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Neuroscience

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

Abstract

Las técnicas de electrofisiología de rebanadas in vitro miden la actividad de una sola célula con una resolución eléctrica y temporal precisa. Las rebanadas cerebrales deben ser relativamente delgadas para visualizar y acceder adecuadamente a las neuronas para la sujeción de parches o imágenes, y el examen in vitro de los circuitos cerebrales se limita sólo a lo que está físicamente presente en la rebanada aguda. Para mantener los beneficios de la experimentación in vitro en rodajas conservando al mismo tiempo una porción más grande de núcleos presinápticos, desarrollamos una nueva preparación de la rebanada. Esta "rebanada de cuña" fue diseñada para grabaciones electrofisiología de parches-pinza para caracterizar las diversas entradas monoaurales impulsadas por sonido a las neuronas olivocochlear medial (MOC) en el tronco cerebral. Estas neuronas reciben sus entradas excitatorias e inhibitorias aferentes primarias de las neuronas activadas por estímulos en el oído contralateral y el núcleo coclear correspondiente (CN). Se diseñó una rebanada cerebral asimétrica que es más gruesa en el dominio rostro-caudal en el borde lateral de un hemisferio y luego se adelgaza hacia el borde lateral del hemisferio opuesto. Esta rebanada contiene, en el lado grueso, la raíz nerviosa auditiva que transmite información sobre los estímulos auditivos al cerebro, el circuito NC intrínseco, y tanto el excitatorio disynaptic y trisináptica inhibitorio aferente vías que convergen en las neuronas MOC contralaterales. La grabación se realiza a partir de neuronas MOC en el lado delgado de la rebanada, donde se visualizan utilizando óptica DIC para experimentos típicos de abrazadera de parche. La estimulación directa del nervio auditivo se realiza al entrar en el tronco cerebral auditivo, lo que permite que la actividad intrínseca del circuito CN y la plasticidad sináptica se produzcan en las sinapsis aguas arriba de las neuronas MOC. Con esta técnica, se puede imitar la activación del circuito in vivo lo más cerca posible dentro de la rebanada. Esta preparación de la rebanada de cuña es aplicable a otros circuitos cerebrales donde los análisis de circuitos se beneficiarían de la preservación de la conectividad aguas arriba y las entradas de largo alcance, en combinación con las ventajas técnicas de la fisiología in vitro de las rebanadas.

Introduction

La observación de la actividad de los circuitos neuronales se realiza idealmente con entradas sensoriales nativas y retroalimentación, y conectividad intacta entre las regiones cerebrales, in vivo. Sin embargo, la realización de experimentos que dan resolución de una sola célula de la función del circuito neural todavía está limitada por desafíos técnicos en el cerebro intacto. Mientras que la electrofisiología extracelular in vivo o los métodos de imagen multifoton se pueden utilizar para investigar la actividad en sistemas nerviosos intactos, interpretar cómo diferentes entradas integran o miden las entradas sinápticas de subtrasinas sigue siendo difícil. Las grabaciones de células enteras in vivo superan estas limitaciones, pero son difíciles de realizar, incluso en regiones cerebrales a las que se puede acceder fácilmente. Los desafíos técnicos de los experimentos de resolución de una sola célula se amplifican aún más en ciertas poblaciones de neuronas que se encuentran en lo profundo del cerebro, o en poblaciones espacialmente difusas que requieren herramientas genéticas para localizar células in vivo (por ejemplo, expresión genética de channelrhodopsin emparejada con registro de optrode) o identificación histoquímica post-hoc después de registrar el etiquetado del sitio (por ejemplo, con marcadores específicos de la neurotransmisión). Al estar ubicadas difusamente cerca de la superficie ventral del tronco cerebral, las neuronas olivocochlear medial (MOC) sufren de las limitaciones anteriores1,por lo que son extremadamente difíciles de acceder para la experimentación in vivo.

Las rebanadas cerebrales (espesor de 100-500 m) se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar los circuitos cerebrales, incluyendo circuitos auditivos de tronco encefálica, debido a la segregación física de las neuronas conectadas que se encuentran dentro de la misma rebanada2,3,4,5,6,7,8,9. En otros laboratorios se han empleado experimentos con rodajas mucho más gruesas (>1 mm) para entender cómo se integran las entradas bilaterales en áreas del complejo olivar superior (SOC), incluyendo la aceituna superior medial10,11. Estas rebanadas se prepararon de tal manera que los axones del nervio auditivo (AN) permanecieron intactos dentro de la rebanada y fueron estimulados eléctricamente para iniciar la liberación de neurotransmisores sinápticos en el CN, imitando la actividad de las neuronas auditivas de primer orden, ya que responderían al sonido. Una de las principales desventajas de estas rebanadas gruesas es la visibilidad de las neuronas para las grabaciones electrofisiológicas de la abrazadera de parches ("parcheing"). Parchear se vuelve cada vez más difícil a medida que los numerosos axones de esta zona se miinantican conedades de 12,13,14,15años, haciendo que el tejido ópticamente denso y oscureciendo las neuronas incluso en una rebanada cerebral típica, delgada. Nuestro objetivo es crear preparaciones in vitro que se asemejen más a la conectividad de circuito de las grabaciones in vivo, pero con las capacidades de grabación de alto rendimiento y alta resolución de la electrofisiología de la abrazadera de parche guiada visualmente en las rebanadas cerebrales.

Nuestro laboratorio investiga la fisiología de las neuronas del sistema auditivo eferente, incluidas las neuronas MOC. Estas neuronas colinérgicas proporcionan una retroalimentación eferente a la cóclea modulando la actividad de las células pilosas externas (OHC)16,17,18,19,20. Estudios previos han demostrado que esta modulación juega un papel en el control de ganancia en la cóclea21,22,23,24,25,26 y la protección contra el trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. En ratones, las neuronas MOC se encuentran difusamente en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el tronco cerebral auditivo1. Nuestro grupo ha utilizado la línea de ratón ChAT-IRES-Cre cruzada con la línea de ratón reportero tdTomato para apuntar a las neuronas MOC en rebanadas de tronco cerebral bajo iluminación epifluorescente. Mostramos que las neuronas MOC reciben una aporte inhibitoria aferente del núcleo medial ipsilateral del cuerpo trapezoide (MNTB), que está excitado, a su vez, por axones de células tupidas globulares (GBC) en el núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Además, las neuronas MOC probablemente reciben su entrada excitatoria de células T-estelares en el NC contralateral39,40,41. En conjunto, estos estudios muestran que las neuronas MOC reciben insumos excitatorios e inhibitorios derivados del mismo oído (contralateral). Sin embargo, las neuronas presinápticas, y sus axones convergentes en las neuronas MOC, no están lo suficientemente cerca unas de otras para estar completamente intactas en una preparación típica de la rebanada coronal. Para investigar cómo la integración de las entradas sinápticas a las neuronas MOC afecta a sus patrones de disparo potencial de acción, con un enfoque en la inhibición recién descrita, desarrollamos una preparación en la que podríamos estimular los diversos aferentes a las neuronas MOC de un oído de la manera más realista fisiológicamente posible, pero con los beneficios técnicos de los experimentos in vitro de la división cerebral.

La rebanada de cuña es una preparación de rodaja gruesa modificada diseñada para la investigación de la integración de circuitos en neuronas MOC (esquemática en la Figura 1A). En el lado grueso de la rebanada, la cuña contiene los axones cortados del nervio auditivo (llamado "raíz nerviosa auditiva" en lo sucesivo) a medida que entran en el tronco encefálica desde la periferia y la sinapsis en el NC. La raíz nerviosa auditiva se puede estimular eléctricamente para evocar la liberación de neurotransmisores y la activación sináptica de las células de la CN42completamenteintacta,43,44,45,46. Este formato de estimulación tiene varios beneficios para el análisis de circuitos. En primer lugar, en lugar de estimular directamente los axones T-estelar y GBC que proporcionan una entrada diferente a las neuronas MOC, estimulamos la AN para permitir la activación de circuitos intrínsecos abundantes en la NC. Estos circuitos modulan la salida de las neuronas CN a sus objetivos en todo el cerebro, incluyendo las neuronas MOC46,47,48,49,50,51. En segundo lugar, la activación polisináptica de los circuitos aferentes desde el AN a través de la CN aguas arriba de las neuronas MOC permite un tiempo de activación más natural y que la plasticidad se produzca en estas sinapsis como lo harían in vivo durante la estimulación auditiva. En tercer lugar, podemos variar nuestros patrones de estimulación para imitar la actividad ano. Por último, las proyecciones monoaurales excitatorias e inhibitorias a las neuronas MOC están intactas en la rodaja de cuña, y su integración se puede medir en una neurona MOC con la precisión de la electrofisiología de la abrazadera de parche. En su conjunto, este esquema de activación proporciona un circuito más intacto a las neuronas MOC en comparación con una preparación típica de la rebanada cerebral. Esta rebanada de cuña de tronco encefálica también se puede utilizar para investigar otras áreas auditivas que reciben aporte inhibitorio de MNTB ipsilateral incluyendo la aceituna superior lateral, núcleo olivario superior y aceituna medial superior10,11,52,53,54,55,56. Más allá de nuestra preparación específica, este método de corte se puede utilizar o modificar para evaluar otros sistemas con los beneficios de mantener la conectividad de entradas de largo alcance y mejorar la visualización de las neuronas para una variedad de electrofisiología de resolución de una sola célula o técnicas de imagen.

Este protocolo requiere el uso de una etapa vibratoria o una plataforma que se puede inclinar aproximadamente 15o. Aquí utilizamos una etapa magnética de 2 piezas disponible comercialmente donde la "etapa" es un disco de metal con un fondo curvo colocado en una "base de etapa" magnética cóncava. A continuación, se puede desplazar el escenario para ajustar el ángulo de corte. Los círculos concéntricos en la base del escenario se utilizan para estimar el ángulo de forma reproducible. La base de la etapa y la etapa se colocan en la cámara de corte, donde también se puede girar la base de la etapa magnética.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares/Instituto Nacional sobre Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación Comité de Cuidado y Uso Animal.

1. Preparaciones experimentales

NOTA: Los detalles relativos a la preparación de la rebanada, incluyendo la solución de corte, la temperatura de corte, la temperatura de incubación de rodajas y el aparato (etc.) son específicos para la preparación del tronco encefálico realizado en este experimento. Los detalles de incubación de rebanadas se pueden alterar por experiencia de laboratorio.

  1. Prepare soluciones internas para la sujeción de parches.
    1. Preparar la solución de abrazadera de tensión que contenga (en mM) 76 Cs-methanesulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 QX-314 y 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste el pH a 7.2 con CsOH.
    2. Preparar la solución de abrazadera actual que contiene (en mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphoatine y 0.01 Alexa Fluor-488 hidrasido. Ajuste el pH a 7.2 con KOH.
  2. Preparar 100 ml de agar al 4% añadiendo 4 g de agar a 100 ml de agua caliente (cerca de hervir). Coloque sobre la placa de agitación calentada para mantener la temperatura y revuelva hasta que se disuelva por completo. Vierta en platos Petri de plástico de 100 mm a aproximadamente 1 cm de profundidad y déjese enfriar. Refrigere hasta que sea necesario.
  3. Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenga en mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4y 10 dextrosa. Burbuja con carbógeno (5% CO2 / 95% O2) durante al menos 10 min, luego ajuste el pH final a 7.4 con 1 M NaOH si es necesario. Mantener la oxigenación y el pH de la solución burbujeando continuamente con carbógeno durante todo el experimento.
  4. Preparar una solución de corte de 200 ml añadiendo 1 mM de ácido cifrénico a ACSF. Sonicar la solución en un baño de agua sonicante durante 10 minutos hasta que el ácido kynurenic se disuelva. Burbuja continua con carbógeno y colocar sobre hielo.
    ADVERTENCIA: Utilice el equipo de protección personal adecuado al manipular el ácido kynurenic.
  5. Monte una cuchilla adecuada en el vibratome siguiendo las instrucciones del fabricante. Enfríe la cámara de corte del vibratoma rodeándola con hielo.

2. Extirpación cerebral con raíz nerviosa auditiva intacta para la estimulación

NOTA: Los ratones para estos experimentos se obtuvieron cruzando ratones transgénicos ChAT-IRES-Cre en un fondo C57BL/6J con ratones reportero tdTomato (Ai14). Los ratones utilizados para la histología y la electrofisiología fueron después del inicio de la audición (P14-P23), que es alrededor de P12 en ratones. Las neuronas que expresan tdTomato en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) se han caracterizado previamente como neuronas MOC en esta líneade ratón 57.

  1. Eutanasiar (por ejemplo, asfixia deCO2) y decapitar al animal utilizando procedimientos institucionales aprobados.
  2. Con una cuchilla de afeitar, corta la piel en la línea media del cráneo desde la nariz hasta la parte posterior del cuello. Pelar hacia atrás la piel para exponer el cráneo.
  3. Usando tijeras pequeñas, haz una incisión en el cráneo a través de la línea media comenzando en la base (extremo caudal cerca de la médula espinal) del cráneo y continuando hacia la nariz.
  4. En la sutura lambda, haz cortes en el cráneo desde la línea media, lateral hacia la oreja en ambos lados. Pelar hacia atrás el cráneo para exponer el cerebro.
  5. Comenzando en el extremo rostral, levante suavemente el cerebro lejos del cráneo con una pequeña espátula de laboratorio o fórceps romos. Cortar el nervio óptico y continuar trabajando suavemente el cerebro hacia atrás, exponiendo la superficie ventral.
  6. Corte los nervios trigéminos pellizcándolos con fórceps finos cerca de la superficie ventral del tronco encefálica.
    NOTA: Haga esto cuidadosamente ya que el nervio vestibulocochlear se encuentra justo debajo de esto y necesita estar intacto para una estimulación eventual.
  7. Coloque la preparación en un plato de petri de vidrio lleno de solución de corte en frío. Coloque el plato debajo de un microscopio de disección. Burbuja suave con carbógeno.
  8. Recorta el nervio facial cerca del tronco encefálica y expone el nervio vestibulocochlear.
  9. Usando fórceps finos, empuja las puntas hacia el foramina donde el nervio vestibulocochlear sale del cráneo lo más lejos posible y pellizca el nervio para cortarlo, dejando la raíz nerviosa unida al tronco cerebral. Repite esto en el otro lado.
  10. Una vez que ambas raíces nerviosas estén libres, retire las meninges y la vasculatura de la superficie ventral del tronco encefálica cerca del cuerpo trapezoidal.
  11. Libera el cerebro completamente del cráneo pellizcando los nervios craneales restantes y el tejido conectivo teniendo cuidado de preservar la médula espinal restante si es posible.

3. Bloquear y montar el cerebro en el escenario (disco magnético)

  1. Preparar la superficie del cerebro para fijarse a la etapa bloqueando el cerebro a nivel del quiasmo óptico.
    1. Con la superficie ventral hacia arriba, estabilice el cerebro usando una herramienta contundente para inmovilizar suavemente la médula espinal de modo que el cerebro no se incline durante el siguiente paso.
    2. A nivel del quiasmo óptico, usa fórceps abiertos para crear el plano para bloquear el cerebro insertando a través del cerebro hasta la parte inferior del plato. Inserte los fórceps en un ángulo de aproximadamente 20o desde la vertical para que las puntas salgan de la superficie dorsal del cerebro caudal al quiasmo óptico.
    3. Corte a lo largo de los fórceps con la cuchilla de afeitar.
  2. Pega el cerebro a la superficie de la etapa.
    1. Preparar un bloque pequeño (1 cm3)de agar al 4% para apoyar el cerebro.
    2. Coloque una pequeña gota de pegamento en el escenario y extiéndalo en un rectángulo para que tanto el cerebro como el bloque de agar puedan ser pegados hacia abajo.
    3. Usando fórceps, levante cuidadosamente el cerebro y deslice suavemente el exceso de líquido usando el borde de una toalla de papel. Coloque la superficie bloqueada sobre el pegamento, la superficie ventral estará hacia la hoja durante el corte.
    4. Empuje el bloque de agar suavemente contra la superficie dorsal del cerebro para apoyarlo durante el corte y para asegurar el posicionamiento adecuado del cerebro (es decir, ángulo).

4. Cortar el cerebro para crear rodajas de cuña

NOTA: Preparar una rebanada cerebral usando vibratomo que tenga la raíz nerviosa coclear en el lado grueso y las neuronas olivocochlear medial (MOC) y el núcleo medial del cuerpo trapezoidal (MNTB) en el lado delgado.

  1. Coloque el disco magnético con el cerebro conectado en la base del escenario y colóquelo en la cámara de corte con la superficie ventral del cerebro orientada hacia la hoja.
  2. Llene la cámara con solución de corte frío y burbuja con carbógeno.
  3. Baje la hoja en la solución y corte las rodajas caudal a la región de interés para asegurarse de que las rebanadas son simétricas. Si los sectores parecen asimétricos, incline ligeramente el escenario para obtener simetría.
    NOTA: Las velocidades de la hoja entre 0,05-0,10 mm/s fueron eficaces para cortar rodajas saludables y pueden variar dependiendo de la edad del animal y la región cerebral.
  4. Una vez que las rebanadas son simétricas, cambie la etapa de 15o (correspondiente a aproximadamente 3 anillos concéntricos en la base del escenario) a un lado.
    NOTA: Aleje el escenario de la raíz nerviosa auditiva que desea conservar en la rebanada.
  5. Continúe cortando cuidadosamente hasta que la raíz del nervio auditivo esté cerca de la superficie de un lado, y el nervio facial se pueda ver en la superficie del otro lado.
  6. Cambie la etapa hacia atrás 15o a la posición original.
  7. Aleje la hoja del tejido y gire la base de la etapa 90o para que el borde lateral del lado delgado esté mirando hacia la hoja. Baje la hoja varios cientos de micras y luego lentamente acerca la hoja al borde del tejido. Repita esto hasta que la hoja toque el borde lateral. Baje la hoja al espesor deseado del borde delgado de la rebanada, aquí doscientos micras adicionales.
    NOTA: La rebanada resultante es idealmente de 300 mm de espesor a nivel del núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el lado donde se llevará a cabo la sujeción del parche.
  8. Mueva la hoja hacia atrás lejos del tejido y gire la base de la etapa hacia atrás para que la superficie ventral esté orientada hacia ella.
  9. Haga el corte que designe la superficie rostral de la rebanada de cuña. Transfiera la rebanada a un pedazo de papel de interfaz (1 cm2) superficie caudal hacia abajo. Mueva la rodaja a la cámara de incubación u otro aparato de incubación adecuado para su recuperación (30 min a 35oC).
    NOTA: El nervio facial debe ser visible en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral (ver Figura 1B).

5. Configuración y grabación de electrofisiología

  1. Coloque la rodaja de cuña en la cámara de grabación y fije la rodaja con un arpa o un sistema estabilizador. Perfunda el tejido continuamente a una velocidad de 7-10 ml/min con ACSF caliente (35 oC) burbujeado con carbógeno.
  2. Identifique las neuronas MOC etiquetadas genéticamente en el VNTB utilizando epifluorescencia con filtros de emisión de 561 nm para grabaciones de abrazaderas de parches. Voltear sector si no hay celdas potencialmente parcheables.
  3. Usando la óptica DIC, concéntrese en la raíz nerviosa auditiva en el lado grueso de la rebanada y use un micromaniprógrafo para mover el electrodo estimulante de tungsteno bipolar hasta la raíz del nervio auditivo y suavemente en la superficie del tejido.
    NOTA: Los electrodos de aspiración se han utilizado en experimentos de estimulación del nervio auditivo en otros laboratorios. Los electrodos de vidrio Theta, o métodos de estimulación óptica se pueden emplear si es aplicable a otras preparaciones específicas.
  4. Mueva el campo de visión de nuevo al VNTB para elegir una neurona MOC para apuntar a la electrofisiología de la abrazadera de parche.
  5. Llene una pipeta de grabación con la solución interna adecuada para el experimento propuesto.
  6. Parche y registro de la neurona MOC en la configuración de células enteras. Compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie si es necesario.
  7. Ajuste la amplitud de estimulación eléctrica de la raíz nerviosa auditiva para obtener eventos postsinápticos consistentes en la neurona MOC.
    NOTA: Puede ser necesario mover el electrodo de estimulación.
  8. Ejecute protocolos de estimulación adecuados para observar corrientes sinápticas evocadas en MOC (pinza de tensión) o patrones potenciales de acción (pinza de corriente).
    NOTA: La preparación de la rebanada de cuña se puede utilizar con cualquier herramienta típica de sujeción de parches, como grabaciones de parches sueltos, farmacología, optogenética, imágenes de calcio, eliminación de descapatas de neurotransmisores, etc.

6. Confirmación histológica de núcleos de tronco encefálica

NOTA: Esto se hace con tinción de color violeta cresil, en rodaja de cuña fija y re-seccionada. Este método permite la visualización de núcleos que están contenidos en el sector.

  1. Después de preparar una rodaja de cuña, sumerja la rodaja en fijador (4% PFA en PBS) durante la noche. Enjuagar la rodaja 3x durante 10 minutos en PBS (temperatura ambiente en una coctelera), luego colocar en 30% sacarosa en PBS durante la noche a 4 oC para crioprotecer.
  2. Vuelva a seccionar la rebanada en un microtoma de congelación (40-70 mm) y recoja las secciones seriales en una placa de 24 pozos en PBS.
  3. Montar secciones sobre portaobjetos recubiertos de gelatina y dejar secar completamente. Coloque las diapositivas en el carro deslizante.
  4. Preparar soluciones violetas cresil
    1. Preparar 1% de acetato de crema violeta mezclando 5 g de acetato de crema violeta en 500 ml dH2O
    2. Preparar el tampón de acetato preparando primero la solución de 90 ml A (ácido acético glacial de 540 ml + 89,46 ml de dH2O) y 10 ml de solución B (136 mg de acetato de sodio en 10 ml de dH2O). Combine la solución A y la solución B produciendo el tampón de acetato.
    3. Combine 1% de acetato de crema violeta con el tampón de acetato 1:1 para 0.5% de crema violeta en tampón de acetato. Filtrar antes de usar.
    4. Preparar 95% y 70% de etanol diluyendo 100% etanol con volúmenes adecuados de dH2O
  5. Realice el protocolo de tinción violeta de cresil. Mueva el carro deslizante a través de las bandejas de solución, hinchando el exceso de solución en una toalla de papel entre las bandejas: xileno – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0.5% solución violeta cresil – 8-14 min monitoreo con frecuencia hasta que la tinción nuclear se convierte en púrpura oscuro; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – diapositivas de inmersión dos veces; xileno – 5 min; xileno: 25 min hasta que se realiza el montaje.
    ADVERTENCIA: Utilice xilenes sólo debajo de una campana de humos.
  6. Retire las diapositivas del xileno de uno en uno e inmediatamente coloque los resbalones de la cubierta en las diapositivas utilizando el medio de montaje. Deje que el medio de montaje se seque (durante la noche).
  7. Secciones de imagen.

7. Etiquetado de biocitina para el rastreo anterogrado de axones en tejido vivo y sin fijo

  1. Prepare una rodaja de cuña como arriba (Pasos 2-4).
  2. Transfiera el corte al papel de interfaz (1 cm2). Bajo un microscopio de disección, localice la NC en el lado grueso de la rebanada.
  3. Retire con cuidado el exceso de ACSF del área que rodea la rebanada retorciendo una esquina de un papel tisú para alejar el ACSF del tejido. Esto evita que la biocytina se propague a las áreas circundantes de la rebanada, lo que podría conducir a la absorción en las células fuera de la NC.
  4. Con fórceps finos, seleccione un pequeño cristal de biocytin y colóquelo en la superficie del CN. Presione suavemente el cristal en el tejido para promover el contacto con las neuronas y la posterior absorción en somata. Repita este paso para cubrir la región de interés deseada, en este caso las regiones CN que contienen neuronas T-estelares y GBC.
  5. Coloque la rebanada en una cámara de incubación. Dejar incubar la rebanada durante 2-4 h a 35oC para permitir la absorción y el transporte de la biocictina. Después de la incubación, enjuague la rodaja en ACSF para eliminar las partículas de biocitina.
  6. Colocar la rebanada en fijador (4% PFA en PBS) durante la noche. Enjuagar 3x durante 10 min en PBS.
  7. Cryoprotect rebanada en 30% sacarosa en PBS durante la noche a 4 oC o hasta que la rodaja se hunda.
  8. Resecar el tejido para producir secciones transversales en un microtoma de congelación a 70-100 mm.
  9. Procesar tejido utilizando métodos inmunohistoquímicos estándar con una estreptavidina conjugada fluorescentemente.
    NOTA: Se puede realizar inmunohistoquímica adicional en las secciones si es útil para etiquetar cuerpos celulares presinápticos, axones, receptores u otras moléculas sinápticas importantes para la visualización de circuitos (es decir, los pasos de anticuerpos primarios no deben afectar negativamente a la visualización secundaria de la biocitina).
  10. Imagen del tejido.

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Representative Results

Examen histológico de la rodaja de cuña
Para nuestra investigación de la función de la neurona del tronco encefálica auditiva, la preparación de la rebanada de cuña fue diseñada para contener la raíz nerviosa auditiva y la NC contralateral a las neuronas MOC dirigidas a las grabaciones (ejemplo de sector mostrado en la Figura 1B). El examen histológico inicial de la preparación es importante para confirmar que la rebanada contiene los núcleos necesarios para la activación del circuito y que las proyecciones axonales están intactas. Dos tipos de células dentro de la NC proporcionan información sólida a las neuronas MOC. Las células T-estelares se presumen para proporcionar la entrada excitatoria a las neuronas MOC39,40,41,58. Las células tupidas globulares (GBC) excitan las neuronas MNTB en el hemisferio contralateral (a través del cáliz especializado de la sinapsis Held)34,36,37,38,59,60 que, a su vez, proporcionan entrada inhibitoria a las neuronas MOC57 (Figura esquemática 1A). Para confirmar la presencia de células T-estelares y GBC, re-seccionamos (a 50 m) una rebanada de cuña que se fijó por inmersión en 4% PFA y realizamos tinción violeta cresil para etiquetar somata. En el lado grueso de la rebanada de cuña(Figura 2, hemisferio izquierdo), el CN estaba presente en casi su extensión completo rostro-caudal. Además, las subdivisiones dorsales y ventrales del CN estaban intactas(Figura 2;flecha y punta de flecha en S19). Las neuronas estelares t y los GBC se agrupan en el núcleo coclear ventral cerca de donde el nervio auditivo (Figura 2; flecha en S17) entra en el CN61,62,63,64,65. La rebanada de cuña también contiene neuronas de las neuronas ipsilaterales a MOC MNTB a las que se realizan grabaciones (hemisferio delgado de la rebanada de cuña original, lado derecho en la Figura 2). Esto confirma que al menos una parte de la entrada inhibitora de las neuronas MOC está intacta(Figura 2, rebanadas 1-15, resaltada por óvalos discontinuos en S11).

En experimentos separados, confirmamos que los axones y terminales presinápticos de las neuronas NC estaban intactos en la rodaja de cuña utilizando el etiquetado anterogrado con biocytina. En primer lugar, la rebanada de cuña en vivo se preparó y se colocó en papel de interfaz. Inmediatamente después de preparar la rodaja de cuña, se colocaron cristales de biocitina en la NC que permitieron la absorción y el transporte anterogrado a lo largo de los axones durante un período de incubación. A continuación, se realizó la fijación y re-seccionamiento del tejido (secciones de 70 mm). Se realizó una tinción de secciones con estreptavidina etiquetada fluorescentemente para visualizar axones etiquetados con biocytina. Las imágenes confocales de estas secciones muestran un etiquetado brillante en la NC donde se colocaron los cristales y se tomaron en cuerpos celulares(Figura 3A,hemisferio izquierdo, área discontinua). Los axones que salían de la NC a lo largo de la estría acústica ventral(Figura 3A,puntas de flecha blancas) estaban claramente etiquetados y podían ser seguidos a sus puntos de terminación. Las neuronas MOC contralaterales de biocytina positivas sugieren que nuestra preparación conserva los contactos sinápticos originarios de la NC (Figura 3B). Del mismo modo, los cálices etiquetados de Held en el MNTB contralateral indican que los axones que se proyectan desde las neuronas GBC a MNTB se conservan en la rodaja de cuña (Figura 3C). Estos exámenes histológicos confirman que nuestra rebanada de cuña contiene tanto los cuerpos celulares como las proyecciones axonales del circuito de entrada aferente a las neuronas MOC, lo que, por lo tanto, nos permite medir las respuestas postsinápticas evocadas por la estimulación del nervio auditivo y la posterior propagación de la actividad a través de circuitos ascendentes.

Fisiología sináptica en rodaja de cuña
La integración de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias da forma crítica a la actividad neuronal. Recientemente describimos los insumos inhibitorios a las neuronas MOC de las neuronas de la MNTB57,pero se desconoce el efecto de la integración de estos insumos con insumos excitatorios en la actividad de las neuronas MOC. En una rodaja de cuña de un ratón ChAT-IRES-Cre x tdTomato, se realizaron grabaciones de abrazadera de voltaje a partir de una neurona MOC. Corriente se aplicó a través de un electrodo estimulante de tungsteno bipolar impulsado por una unidad de aislamiento de estímulo para evocar la liberación de neurotransmisores de los axones presinápticos. Primero se estimuló eléctricamente la estría acústica ventral (VAS) en la línea media para activar los axones estelares T directamente y las neuronas MNTB a través de la estimulación del axón GBC(Figura 4A),para medir la latencia a las respuestas postsinápticas en una configuración de grabación que imita los experimentos típicos de corte delgado(Figura 4B),trazas de ejemplo, gris, manteniendo el potencial -60 mV). En experimentos separados, la raíz nerviosa auditiva fue estimulada para activar los circuitos ascendentes monoaurales y las respuestas postsinápticas se midieron en las neuronas MOC como se describió anteriormente. La estimulación eléctrica en cualquiera de las dos ubicaciones evocó un artefacto eléctrico rápido seguido de respuestas de corriente multipisa (respuestas de ejemplo de la estimulación AN en la Figura 4C,rastros negros, con potencial de -60 mV). Comparamos las medidas de latencia de inicio de la primera corriente postsináptica (PSC) evocada con estimulación directa del VAS con las evocadas con estimulación del nervio auditivo y encontramos una latencia significativamente más larga a los eventos de estimulación de AN. Esto se atribuyó al retraso sináptico incurrido en la sinapsis AN/CN (estimulación AN: 5,27 ± 0,43 ms, mediana ± desviación absoluta mediana (MAD), rango 4,26-5,93 ms, n a 8; Estimulación VAS: 1,98 ± 0,28 ms, mediana ± MAD, rango 0,75-3,46 ms, n a 17; Prueba de rangos firmados de Wilcoxon, p a 0,014, Figura 4D). Estos resultados confirman que la estimulación de la raíz nerviosa auditiva da lugar a la activación sináptica de las neuronas CN y la actividad del circuito posterior, representando más estrechamente in vivo, como el tiempo que la estimulación directa de los axones T-estelar o GBC/MNTB.

Con nuestra solución interna a base de cesio, alta [Cl-] utilizada en la abrazadera de voltaje, excitatoria (glutamatérgica) e inhibitoria (GABA y glicérgica) los PSC son ambos hacia adentro en el potencial de membrana en reposo (-60 mV) y por lo tanto indistinguibles. Al tiempo que evocamos la actividad del circuito en la configuración de estimulación de AN, aislamos eléctricamente la presunta entrada inhibitoria desplazando el potencial de retención a 0 mV, el potencial de inversión aproximado para las corrientes glutamatérgicas mediadas por AMPA. En nuestra neurona ejemplo, se observaron respuestas de corriente exterior a 0 mV(Figura 4Ci, rastros rojos) indicativo de conductaciones por cloruro. Estos son probablemente para ser GABA- o respuestas sinápticas glicérgicas. Estos datos demuestran la utilidad de la rebanada de cuña para activar entradas excitatorias e inhibitorios a las neuronas MOC estimulando la raíz nerviosa auditiva, con la activación de circuitos aferentes posteriores. Además, diversos patrones de respuestas postsinápticas fueron evocados por la estimulación AN, lo que sugiere que incluso en condiciones de estimulación idéntica de los axones AN, la actividad de todo el circuito es dinámica y compleja. Este paradigma experimental permite un análisis detallado de cómo los estímulos auditivos complejos se propagan a través del tronco encefál y se integran en las neuronas MOC, determinando la producción del sistema eferente MOC y el impacto final en la cóclea.

Figure 1
Figura 1: Esquema de sector de cuña e imagen de ejemplo. (A) Esquema del circuito de retroalimentación olivocochlear medial. Las flechas azules indican que la vía ascendente aferente a las neuronas MOC y las flechas negras indican la vía de retroalimentación descendente desde las neuronas MOC hasta la base de las células pilosas externas (OHC). (B) Imagen de campo brillante de una rebanada de cuña con etiquetas de la raíz nerviosa auditiva (ANR) y el núcleo coclear (contorno discontinuo) en el lado grueso. El asterisco indica la ubicación aproximada del núcleo ventral del cuerpo trapezoidal donde las neuronas MOC están dirigidas a la sujeción de parches en el lado delgado de la rebanada de cuña. Las líneas negras discontinuas indican los nervios faciales que se pueden ver en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral. IHC - célula del cabello interno, GBC - célula tupida globular, SPN - núcleo de paraolivaria superior, MNTB - núcleo medial del cuerpo trapezoidal, VNTB - núcleo ventral del cuerpo trapezoidal, LSO - aceituna superior lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Secciones teñidas de color violeta cresil de una rodaja de cuña que se volvió a secar a 50 m. Se hizo una imagen de cada otra sección. Las secciones están numeradas rostral --> caudal. Las rodajas de cuña tendían a contener la totalidad del núcleo coclear (CN), incluyendo tanto el CN dorsal (flecha en S19) como el CN ventral (punta de flecha en S19), la raíz nerviosa auditiva (punta de flecha abierta en S17) y gran parte del MNTB (área oscura cerca de la superficie ventral en S3-S15, resaltada con óvalos discontinuos en S11). D y V en la barra de escala representan dorsal y ventral en orientación de la rebanada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los ejes de entrada ascendente a las neuronas MOC del núcleo coclear contralateral permanecen intactos en la rodaja de cuña. (A) La sección más rostral de una rodaja de cuña tomada de un ratón P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (fluorescencia roja) que fue re-seccionada (70 m) y procesada para la visualización de la biocitina. La imagen confocal es una pila z de proyección de intensidad máxima en mosaico. Los axones en la estrías acústica ventral se resaltan con puntas de flecha blancas. El contorno discontinuo indica la pequeña porción del núcleo coclear que permanece en esta rebanada más rostral. Barra de escala 500 m. (B) Imagen confocal de una neurona c.a. ChAT-IRES-Cre x tdTomato positivo en el VNTB con biocictina puncta positiva en la neuropípa americana. Barra de escala 50 m. (C) Los axones etiquetados con biocitina se muestran cruzando la línea media y terminando en el MNTB contralateral como cálices de Held. La línea discontinua vertical representa la línea media del sector. Barra de escala de 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La estimulación eléctrica de las entradas aferentes en la abrazadera de voltaje produce corrientes postsinápticas multipanáficas en las neuronas MOC. (A) Esquema de la rebanada de cuña con configuración de grabación para la estimulación de estrías acústica ventral (VAS) (electrodo estimulante gris) y la estimulación del nervio auditivo (AN) (electrodo estimulante negro) de las entradas aferentes al MOC. (B) Ejemplos de corrientes postsinápticas (PSC) de una neurona P17 individual evocadas con un solo estímulo eléctrico cerca de la línea media a -60 mV. (C) LOS PSC evocados durante la estimulación AN a -60 mV en una neurona P15. Ejemplode PSC en la misma celda que C evocó a 0 mV de potencial de retención (el potencial de inversión aproximado para las corrientes mediadas AMPA en nuestra configuración de grabación, rojo). (D) Datos de población para la cuantificación de la latencia a la primera PSC para VAS y AN estimulación. Cajas: cuartiles, recuadro de línea: mediana, inserción cuadrada: media, bigotes: mediana de desviación absoluta. * p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El procedimiento de corte descrito aquí llamado una rebanada de cuña es potente para mantener intacta el circuito neuronal presináptico, pero con la accesibilidad de la experimentación de la rebanada cerebral para el análisis de la función neuronal. Se debe tener mucho cuidado en varios pasos iniciales con el fin de maximizar la utilidad de la preparación para el análisis de circuitos. Las dimensiones de la cuña deben confirmarse mediante el examen histológico, que es fundamental para la confirmación de que tanto los núcleos presinápticos como sus proyecciones axonales están contenidos dentro de la rodaja de cuña preparada. La geometría del corte puede requerir modificación si las proyecciones se cortan o pocos axones alcanzan los núcleos de destino. En términos más generales, el corte de acabado en el vibratoma para la rodaja de cuña es de vital importancia. La preparación óptima de la rebanada de cuña requerirá una combinación de uso constante de configuraciones de vibratoma, incluido el uso de marcas de círculo concéntricos en la base del escenario, junto con el ajuste de los ajustes basados en puntos de referencia cerebrales conocidos. Después de la optimización de la geometría de la rebanada, registramos PSC consistentes en neuronas MOC evocadas estimulando eléctricamente la raíz nerviosa auditiva en 8 de 18 rodajas de cuña. En nuestro trabajo anterior pudimos evocar PSC inhibitorios a través de la estimulación directa de axones MNTB en aproximadamente el 60% de las neuronas MOC57,lo que sugiere que nuestra tasa de éxito aquí es sólo una reducción modesta dado el largo alcance de los insumos y la necesidad de activación del circuito polisináptico. Al preparar la rebanada, es aconsejable errar en el lado más grueso como una disminución en la visibilidad debido a una rebanada más gruesa es favorable sobre una sección inutilizable que está incompleta o carece de conectividad de circuito. Cualquier configuración o dimensiones de la rebanada se puede utilizar, siempre y cuando la rebanada se ajuste bajo el objetivo del microscopio de grabación, es accesible mediante electrodos de parche y estimulante (u otras sondas o equipos), y es lo suficientemente delgada para la sujeción óptica de parches en la célula postsináptica de interés. La disección rápida y suave y las condiciones adecuadas de incubación y recuperación también son importantes para mantener la viabilidad del circuito para experimentos con abrazaderas de parches. Específico para nuestra preparación del tronco encefálico auditivo, el cerebro debe ser eliminado con mucho cuidado del cráneo con el fin de preservar las raíces nerviosas auditivas intactas y funcionales. Estirar o desgarrar el nervio afectará la capacidad de estimular las fibras y provocar la actividad en las neuronas auditivas. Debido al mayor volumen de tejido en la rebanada, la modificación de las soluciones tradicionales de corte, las temperaturas, los detalles de incubación y los sistemas de perfusión pueden mejorar la salud de la rebanada. Aquí empleamos ligeras modificaciones en nuestra preparación normal de la rebanada. Estos incluyen tiempos de incubación de recuperación más cortos (30 minutos frente a 60 minutos) y caudales más rápidos en el sistema de perfusión de la cámara de corte.

Una vez que se han determinado las dimensiones de la rebanada y los detalles de incubación, se debe demostrar la función y la conectividad de los diferentes componentes de los circuitos dentro de la rebanada. En nuestra preparación, nos aseguramos de que tanto los insumos excitatorios como los inhibitorios, hipotéticos para originarse en el núcleo coclear con T-estelar y GBC (a través de la MNTB), estén presentes como se esperaba. Los métodos de estimulación alternativos, como los electrodos de succión para el nervio auditivo, o los métodos de estimulación óptica, como la optogenética o el descapado de neurotransmisores focales, también pueden aumentar la activación del circuito o permitir la activación específica del tipo celular cuando se combinan con la segmentación genética de los subtipos celulares.

Si bien es de esperar que este método de corte sea útil para muchos sistemas y circuitos, algunas de las limitaciones de las secciones estándar de corte fino también son relevantes para esta preparación. Generalmente, puede ser difícil preservar circuitos con patrones de proyección menos planos, ya que es probable que los axones se cortaran. La activación del circuito en los nervios craneales, como se hace aquí para imitar las entradas auditivas, puede no ser factible en muchos circuitos. Al igual que con otras preparaciones de sectores, se deben tener en cuenta los efectos de la red de cualquier farmacología. Por ejemplo, la aplicación de baño de los bloqueadores de receptores de glutamato para aislar inhibitorios (GABA- o gliinérgicos) u otros modos de transmisión no se puede utilizar con la activación del circuito polisynáptico cuando el glutamato es necesario para la activación de las neuronas aguas arriba de la neurona de destino parcheado. Esto es cierto en nuestro caso ya que las sinapsis AN/CN y GBC/MNTB son glutamatérgicas, por lo tanto, toda la transmisión se eliminaría en las neuronas MOC con la aplicación de baño de bloqueadores de receptores de glutamato. Además, aplicación de GABA o bloqueadores de receptores de glicina para eliminar las respuestas sinápticas MNTB-MOC tendría la consecuencia no deseada de eliminar la conectividad inhibitorina intrínseca dentro de la NC que puede dar forma a los patrones de entradas diferentes a las neuronas MOC. La aplicación focal de los bloqueadores de receptores, con eyección de presión o iontoforesis, podría utilizarse para restringir la función farmacológica.

Finalmente, la principal limitación de esta técnica, y cualquier, in vitro es que aunque esta preparación maximiza la activación de los circuitos auditivos ascendentes monaurales, el resto del sistema nervioso, incluyendo los receptores periféricos que codifican estímulos, está ausente. Esto incluye la cóclea en sí, entradas excitatorias del otro oído66, conexiones CN commissurales67,68,69,70, y cortical descendente71,72,73,74 y collicular75,76 proyecciones y entradas moduladoras77,78,79,80 conocidos por influir en la actividad de CN y SOC núcleos. Si bien es posible que se mantenga una parte de las proyecciones IC descendentes, sería imposible incluir tanto proyecciones corticales como proyecciones CN commissurales debido a la geometría del corte. Por lo tanto, nos centramos en los circuitos auditivos ascendentes de la cóclea con los experimentos actuales. El espesor mínimo de la rebanada en el lado delgado también reduce la capacidad de realizar análisis de circuito polisináptico binaural, lo que es una ventaja de las preparaciones simétricas de rodajas gruesas10,11. Además, somos incapaces de estimular el nervio auditivo con el sonido para evocar patrones naturales de actividad del circuito. Las respuestas nerviosas auditivas son tonotópicamente variadas, nerviosas y de plástico81,82,83,84,lo que dificulta la simulación perfecta con nuestro método de estimulación eléctrica. Este es un gran inconveniente de la experimentación in vitro en el sistema auditivo. La restricción tonotópica de nuestra estimulación no es posible ya que estimular toda la raíz AN provocará picoteo en fibras AN a través del gradiente tonoópico. También no es posible imitar con precisión la diversidad de las respuestas de fibra AN (es decir, fibras de baja y alta velocidad espontánea) a un patrón de estímulo eléctrico. También es difícil igualar con precisión la codificación de intensidad dinámica de múltiples fibras AN en la CN. Sin embargo, somos capaces de utilizar nuestro software de electrofisiología para producir una variedad de patrones de estimulación destinados a imitar la salida nerviosa auditiva adecuada durante diferentes estímulos acústicos (por ejemplo, sonidos cortos, fuertes, sonidos silenciosos, prolongados o sonidos en ruido de fondo) variando la frecuencia de estímulo tanto entre los protocolos de estímulo eléctrico como también dentro de un protocolo individual para aproximar entradas AN combinadas (modeladas en la referencia85). Monitoreo de la producción de MOC durante estos experimentos pondrá a prueba nuestras hipótesis con respecto a qué patrones de estímulo pueden favorecer la inhibición o excitación en las neuronas MOC.

A pesar de las limitaciones descritas anteriormente, un método de preparación de rodajas de cuña tiene beneficios en comparación con los métodos de fisiología de rodajas in vivo y in vitro típicos y se puede utilizar para acercarse a la activación del circuito in vivo lo más cerca posible en la rebanada para las células de difícil acceso. Las grabaciones in vivo de células enteras en el tronco cerebral auditivo han sido raras debido a dificultades para acceder a esta área quirúrgicamente86. En su lugar, la rebanada se preparó para incluir entradas ascendentes a las neuronas MOC comenzando con el nervio auditivo, que se estimula directamente para activar todo el circuito ascendente monoaural. Demostramos la activación de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorios, y las respuestas a estas entradas proporcionan información valiosa sobre la sincronización de las entradas sinápticas a medida que llegan a las neuronas MOC. Esto proporciona una plataforma para la experimentación de alto rendimiento donde podemos emplear un amplio repertorio de herramientas de electrofisiología in vitro como imágenes de calcio o voltaje, descalibros de neurotransmisores, y tanto la farmacología intracelular (a través de la pipeta de parche) como extracelular (a través de la aplicación de baño o la iontoforesis). La preparación también debe ofrecer un aumento en el rendimiento sobre las preparaciones de rodajas gruesas debido a una mejor visibilidad de las neuronas diana utilizando la óptica DIC, que se difuminan con mayor espesor tisular, especialmente en el tronco cerebral ventral. En general, esta técnica proporciona mejoras en la segmentación y el rendimiento sobre los métodos in vivo, y mejores oportunidades para el análisis de circuitos que los métodos tradicionales de fisiología de sectores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

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In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo
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Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

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