Summary
Qui descriviamo una metodologia di screening CRISPR/Cas9 in vivo rapida e diretta utilizzando iniezioni lentivirali embrionali guidate da ultrasuoni in utero per valutare contemporaneamente le funzioni di diversi geni nella pelle e nella cavità orale dei topi immunocompetenti.
Abstract
I modelli di topo geneticamente modificati (GEMM) sono stati fondamentali per valutare la funzione genica, modellare le malattie umane e servire come modello preclinico per valutare le vie terapeutiche. Tuttavia, la loro natura ad alta intensità di tempo, manodopera e costi limita la loro utilità per l'analisi sistematica della funzione genica. I recenti progressi nelle tecnologie di editing del genoma superano tali limitazioni e consentono la rapida generazione di specifiche perturbazioni geniche direttamente all'interno di specifici organi del topo in modo multiplexato e rapido. Qui, descriviamo un metodo basato su CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) per generare migliaia di cloni gene knock-out all'interno dell'epitelio della pelle e della cavità orale dei topi e fornire un protocollo che dettaglia i passaggi necessari per eseguire uno schermo CRISPR in vivo diretto per i geni soppressori del tumore. Questo approccio può essere applicato ad altri organi o ad altre tecnologie CRISPR/Cas9 come l'attivazione CRISPR o l'inattivazione CRISPR per studiare la funzione biologica dei geni durante l'omeostasi tissutale o in vari contesti di malattia.
Introduction
Una delle sfide per la ricerca sul cancro nell'era post-genomica è estrarre la grande quantità di dati genomici per le mutazioni geniche causali e identificare i nodi nella rete genica che possono essere mirati terapeuticamente. Mentre le analisi bioinformatiche hanno contribuito immensamente a raggiungere questi obiettivi, stabilire modelli efficienti in vitro e in vivo è un prerequisito per decifrare la complessità dei sistemi biologici e degli stati delle malattie e per consentire lo sviluppo di farmaci. Mentre i modelli convenzionali di topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studi di genetica del cancro in vivo, la loro natura ad alta intensità di costi, tempo e lavoro ha ampiamente vietato l'analisi sistematica delle centinaia di geni del cancro putativo non rivelato dalla genomica moderna. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo combinato una tecnologia di editing genica guidata da ultrasuoni precedentemente stabilita nella metodologia di iniezione utero1,2 con una tecnologia di editing genico CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3 per indurre e studiare simultaneamente mutazioni di perdita di funzione di centinaia di geni nella pelle e nella cavità orale di un singolo topo.
La metodologia qui descritta utilizza iniezioni guidate da ultrasuoni di lentivirus ingegnerizzati nella cavità amniotica degli embrioni di topo viventi al giorno embrionale E9.5. Il carico lentivirale contenente componenti CRISPR/Cas9 trasduce l'ectoderma superficiale monostrato, che successivamente dà origine all'epitelio della pelle e della cavità orale. La pelle è composta da un'epidermide esterna, seguita da membrana basale e derma. L'epidermide è un epitelio stratificato composto da uno strato interno basale, che mantiene il contatto con la membrana basale e ha capacità proliferativa e cellulare. Lo strato basale dà origine agli strati differenziati sopra come strati spinosi, granulari e strato corneo2,4. Studi di tracciamento del lignaggio mostrano che questo metodo CRISPR/Cas9 in vivo diretto manipola geneticamente le cellule staminali residenti nei tessuti all'interno dello strato basale che persistono per tutta l'età adulta. Poiché il lentivirus può essere titolato per trasdurre l'ectoderma superficiale E9.5 a densità clonale, questo metodo può essere utilizzato per generare topi mosaico che ospitano migliaia di cloni discreti a knock-out genico. Il sequenziamento di nuova generazione può quindi essere utilizzato per analizzare l'effetto dell'ablazione genica mediata da CRISPR /Cas9 all'interno di tali cloni in modomultiplexato 5.
Recentemente abbiamo utilizzato questo metodo per valutare la funzione di 484 geni che mostrano mutazioni ricorrenti nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo umano (HNSCC)5. L'HNSCC è un cancro devastante con un alto tasso di mortalità del 40-50% ed è il6 ° cancro più comune in tutto ilmondo 6. L'HNSCC si presenta nei rivestimenti mucosi delle vie aeree superiori o della cavità orale e sono associati al consumo di tabacco e alcol o all'infezione da papillomavirus umano (HPV). Il carcinoma a cellule squamose cutanee (SCC) sono tumori della pelle e rappresentano il secondo tumore più comune nell'uomo7. Cutaneous SCC e HNSCC sono istologicamente e molecolarmente molto simili, con un'alta percentuale di casi che presentano alterazioni in TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS8. Mentre ci sono solo una manciata di geni mutati ad alta frequenza, ci sono centinaia di geni trovati mutati a bassa frequenza (< 5%), un fenomeno comunemente indicato come distribuzione a coda lunga. Poiché la maggior parte dei geni a coda lunga manca di convalida biologica o clinica, abbiamo utilizzato questa tecnologia di screening CRISPR in vivo per modellare la perdita di funzione di questi geni nei topi soggetti a tumore con mutazioni sensibilizzanti in p53, Pik3ca o Hras e identificato diversi nuovi geni soppressori del tumore che collaborano con p53, Pik3ca o Hras per innescare lo sviluppo tumorale5.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per generare librerie di sgRNA CRISPR lentivirale sgRNA multiplexato ed eseguire schermi di knock-out genico CRISPR / Cas9 nell'ectoderma della superficie del mouse. Da notare che questa metodologia può essere adattata per incorporare altre tecnologie di manipolazione genica come l'attivazione CRISPR (CRISPRa) e l'inattivazione CRISPR (CRISPRi) o modificata per indirizzare altri sistemi di organi nel topo per studiare le funzioni geniche.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato ed eseguito in conformità con la IACUC dell'Università di Toronto.
1. Progettazione e clonazione di librerie CRISPR in pool
- Seleziona 4-5 sgRNA mirati ai geni del mouse di interesse da risorse come il progettista di sgRNA del Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) o il server CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Selezionare un numero uguale di sgRNA non mirati, ad esempio Sanjana e altri9, per generare una libreria di gRNA di controlli non mirati di dimensioni uguali.
- Durante la costruzione delle librerie di sgRNA, assicurarsi che ci sia una copertura sufficiente per ogni sgRNA nel sistema di organi mirato. Per la pelle del topo, l'epidermide di E9.5 è un singolo strato che contiene ~ 150.000 cellule, la maggior parte delle quali hanno capacità di cellulestaminali 4. Se la trasduzione lenti-virale si traduce in un'infettività del 15-20%, solo 18.000-24.000 cellule saranno trasdotto a E9,5. Ridimensionare l'esperimento di conseguenza.
- Per la clonazione e l'amplificazione di queste librerie di sgRNA, aggiungere siti di restrizione enzimatica BsmBI e sequenze di DNA leganti primer a 5' e 3' estremità dello sgRNA e ordinare gli oligo a lunghezza intera risultanti come chip oligonucleotide pooled (Figura 1A).
- Per multiplexare librerie diverse su un chip, aggiungere sequenze primer specifiche della libreria.
- Utilizzando le coppie di primer appropriate, amplificare ogni libreria separatamente dal chip oligo in pool. In un tubo PCR, mescolare 25 μL di miscela master di polimerasi 2x, 20 μL di acqua libera di DNasi/RNasi, 5 ng di DNA di chip oligo, 2,5 μL di primer in avanti appropriato e 2,5 μL di primer inverso appropriato. Utilizzare 12-15 cicli e amplificare con denaturazione di 98 °C, ricottura a 63-67 °C, parametri di estensione di 72 °C per ogni ciclo nella macchina PCR.
- Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio al 2,5% e purificare il prodotto PCR ~ 100 bp utilizzando un kit di pulizia del DNA in gel.
- Preparare il plasmide dorsale.
- Digerire 5 μg della Cre-ricombinasi contenente pLKO-Cre stuffer v3 plasmide con 2 μL di BsmBI in miscela di reazione 50 μL per 1 h a 55 °C, seguita da 1 μL di incubazione di fosfatasi alcalina per 45 min a 37 °C secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: La cre-ricombinasi contenente pLKO-Cre stuffer v3 plasmide è un plasmide a base lenti virale che contiene enzima Cre-ricombinasi per rimuovere la cassetta Lox-Stop-Lox nelle cellule del topo e ha anche un promotore U6 per guidare l'espressione di sgRNA e tracrRNA. Una versione con Cas9 e senza Cas9 può essere utilizzata e disponibile su Addgene #158030 e #158031. - Eseguire il DNA digerito su un gel di agarosio all'1% e purificare la banda vettoriale linearizzata da 7 kb utilizzando un kit di pulizia del DNA in gel. Da notare che dovrebbe essere visibile anche una banda stuffer da 2 kb che indica un digest di successo.
- Digerire 5 μg della Cre-ricombinasi contenente pLKO-Cre stuffer v3 plasmide con 2 μL di BsmBI in miscela di reazione 50 μL per 1 h a 55 °C, seguita da 1 μL di incubazione di fosfatasi alcalina per 45 min a 37 °C secondo le istruzioni del produttore.
- Impostare la reazione di legatura per generare una libreria plasmide sgRNA.
- Mescolare 1 μg di vettore purificato e 30 ng di inserto PCR purificato con 2 μL di BsmBI, 5 μL di T4 DNA ligasi, 10 μM ATP e 1x buffer specifico per BsmBI. Incubare il mix di legatura durante la notte a 37 °C. Utilizzare un tubo aggiuntivo contenente tutti i materiali di cui sopra ad eccezione dell'inserto PCR come controllo negativo.
- Il giorno dopo, purificare il mix di liga utilizzando il kit di pulizia oligo ed elute in 7 μL di acqua libera di RNasi / DNasi.
- Elettroporare la libreria in celle competenti.
- Aggiungere 2 μL di libreria di sgRNA eluita o miscela di legatura di controllo negativo a 25 μL di celle elettrocompetenti scongelate in cumvette pre-refrigerate (1,0 mm) sul ghiaccio. Elettroporato seguendo il protocollo del produttore (10 μF, 600 Ohm, 1800 Volt). Alla cuvetta aggiungere 975 μL di mezzo di recupero (o mezzo SOC) entro 10 s dall'impulso.
- Trasferire le cellule elettroporate in un tubo di coltura e incubare per un'ora a 37 °C in un incubatore di scuotimento batterico a 300 giri/min.
- Stimare l'efficienza di trasformazione e la copertura della libreria per sgRNA.
- Preparare una diluizione di 100 volte trasferendo 10 μL della reazione di trasformazione contenente cellule elettroporate con libreria di sgRNA o legatura di controllo negativo a 990 μL di Recupero Medio e mescolare bene.
- La piastra 10 μL della miscela di trasformazione diluita su una piastra di agar preri warmed da 10 cm LB + ampicillina (100 μg/L). Ciò si traduce in una diluizione di 10.000 volte dei trasformatori e utilizzare questa piastra per calcolare l'efficienza di trasformazione. Eseguire l'incubazione delle piastre a 30 °C per 14-16 ore.
- Placcare il resto della reazione di trasformazione diffondendo 100 μL di cellule recuperate su ogni piastra per un totale di 10 piastre di agar preri warmed da 15 cm LB + ampicillina. Incubare le piastre per 14-16 ore a 30 °C. Da notare che la crescita a 30 °C riduce al minimo la ricombinazione tra le due ripetizioni a terminale lungo all'interno del plasmide virale.
- Per valutare il successo della clonazione, calcolare l'efficienza di trasformazione. Contare il numero di colonie sulla piastra di diluizione contenente trasformatori della libreria di sgRNA o legatura di controllo negativo (piastre di 10 cm, passo 1.8.2). Il mix di controllo negativo non dovrebbe avere colonie o solo pochissime. Per ottenere il numero totale di colonie, moltiplicare il numero di colonie per 10.000.
NOTA: Il numero totale contato di colonie rappresenta una copertura della biblioteca che dovrebbe essere di almeno 200 colonie per sgRNA.- Assicurati che una libreria con 2000 sgRNA abbia almeno 400.000 colonie. Nel caso in cui non ci siano abbastanza colonie, ripeti e imposta più elettroporazione.
- Controllo qualità: Dalla piastra di diluizione, raccogliere 20 colonie e aggiungere ogni colonia a un singolo tubo di coltura contenente 3 ml di supporti LB + ampicillina. Incubare tutti i 20 tubi durante la notte a 30 °C tremando a 250 giri/min. Purificare il DNA plasmide utilizzando il kit di mini-preparazione secondo le istruzioni del produttore e la sequenza Sanger tutti i 20 campioni di DNA plasmide per verificare che ogni campione abbia una sequenza di sgRNA diversa utilizzando il primer U6 (5'-GAG GGC CTT CTT ATG ATT CC-3').
- Raccogli le colonie da ogni piatto di 15 cm.
- Aggiungere 7 mL di mezzo LB, quindi raschiare le colonie dalla piastra LB Agar con uno spargitore di cellule. Utilizzare una pipetta da 10 ml per trasferire le cellule in un pallone conico sterile da 2 L. Ripetere per tutti i piatti e i batteri della piscina nel pallone da 2 L. Incubare il pallone per tremare 2-3 ore a 30 °C. Centrifugare la coltura e raccogliere il pellet.
- Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit di purificazione maxi-plasmide.
- Controllo di qualità aggiuntivo: utilizzare 1 ng di DNA plasmide della libreria di sgRNA maxi-preparazione ed eseguire una reazione PCR utilizzando primer di sequenziamento di nuova generazione secondo le istruzioni del produttore. La rappresentazione di tutti gli sgRNA nella libreria può essere verificata tramite una piattaforma di sequenziamento profondo.
2. Produzione di lentivirus ad alto formicolio adatto alla trasduzione in vivo
NOTA: eseguire tutti i passaggi descritti in questa sezione del protocollo in una struttura BSL2+ in un cabinet di biosicurezza di classe II, tipo A2. 293FT e in particolare le celle di imballaggio 293NT consentono una maggiore produzione di virus. Utilizzare celle a passaggio basso ( 3. Chirurgia e iniezione guidate ultra-sonore NOTA: Questa tecnologia è stata adattatada 4,11. La microiniezione orientata alla trasduzione dell'epitelio superficiale deve essere eseguita al giorno embrionale E9.5, quando l'ectoderma superficiale è costituito da un singolo strato e prima della formazione del periderm a partire dall'E10, il che impedirebbe la trasduzione di questo strato basale. Preferibilmente impostare i topi il venerdì, in modo che il primo giorno possibile con embrioni E9.5 sia il lunedì successivo. Utilizzare topi Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857) per un'efficienza CRISPR/Cas9ottimale 12. 4. Procedura di sequenziamento profondo
NOTA: utilizzare sempre una bottiglia di DMEM non aperta o aperta molto di recente per la trasfezione, poiché il pH in questo passaggio è fondamentale e DMEM diventa più semplice nel tempo una volta aperto.
NOTA: La sospensione virale risultante deve produrre una concentrazione approssimativa di 2.000 volte e la soluzione virale risultante e deve avere un titolo virale di10 7-10 9, che è abbastanza buono per oltre 100 interventi chirurgici E9.5 descritti di seguito.
NOTA: Il confronto tra la sospensione virale concentrata con il suo supernatante virale non concentrato consentirà di stimare il successo della (1) produzione virale e (2) della concentrazione virale. In alternativa, il titer virale può essere stimato utilizzando il metodo qRT-PCR10. La produzione e la concentrazione su larga scala di lentivirus possono anche essere eseguite utilizzando una concentrazione in due punti con una concentrazione di cartucce seguita da ultracentrifugazione comedescritto in precedenza 2.
NOTA: Non superare i 30 minuti di anestesia poiché le dighe gravide hanno molte più probabilità di abortire i loro embrioni oltre quel tempo. Un chirurgo esperto può iniettare fino a 12 embrioni entro 30 minuti di intervento chirurgico.
NOTA: Durante l'esecuzione di interventi chirurgici ultra-sonori in utero, si deve fare la massima attenzione per mantenere un ambiente pulito, mantenere la sterilità il più possibile ed evitare eventuali contaminanti. Se più di un intervento chirurgico deve essere eseguito lo stesso giorno, è importante sterilizzare gli strumenti di dissezione utilizzando uno sterilizzatore di perline e pulire altri apparecchi che incontrano tessuto di topo pulito con etanolo. Ciò aumenta notevolmente la maggiore sopravvivenza degli embrioni dopo l'intervento chirurgico. Il tasso di sopravvivenza per il metodo chirurgico qui descritto è costantemente compreso tra l'80 e il 100%.
NOTA: I topi sono meglio identificati usando il microscopio fluorescente fino al giorno 3 postnatale prima che i capelli inizino a crescere.
NOTA: È importante generare un campione di riferimento per consentire il calcolo delle variazioni di piegatura dello sgRNA nel tempo. Gli embrioni trasdotti 3 giorni dopo l'infezione o le cellule trasdutte (vedi fase 2. 6) possono servire come campione di riferimento per determinare la rappresentazione dello sgRNA nella libreria originale.
NOTA: Impostare la reazione PCR della decodifica a barre in un'area dedicata separata del laboratorio o in una cappa di coltura tissutale che viene pulita accuratamente dalla cancellazione del DNA per evitare qualsiasi contaminazione. Eseguire un controllo negativo per ogni piastra PCR con acqua come modello per assicurarsi che non vi sia contaminazione.
NOTA: La fase di pre-amplificazione è necessaria solo per l'amplificazione di un tessuto trasdotto complesso. Se amplificando un singolo tumore che presumibilmente si è sviluppato forma una cellula clonale e quindi contiene un solo sgRNA, si può saltare la pre-amplificazione PCR1 e procedere immediatamente con PCR2.
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Representative Results
La figura 1A mostra la progettazione degli oligonucleotidi per il multiplexing di diverse librerie CRISPR personalizzate in modo conveniente in un singolo chip oligo da 12k o 92k. Una volta selezionati gli sgRNA (codificati a colori blu), gli oligonucleotidi sono progettati con siti di restrizione (BsmBI di colore arancione) e coppie di primer PCR specifiche della libreria (codificate a colori verdi). Diverse librerie possono essere progettate utilizzando una combinazione unica di coppie di primer per il multiplexing in un singolo chip oligo. Quando la PCR amplifica le librerie utilizzando una specifica coppia di primer PCR, includere sempre un controllo negativo solo acqua ed eseguire tutte le reazioni su un gel di agarosio. La corsia di controllo negativa non dovrebbe avere bande a 100 bp, mentre la corsia amplificata della libreria dovrebbe avere una singola banda di 100 bp. Se non è disponibile alcuna banda, assicurarsi che la coppia di primer PCR sia selezionata in modo appropriato. La figura 1B mostra la fase di controllo qualità della libreria clonata e la procedura di produzione e concentrazione virale. Si dovrebbe fare attenzione a preservare la rappresentazione paritaria degli sgRNA dalla clonazione alla trasduzione. Le letture di sequenziamento di nuova generazione del DNA amplificato pcr da cellule trasdutte in libreria plasmide e lenti-virale dovrebbero mostrare un'alta correlazione. Qualsiasi deviazione deve essere analizzata attentamente per esaminare se la rappresentazione viene persa prima o dopo la preparazione del lenti-virus. Se lo sgRNA legge dal DNA plasmide non mostra uguale rappresentazione degli sgRNA, la procedura di preparazione e concentrazione virale deve essere ripetuta con cura. Se la perdita di uguale rappresentazione di sgRNA si è verificata nel DNA plasmide, l'intera procedura di clonazione deve essere ripetuta includendo l'amplificazione PCR delle librerie da chip oligo con cicli di amplificazione ridotti. Il successo dello screening della libreria CRISPR dipende in modo critico dalla rappresentazione paritaria degli sgRNA presenti nella libreria.
La figura 2 mostra la microiezione guidata da ultrasuoni impostata per manipolare gli embrioni E9.5 nel topo in gravidanza. L'intero set-up è posto sotto un armadio di classe II di biosicurezza per mantenere le condizioni sterili dell'intera procedura ed evitare qualsiasi infezione del topo incinta a causa delle procedure chirurgiche. Si deve fare attenzione a evitare di pressare le corna uterina durante l'iniezione. L'ago deve essere molto affilato, in modo che la ferita sulla parete uterina e sulla membrana amniotica sia minima.
La figura 3 mostra i risultati dell'iniezione guidata ultra-sonora di lenti-virus che trasporta Cre-ricombinasi in E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Cuccioli di topo Confetti al giorno postnatale (P)0. Il titer virale può essere regolato per ottenere un'adeguata copertura di trasduzione dell'epidermide. Mentre un alto tore di virus si tradurrebbe in una maggiore copertura della pelle del topo, si tradurrebbe anche in una trasduzione di più sgRNA nella stessa cellula potenzialmente confondendo i risultati. Per ridurre le trasduzioni multiple di una singola cellula, il tasso di infezione deve essere mantenuto <20%.
La figura 4 mostra le letture di sequenziamento di nuova generazione del DNA amplificato pcr dalle cellule trasdutte della libreria plasmide e lenti-virale e legge anche da 4 tumori rappresentativi. Le guide sgRNA rivolte ad Adam10 e Ripk4 sono arricchite nei campioni tumorali (triangoli e diamanti) rispetto alla presentazione dello sgRNA in piscina plasmide o cellule infette. Adam10 e Ripk4 funzionano come soppressori di tumori5. Diverse centinaia di tumori possono essere multiplexati assegnando codici a barre unici a ciascun campione e sequenziati in profondità come delineato nel protocollo.
Figura 1: Clonazione della libreria CRISPR mirata. (A) Schema che rappresenta la progettazione di oligonucleotidi per il chip oligo personalizzato da 12 k o 92 k. Su ciascun lato dello sgRNA sono stati aggiunti siti di restrizione BsmBI (o altri siti di restrizione compatibili) (arancione codificato e sottolineato a colori). Le punte delle frecce indicano il sito di taglio BsmBI. Per ogni libreria, è stata aggiunta una coppia unica di primer PCR (codificati a colori verde, marrone e viola), in modo che possa essere specificamente amplificata utilizzando PCR dal chip in pool. Diverse librerie personalizzate possono essere multiplexate fino a oligo 12k o 92k. (B) Grafico che mostra la rappresentazione dello sgRNA da una libreria CRISPR nel DNA plasmide rispetto al DNA proveniente da cellule trasdotto con la stessa libreria lentivirale. Ogni punto rappresenta una guida. La piena rappresentazione è stata mantenuta dopo la trasduzione con una certa correlazione in abbondanza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine dell'insieme di microiniezione guidato da ultrasuoni. (A) Il topo che trasportava embrioni E9.5 è stato anestetizzato e posto su una piattaforma riscaldata con l'utero esposto in una camera a piastre di Petri modificata riempita di PBS (stabilizzata da quattro argilla modellante). La gomma semi-rotonda blu sosteneva l'utero contenente embrioni e l'ago di iniezione del microiniettore è posizionato sul lato destro. La testa di scansione ad ultrasuoni è stata montata sulla parte superiore trasmettendo l'immagine dal vivo al monitor dietro con la testa dell'ago visibile. (B) Immagine ultra-sonora ravvicinata di un embrione E9.5. La biblioteca lentivirale è stata iniettata con l'ago (visto sul lato destro) nella cavità amniotica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Trasduzione riuscita dell'epitelio superficiale nel topo. Immagini fluorescenti di tutto il corpo, cavità orale, lingua e palato di topi Cre-reporter LSL-Confetti appena nati trasdotti con Cre lentivirus (Inlet: corrispondenti immagini a luce bianca). Barre di scala = 500 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sequenziamento profondo dei campioni di tumore. Grafico che mostra la rappresentazione dello sgRNA da una libreria CRISPR nel DNA plasmide rispetto al DNA da cellule trasdotto con la stessa libreria lentivirale e oltre alle letture da 4 tumori rappresentativi. I cerchi rossi e verdi denotano il numero di letture di sgRNA Adam10 e Ripk4 in libreria e cellule trasdutte, mentre il triangolo rosso rappresenta le letture degli sgRNA Adam10 e il diamante verde rappresenta le letture di SgRNA Ripk4 identificate nei tumori da topi HNSCC separati che mostrano un arricchimento della piega 1000x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Primer avanti PCR1 | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC |
| Primer inverso PCR1 | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA |
Tabella 1: Primer per reazione PCR1. I primer avanti e indietro utilizzati per l'amplificazione della regione circostante la cassetta di sgRNA dal DNA genomico delle cellule trasdotto con il virus lenti.
| passo | temperatura | Ore | |
| 1 | 98 °C | 30 secondi | |
| 2 | 98 °C | 10 secondi | |
| 3 | 66 °C | 30 secondi | |
| 4 | 72 °C | 15 secondi | 15 cicli (fase 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | tenere |
Tabella 2: Parametri del ciclo PCR1. Condizioni PCR utilizzate per l'amplificazione della regione circostante la cassetta di sgRNA dal DNA genomico delle cellule trasdotto con il virus lenti.
| 501 FW | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTTTCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG |
||
| 701 Camper | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAAC |
||
| * Le basi sottolineate indicano la posizione del codice a barre Illumina (D501-510 per avanti e D701-712 per il retro) utilizzata per il multiplexing. | |||
| * Le basi di colore rosso indicano la sequenza che si lega al sito bersaglio sul plasmide CRISPR lentivirale. Questa regione può essere modificata in base al vettore lentivirale utilizzato. | |||
Tabella 3: Primer di barcodifica per reazione PCR2. I primer utilizzati per il codice a barre amplificano ogni campione tumorale (direttamente dal DNA genomico o utilizzando i prodotti di PCR1 come modello). L'area sottolineata indica l'area univoca del codice a barre che può essere assegnata per ogni campione per il multiplexing in una reazione di sequenziamento profondo. Le coppie di basi di colore rosso indicano la regione bersaglio nel costrutto lentivirale che questi primer legano. Questa regione bersaglio può essere modificata in base al tipo di costrutto lentivirale utilizzato.
| passo | temperatura | Ore | |
| 1 | 98 °C | 30 secondi | |
| 2 | 98 °C | 10 secondi | |
| 3 | 68 °C | 30 secondi | |
| 4 | 72 °C | 15 secondi | 10 cicli (fase 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | tenere |
Tabella 4: Parametri del ciclo PCR2. Le condizioni PCR utilizzate per il codice a barre amplificano ogni campione tumorale (direttamente dal DNA genomico o utilizzando i prodotti di PCR1 come modello).
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Discussion
L'editing del genoma CRISPR/Cas9 è stato ampiamente utilizzato in studi in vitro e in vivo per studiare le funzioni geniche e i processi cellulari. La maggior parte degli studi in vivo utilizza cellule modificate dal gene CRISPR/Cas9 innestate in un modello animale (allografto o xenograft). Sebbene questo sia un potente strumento per studiare la genetica del cancro e le funzioni cellulari, manca ancora del microambiente dei tessuti nativi e potrebbe provocare ferite e / o risposte immunitarie.
Per superare queste sfide, diversi gruppi sono stati pionieri degli approcci CRISPR diretti in vivo generando diversi modelli di topi autoctoni multiplexati negli ultimianni 15,16,17,18. Questi progetti di solito si basano sul virus adeno-associato (AAV) per fornire sgRNA agli organi bersaglio. AAV consente la generazione di titer molto più elevato facilitando così la produzione di virus a forme elevato necessari per manipolazioni in vivo. Tuttavia, l'uso di AAV limita fortemente il numero di geni che possono essere analizzati a circa 40-50 geni, poiché gli AAV, a differenza del lentivirus, non si integrano stabilmente nel DNA genomico, rendendo impraticabile la lettura delle librerie di sgRNA. Lo screening basato su AAV richiede la lettura diretta delle mutazioni nei siti di destinazione utilizzando, ad esempio, il sequenziamento mirato dell'acquisizione. Tuttavia, il sequenziamento dell'acquisizione basato su PCR multiplexed limita il numero di destinazioni acquisibili in una libreria "schermabile" in genere all'ordinedi decine di dozzine 15,16,17,18.
Rispetto agli schermi CRISPR in vivo AAV, la metodologia qui descritta utilizza sgRNA lentivirali. Dato che i costrutti lentivirali si integrano nel DNA della cellula bersaglio, la rappresentazione dello sgRNA può essere analizzata nel DNA genomico simile a qualsiasi schermo CRISPRconvenzionale 19,20. Pertanto, questa metodologia consente l'analisi simultanea di centinaia di geni e può essere scalata senza soluzione di continuità anche su schermi in vivo a livello genomico. Ad esempio, uno schermo a livello genomico con 78.000 sgRNA e una copertura di 30x richiederebbe ~ 90 embrioni come descritto in precedenza per uno schermo shRNAsimile 4. Poiché le dimensioni dei rifiuti dei ceppi di topi inbred più comuni sono di circa 8-12 cuccioli / cucciolate e un chirurgo esperto può facilmente iniettare tutti i topi all'interno di un po 'più piccolo, solo circa ~ 10-12 dighe e interventi chirurgici sarebbero necessari per uno schermo così a livello genomico.
Il successo di uno schermo in vivo dipende dalla produzione di virus ad alto formicolio. Mentre i costrutti lentivirali che esprimono uno sgRNA di interesse, Cas9 e Cre (ad esempio, pSECC) sono una soluzione all-in-one conveniente e fattibile, hanno il limite di imballaggio per il capsid lentivirale (~ 10 kb in dimensioni totali), portando a un tiziano virale complessivamente più basso. Per superare questa sfida, utilizziamo topi R26-LSL-Cas9-GFP e un costrutto lenti-virale contenente solo Cre-ricombinasi insieme a uno sgRNA. Il costrutto lentivirale risultante ha una lunghezza di soli 7 kb e produce un carattere virale superiore a 108 PFU/mL.
Biblioteche mirate e specifiche possono essere generate rapidamente in pochi giorni e la complessa rete di interazioni genetiche può essere studiata in vivo in poche settimane. La mutagenesi mediata da Cas9 può essere eseguita sia in topi di tipo selvatico per studiare lo sviluppo di organi, omeostasi o fenotipi di malattia (cancro, malattie infiammatorie della pelle, ecc.) o può essere facilmente combinata con topi che ospitano mutazioni oncogeniche o combinazioni di mutazioni per modellare lo stato genetico trovato nei pazienti umani. Inoltre, la metodologia di clonazione può essere perfezionata per clonare librerie CRISPRa o CRISPRi aggiungendo siti di restrizione compatibili e sequenze di sgRNA in plasmide all-in-one. Da notare che tutte le librerie che manipolano le funzioni geniche possono essere utilizzate non solo nei modelli di topo ma anche in altri modelli animali e nelle colture organoidi. Insieme, questa metodologia evidenzia l'utilità e fornisce un boilerplate per utilizzare CRISPR in vivo diretto per integrare l'editing genico somatico e la modellazione del topo per valutare rapidamente la funzione genica in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di progetto del Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), della Krembil Foundation e dell'Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan è il destinatario di una borsa di studio della Canadian Cancer Society (BC-F-16#31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
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