recording Chamber	Warner Instruments	RC26G	Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp	Warner Instruments	640253	Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber	Custom Build		Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit	A.M.P.I.	Iso-Flex	Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	14-820-11	Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode	WPI	TM33CCINS	Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556006	Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin	Jackson Immuno labs	016-540-084	Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker	Sigma	CLS6780FP	Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich (Intramalls)	C5042-10G	Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades	Fisher Scientific	22-210-052	Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um	Fisher Scientific (Intramalls)	09-740-34A	Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01	Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack	Fisher Scientific (Intramalls)	08-812	Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome	ThermoFisher	910020	Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-543D	Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium	Fisher Scientific	SP15-100	Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides	Fisher Scientific	22-034980	Histology slides