Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması
Summary
Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM), gen fonksiyonlarının değerlendirilmesinde, insan hastalıklarının modelinde ve terapötik yolları değerlendirmek için preklinik model olarak hizmet vermede etkili olmuştur. Bununla birlikte, zaman, emek ve maliyet yoğun doğaları, gen fonksiyonunun sistematik analizi için yararlarını sınırlar. Genom düzenleme teknolojilerindeki son gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmekte ve belirli bir gen pertürbasyonunun doğrudan belirli fare organları içinde çok katlı ve hızlı bir şekilde hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Burada, cildin epitelinde ve farelerin ağız boşluğunda binlerce gen nakavt klonu oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir yöntemi (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) tanımlıyoruz ve tümör baskılayıcı genler için doğrudan in vivo CRISPR ekranı gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklayan bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, doku homeostazı sırasında veya çeşitli hastalık ortamlarında genlerin biyolojik işlevini incelemek için diğer organlara veya CRISPR aktivasyonu veya CRISPR-inaktivasyonu gibi diğer CRISPR /Cas9 teknolojilerine uygulanabilir.
Introduction
Post-genomik çağda kanser araştırmaları için zorluklardan biri, nedensel gen mutasyonları için çok miktarda genom verisi çıkarmak ve gen ağında terapötik olarak hedeflenebilen düğümleri tanımlamaktır. Biyoinformatik analizler bu hedeflere son derece yardımcı olsa da, verimli in vitro ve in vivo modeller oluşturmak, biyolojik sistemlerin ve hastalık durumlarının karmaşıklığını çözmek ve ilaç gelişimini sağlamak için bir ön koşuldur. Konvansiyonel transgenik fare modelleri in vivo kanser genetiği çalışmaları için yoğun olarak kullanılmış olsa da, maliyet, zaman ve emek yoğun doğası, modern genomik tarafından çözülen yüzlerce putatif kanser geninin sistematik analizini büyük ölçüde yasaklamıştır. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, tek bir farenin derisinde ve ağız boşluğunda yüzlerce genin fonksiyon kaybı mutasyonlarını aynı anda teşvik etmek ve incelemek için daha önce kurulmuş bir ultrason güdümlü rahim enjeksiyon metodolojisi1,2’yi CRISPR / Cas9 (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) gen düzenleme teknolojisi3 ile birleştirdik.
Burada açıklanan metodoloji, embriyonik gün E9.5’te canlı fare embriyolarının amniyotik boşluğuna tasarlanmış lentivirüslerin ultrason güdümlü enjeksiyonlarını kullanır. CRISPR/Cas9 bileşenlerini içeren lentiviral yük, daha sonra cildin ve ağız boşluğunun epiteline yol açan tek katmanlı yüzey ektodermini aktarır. Cilt bir dış epidermisin, ardından bodrum membran ve dermisin oluşur. Epidermis, bodrum zarı ile teması sürdüren, proliferatif ve kök hücre kapasitesine sahip, iç, bazal bir tabakadan oluşan tabakalı bir epiteldir. Bazal tabaka, dikenli, granül ve stratum korneum katmanları2,4gibi yukarıdaki farklı katmanlara yol açar. Soy izleme çalışmaları, bu doğrudan in vivo CRISPR/Cas9 yönteminin, yetişkinlik boyunca devam eden bazal tabaka içindeki doku yerleşik kök hücreleri genetik olarak manipüle ettiğini göstermektedir. Lentivirüs, E9.5 yüzey ektodermini klonal yoğunlukta transdüze etmek için titratlanabildiğinden, bu yöntem binlerce ayrık gen nakavt klonunu barındıran mozaik fareler üretmek için kullanılabilir. Yeni nesil dizileme daha sonra crispr/cas9 aracılı gen ablasyonunun bu klonlar içindeki etkisini çok katlı bir şekilde analiz etmek için kullanılabilir5.
Son zamanlarda bu yöntemi, insan Baş ve Boyun Skuamöz Hücreli Karsinom (HNSCC)5’tetekrarlayan mutasyonlar gösteren 484 genin işlevini değerlendirmek için kullandık. HNSCC% 40-50 yüksek ölüm oranına sahip yıkıcı bir kanserdir ve dünya çapında en sık görülen6. HNSCC, üst hava yolunun veya ağız boşluğunun mukozal astarlarında ortaya çıkar ve tütün ve alkol tüketimi veya insan papillomavirüs (HPV) enfeksiyonu ile ilişkilidir. Cutaneous Skuamöz Hücreli Karsinom (SCC) cilt tümörleridir ve insanlarda en sık görülen ikinci kanseri temsil eder7. Cutaneous SCC ve HNSCC histolojik ve moleküler olarak çok benzerdir, TP53, PIK3CA, NOTCH1 ve HRAS8’dedeğişiklik sergileyen vakaların yüksek bir yüzdesi ile. Yüksek frekansta mutasyona uğramış sadece bir avuç gen olsa da, genellikle uzun kuyruk dağılımı olarak adlandırılan bir fenomen olan düşük frekansta mutasyona uğramış yüzlerce gen (< % 5) vardır. Uzun kuyruklu genlerin çoğunluğu biyolojik veya klinik doğrulamadan yoksun olduğu için, bu in vivo CRISPR tarama teknolojisini p53, Pik3ca veya Hras’ta hassaslaştırıcı mutasyonlarla tümöre eğilimli farelerde bu genlerin fonksiyon kaybını modellemek için kullandık ve tümör gelişimini tetiklemek için p53, Pik3ca veya Hras ile işbirliği yapan birkaç yeni tümör baskılayıcı gen tanımladık5.
Burada, çok katlı sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA kütüphaneleri oluşturmak ve fare yüzeyi ektoderminde CRISPR / Cas9 gen nakavt ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Not olarak, bu metodoloji CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) ve CRISPR inaktivasyonu (CRISPRi) gibi diğer gen manipülasyon teknolojilerini içerecek şekilde uyarlanabilir veya gen işlevlerini incelemek için faredeki diğer organ sistemlerini hedef alacak şekilde değiştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 genom düzenleme, gen fonksiyonlarını ve hücresel süreçleri araştırmak için in vitro ve in vivo çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo çalışmaların çoğunda crispr/cas9 gen düzenlenmiş hücreler bir hayvan modeline (allograft veya ksinograft) aşılanmış kullanır. Bu, kanser genetiği ve hücresel fonksiyonları incelemek için güçlü bir araç olsa da, hala doğal doku mikroçevrasyonundan yoksundur ve yara ve / veya bağışıklık tepkileri ortaya çıkabilir.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR 365252), Krembil Vakfı ve Ontario Araştırma Fonu Araştırma Mükemmellik Turu 8’den (RE08-065) bir proje hibesi ile desteklenmiştir. Sampath Kumar Loganathan, Kanada Kanser Derneği bursunun (BC-F-16#31919) sahibidir.
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
